Abstract

miRNAs têm sido propostos para ser reguladores-chave da progressão e metástase do câncer. No entanto, a compreensão de suas funções e mecanismos moleculares são necessárias para fornecer uma percepção mais profunda para melhores oportunidades terapêuticas. Neste estudo, nós investigamos o papel eo mecanismo de miR-493 no desenvolvimento e progressão do câncer de pulmão de células nonsmall (NSCLC). Os nossos dados indicam que a expressão de miR-493 foi marcadamente reduzida em carcinoma pulmonar. A expressão ectópica de crescimento celular deficiente miR-493 e invasão in vitro e in vivo. Mecanicamente, o miR-493 orientada geralmente directamente E2F1, o que resultou numa redução forte da expressão de ARNm e proteína. Este efeito, por sua vez, diminui o crescimento, invasão e metástase de células do cancro do pulmão. Nossos resultados destacam a importância da disfunção miR-493 na promoção da progressão do tumor, e implicam miR-493 como um potencial alvo terapêutico no cancro do pulmão

Citation:. Gu Y, Cheng Y, Song Y, Z Zhang, Deng H, Wang C, et ai. (2014) MicroRNA-493 suprime o crescimento tumoral, invasão e metástase do câncer de pulmão através da regulação E2F1. PLoS ONE 9 (8): e102602. doi: 10.1371 /journal.pone.0102602

editor: Rana Pratap Singh, Jawaharlal Nehru University, Índia |

Recebido: 28 Março, 2014; Aceito: 19 de junho de 2014; Publicação: 08 de agosto de 2014

Direitos de autor: © 2014 Gu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. O estudo foi financiado por doações da China de Pós-Doutorado Science Foundation (Código do projeto: 2012M521588), https://jj.chinapostdoctor.org .cn /V1 /Program1 /Default.aspx. O financiador não teve nenhum papel no desenho do estudo, recolha e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o cancro do pulmão é a mais prevalente subtipo de câncer histológico em todo o mundo [1]. Porque a maioria dos pacientes apresentam com doença invasiva, metastático [2], compreender a base da progressão do câncer de pulmão é vital. Muitos fatores, incluindo supressores tumorais e oncogenes, estão envolvidos na tumorigênese pulmonar ou progressão. [3], [4]. Recentemente, os membros clássicas de genes codificantes de proteínas foram expandidas para incluir um tipo de molécula de ARN não codificante-proteína conhecida como microARN (miARN) [5], [6], [7]. miARNs são 19-24 nucleótidos de comprimento, e em que regulam a expressão do gene através de emparelhamento de bases com sequências complementares imperfeita localizados principalmente, mas não exclusivamente, nas regiões não traduzidas a 3 ‘(UTRs) de mRNAs alvo. Assim, miARNs representam uma das principais famílias de regulação de genes em células eucarióticas, e eles funcionam através da indução de translação e transcrição repressão degradação [8], [9]. provas emergindo rapidamente sugere fortemente que miRNAs desempenham um papel crucial na tumorigênese e progressão [10], [11], [12]. Por exemplo, miR-34 teria evita a iniciação e progressão do cancro no adenocarcinoma pulmonar [13]. miARN-218, um novo regulador de HMGB1, alegadamente inibe a migração celular e invasão de cancro do pulmão de células não pequenas [14]. No entanto, é necessário aprofundar o conhecimento dos mecanismos moleculares de miRNA para fornecer informações mais detalhadas para desenvolver melhores oportunidades terapêuticas para pacientes com câncer de pulmão.

Em nosso estudo recente (Chen, et, al. Artigo não publicado), foi utilizado um microarray de miARN para encontrar que a expressão de miR-493 foi marcadamente reduzida em células 95D, uma linha celular de cancro do pulmão altamente metastático, em comparação com HBE, uma linha celular imortalizada humana epiteliais brônquicas. Assim, temos a hipótese de que o miR-493 pode desempenhar um importante papel na tumorigénese e na progressão do cancro do pulmão.

Para testar esta hipótese, foi examinada a expressão de miR-493 utilizando qRT-PCR em linhas celulares de cancro do pulmão e 6 65 tecido de câncer de pulmão espécimes no presente estudo. Os dados mostraram que a expressão de miR-493 foi marcadamente reduzida em células de cancro do pulmão e tecidos. Funcional in vitro e in vivo em ensaios indicaram que o miR-493 inibiu a proliferação de células de cancro do pulmão, invasão e metástase de direccionamento directamente o 3′-UTR de E2F1 para eliciar um knockdown específica e robusta da proteína. Nossos resultados destacam a importância da disfunção miR-493 na promoção da progressão tumoral e tumorigênese; e implicam miR-493 como um potencial alvo terapêutico no cancro do pulmão.

Resultados

miR-493 é regulada negativamente no cancro do pulmão e negativamente associados à sobrevida

Para identificar a desregulação de miARN-493 no cancro do pulmão, foi examinada a expressão de miR-493 usando PCR em tempo real em linhas celulares derivadas a partir de 6 cancro do pulmão e uma linha de fibroblastos de pulmão (MRC5); , bem como uma célula imortalizada humana epiteliais brônquicas (HBE). Os dados indicaram que o miR-493 de expressão foi significativamente reduzida em células de cancro do pulmão, especialmente na 95D, uma altamente metastático linha celular de cancro do pulmão (Figura 1A). Além disso, foram comparados os níveis de expressão de miRNA-493 em 65 tecidos de câncer de pulmão frescos por PCR em tempo real. Do mesmo modo, a expressão de miR-493 foi significativamente menor em tecidos de cancro do pulmão que nos correspondentes tecidos pulmonares normais (figura 1B). Para determinar se a regulação negativa de miR-493 impactos os fenótipos de cancro de pulmão ou de características patológicas clínicas, que empregue uma análise da correlação e constatou que o nível de expressão de miR-493 foi inversamente correlacionada com a metástase do tumor (p = 0,038), mas não outros parâmetros patológicos tais como a fase clínica (tabela 1). Além disso, uma análise de sobrevivência de Kaplan-Meier foi realizado utilizando a sobrevida do paciente global (OS, figura 1C) e sobrevida livre de doença (DFS; figura 1D) para analisar o significado do miR-493 ainda mais em termos de prognóstico clínico. Os resultados mostraram que os pacientes com baixa expressão de miR-493 teve um mais curto OS médios e DFS do que pacientes com alta expressão de miR-493 (p = 0,006 para OS, P = 0,000 para DFS; Figura 1C e D). Estes dados sugerem que a regulação negativa de miR-493 contribui para a carcinogénese e prognóstico do cancro do pulmão.

(A) Os níveis de expressão relativos de miR-493 em linhas celulares derivadas a partir de 6 cancro do pulmão e da linha de fibroblastos de pulmão (um MRC5 ), bem como uma célula epitelial brônquica humanas imortalizadas (HBE) foram determinados por qRT-PCR. Os dados são apresentados como médias ± SEM de pelo menos 3 experiências separadas * p . 0,05, ** p 0,01. (B) Os miR-493 em níveis de expressão de 65 emparelhado NSLCC humana e correspondentes tecidos normais foram examinados por PCR em tempo real, utilizando GAPDH como um controlo interno. O valor da expressão (ΔCt (N) – ΔCt (t)) representa a diferença de em os níveis de miR-493 entre o tecido normal e tumoral. Um valor expressão 1 indica que os níveis de miR-493 é aumentada em tumores. Um valor expressão 1 indica que os níveis de miR-493 é diminuída em tumores. Um teste t pareado (univariada) foi utilizado para comparar a diferença de entre o grupo normal e grupo do cancro. (C) Os baixos níveis de miR-493 está correlacionada com menor sobrevida. As curvas OS e DFS para todos os pacientes estudados com alta ou lowmiR-493 expressão.

A superexpressão de miR-493 prejudica a proliferação celular e invasão

Para avaliar os efeitos biológicos da superexpressão de miR-493 em células de câncer de pulmão, subpopulações de células sobre-expressão ectópica estáveis ​​95D /miR-493 e suas células de controlo correspondentes H1975 /miR-493 e foram construídos. Uma análise de qRT-PCR mostrou que a transfecção foram bem sucedidos (figura 2A). Determinou-se que a sobre-expressão de miR-493 em células 95D e H1975 marcadamente prejudicada a proliferação celular em comparação com os controlos utilizando um ensaio de taxa de crescimento celular (Figura 2B), a distribuição do ciclo celular (Figura 2C) e um ensaio de formação de colónias (Figura 2D) . Além disso, testou-se o miR-493 poderia desempenhar um papel no crescimento do tumor usando modelos de xenotransplante de ratinhos nus (seis ratinhos por grupo). 95D células transfectadas quer com miR-493 ou um controlo scrambled foram transplantadas em ratinhos nus e desenvolveu-se em tumores sólidos em 25 dias. No entanto, o crescimento do tumor foi significativamente reduzido quando o miR-493 foi expressa de forma estável em células 95D (Figura 2E). Estes resultados implicaram que o miR-493 pode suprimir fortemente o crescimento de células tumorais.

A, a sobre-expressão ectópica estável de miR-493 foi gerada em subpopulações de células 95D /miR-493 e H1975 /miR-493. qRT-PCR foi utilizado para verificar a transfecção. ** Significa P 0,001 (teste t). B, as curvas de crescimento demonstrou que as células de pulmão foram capazes de proliferação. As células foram semeadas em placas de 12 cavidades à razão da concentração de células desejadas e mantidas em meio contendo 10% de FBS. O valor de absorção de células foi medida nos pontos de tempo indicados, em triplicado, e as suas taxas de crescimento foram registados. * Significa P 0,05 (teste t). C, a distribuição do ciclo celular de células de câncer de pulmão foi analisada com um citómetro de fluxo FACScan. O índice de proliferação (PI) foi usado para descrever o potencial de proliferação de células. PI = fracção S G2 +) /(G1 + G2 + S) x 100%. Esquerda, a imagem representativa do ciclo celular percentual mudança. Direita, a análise estatística da percentagem do ciclo celular, os dados são apresentados como média ± EPM de 3 experiências independentes * significa P 0,05 (teste t). D, ensaios de formação de colónias foram usadas para determinar o efeito de miR-493 sobre a sobrevivência celular a longo prazo. Esquerda, a área coberta em cada placa por as colónias foi medida utilizando um sistema de imagem e representados como a percentagem da área total da chapa. Direita, o efeito de sobre-expressão de miR-493 na formação de colónias de células de cancro do pulmão: cada coluna representa a média de experiências em triplicado em cada grupo. Os dados são média ± SEM. * Significa P 0,05 (teste t). E, o miR-493 inibiu o crescimento tumoral pulmonar em modelos de xenoenxerto de ratinho (12 animais). Esquerda, tumores representativos isoladas a partir de ratinhos 25 dias após a injecção subcutânea de células 95D que foram estavelmente transfectadas com o vector de miR-493 que expressam ou controlo. Direita, dados são a média ± SEM. * P . 0,05, (teste t)

Em adição à inibição do crescimento de células, o efeito de miR-493 na invasão tumoral e metástase foi também tratado neste estudo. Um ensaio de cicatrização da ferida mostraram que o miR-493 poderia suprimir dramaticamente a mobilidade de células tumorais in 95D células em comparação com as células transfectadas com vector vazio (Figura 3A). Além disso, um ensaio de invasão foi também realizada. O resultado demonstrou que o miR-493 poderia suprimir a capacidade invasiva de células de cancro de pulmão (Figura 3B). Um modelo animal experimental foi utilizada para investigar o efeito supressor de miR-493 em metástase de tumor, as células 95D /miR-493 foram injectadas na veia da cauda de ratos sem pêlo (cinco ratinhos por grupo). (95D /controle) células vazias transfectadas com vector foram utilizados como controle. Os ratinhos foram mortos e os pulmões foram retirados, e as lesões metastáticas do pulmão foram então detectadas usando um pequeno Imaging System animal Bruker (Alemanha), após 28 dias. Os campos de formação de lesões metastáticas no pulmão foi significativamente reduzido em comparação com o grupo de controlo (Figura 3C). Apesar de nódulos metastáticos visíveis não foram observadas na superfície do pulmão, as lesões metastáticas foram detectados no pulmão por hematoxilina e eosina (figura 4D). Estes resultados indicaram que o miR-493 poderia suprimir eficazmente a metástase do tumor in vitro e in vivo.

a, ensaios de ferida scratch 95D foram conduzidos em células transfectadas com o miR-493 e o seu controlo emparelhado. Os resultados a partir de 3 ensaios separados-se a média em conjunto e representadas graficamente. *, P 0,05 (à esquerda). Imagens representativas dos ensaios são mostrados. ampliação original: × 200 (direita). B, as propriedades invasivas de H1975 e 95D células foram analisados ​​com um ensaio Transwell usando uma câmara de Matrigel-revestido. células migradas foram representados como o número médio de células por campo de visão a partir de 3 experiências diferentes, tal como descrito nos Materiais e Métodos. * P 0,01 (à esquerda). Imagens representativas dos ensaios são mostrados. ampliação original: × 200 (direita). C, Ensaios In Vivo metástases foram utilizados para examinar a capacidade metastática pulmonar de células 95D /miR-493 marcadas com proteína fluorescente verde (GFP) e a sua célula de controlo emparelhado 95D /controlo. células de cancro de pulmão foram injectados na veia da cauda de cinco ratos velhos-de-semana. No dia-28, todos os animais foram sacrificados e os pulmões foram excisadas. As imagens metástase pulmonar foram obtidos com um sistema de imagem animal Bruker pequeno. O tecido de pulmão foi, em seguida, removidos, fixados, embebidos em parafina, seccionados e sujeitos a hematoxilina e eosina (H E) de coloração. À esquerda, Representação do sinal de GFP detectada em cada um dos cinco animais (as imagens foram sobrepostas com fluorescência verde e luz branca). Certo, O campo e fluorescência metastático intensidade diferiram significativamente entre o grupo de 95D /miR-493 e o grupo controle. D, exame histológico de metástases pulmonares de células 95D /controle 95D /miR-493 e pela hematoxilina e eosina.

A, Alinhamento de sequências de microRNAs do miR-493 e E2F1 3′- UTR. A E2F1 3′-UTR contém uma previu site de miR-493 de ligação. As regiões de sementes dos locais de reconhecimento de sementes no E2F1 3′-UTR miR-493 e são indicados em vermelho. B e C, o ensaio de luciferase de células 95D (lado esquerdo) e células H1975 (lado direito), que foram co-transfectadas com o miR-493 e um repórter da luciferase contendo o comprimento total E2F1 3′-UTR (Luc-WT ) ou um mutante (Mut-Luc), em que os nucleótidos do local de miR-493 de ligação foram mutados. Uma construção repórter de luciferase vazio foi utilizado como um controlo negativo (Luc-ctrl). As actividades de luciferase foram medidas 48 horas após a transfecção. miR-493 marcadamente suprimida a actividade de luciferase em construções repórter Luc-wt. Os dados são as médias ± S.E.M. para transfecções independentes (n = 4). * P 0,05 em relação corrida. D e E, o miR-493 transfecção estável reduz a proteína E2F1 e os níveis de mRNA. F e G, o nível de miR-493 inversamente correlacionada com a expressão E2F1. F, os níveis de expressão E2F1 foram medidos por imuno-histoquímica em tecidos de tumor. Estes tecidos espécimes embebidos em parafina foram os mesmos fonte de tecido de cancro de pulmão 65fresh acima mencionado na figura 1. Uma imagem representativa dos níveis de expressão de E2F1 em tecidos de tumor de pulmão humano (200 ×) é mostrado. L, os dados são médias ± S.E.M. * Significa P . 0,05

miR-493 directamente metas e inibe E2F1

Com base na observação de que o miR-493 afeta a proliferação celular, invasão e metástase, temos procurado por genes-alvo de miR-493 relacionadas com a motilidade e migração usando o algoritmo de varredura dois alvo (TargetScan e microRNA.org). Um grande número de diferentes genes alvo foram previstos. Entre estes genes alvo candidato, E2F1 foi seleccionado para posterior validação experimental, não só porque foi identificado como alvo de miR-493 por ambos os bancos de dados (Figura 4A), mas também devido à sua desregulamentação frequente em tecidos tumorais [15], [16 ], [17]. Uma análise de luciferase dupla repórter mostraram que a co-expressão de miR-493 inibiu significativamente a actividade da luciferase do pirilampo que realizado de tipo selvagem mas não mutante 3′-UTR de E2F1 (Figura 4B, C) em células 95D e H1975, indicando que miR-493 pode suprimir a expressão do gene através da sua sequência de ligação à 3’UTR do E2F1. Além disso, a introdução de miR-493 diminuiu a expressão de ARNm e proteína E2F1 celular (Figura 4D, E). No entanto, quando inibir oligonucleótidos contra o miR-493 foram transfectadas em células de cancro de pulmão ou 95D H1975, não foi observado um padrão de expressão inversa entre o miR-493 e E2F1 proteína (dados não apresentados). Presume-se que este tratamento miARN contribuiu para a expressão endógena mínima em ambas as células de cancro do pulmão. Além disso, o fenómeno foi ainda validado por uma correlação inversa entre o nível de proteína E2F1, indicada por uma coloração imuno-histoquímica, e o nível de expressão de miR-493 avaliada por Q-PCR nos tecidos de cancro do pulmão frescas utilizadas nas análises anteriores (figura 4F , G e figura 1B).

E2F1 contribui para o efeito de proliferação de Repressão e invasão induzida por miR-493

além disso, construímos fragmentos siRNA segmentação E2F1 para derrubar a expressão de E2F1 para investigar a contribuição de E2F1 para o efeito de miR-493 sobre estes fenótipos. Descobrimos que o E2F1 knockdown pode, em parte simulação, o crescimento das células (Figura 5 B) e a invasão de células (Figura 5C e D) fenótipo induzida pela sobre-expressão de miR-493. Subsequentemente, as experiências de socorro foram realizadas por sobre-expressam o vector de E2F1-Δ3′- UTR (sem um endógena 3′-UTR) na célula que expressa o miR-493. A supressão induzida miR-493 de E2F1 foi resgatado mediante a introdução de E2F1. Além disso, a sobre-expressão de E2F1 atenuou a inibição do crescimento celular (Figura 5A) e invasão (Figura 5C e E) causada por miR-493. Estas observações sugerem que o miR-493 tem como alvo especificamente E2F1 especificidade para contribuir para o efeito sobre o crescimento de células e invasão.

A, A knock-down de E2F1 parcialmente simulada do pulmão supressão células cancerosas de crescimento induzida pela sobre-expressão de miR-493 em células 95D e H1975. As curvas de crescimento demonstrou a capacidade de proliferação de células do pulmão. O valor de absorção de células foi medida nos pontos de tempo indicados, em triplicado, e as suas taxas de crescimento foram registados. B, a sobreexpressão de E2F1 exógena (sem 3′-UTR de E2F1) resgatado mediante a supressão da proliferação induzida por miR-493 em células 95D e H1975. C, T As propriedades invasivas de H1975 e 95D células que eram ou knock-down ou superexpressão de E2F1were analisada com um ensaio transpoço usando uma câmara de Matrigel-revestidas. As células migradas foram representados como o número médio de células por campo de visão a partir de 3 experiências diferentes, tal como descrito nos Materiais e Métodos. Os dados são a média ± SD * significa p . 0.05. D e E, as imagens representativas dos ensaios são mostrados. ampliação original:. × 200

regulamentos E2F1 via ERK e PI3K-AKT em 95D e H1975 células

E2F1 desempenha um papel fundamental na progressão do ciclo celular, que por sua vez promove células proliferação e metástase. No entanto, o mecanismo preciso de E2F1 função é complexa e depende do contexto celular [18]. Um estudo recente indicou que a progressão do tumor dependente de E2F1 foi desencadeada pela activação das cascatas de sinalização de Ras /Raf citoplasmáticos, tais como as vias de PI3K-AKT [16] e MEK-ERK [19], a maioria dos quais regulam a proliferação celular, sobrevivência e invasão [20], [21]. Assim, investigamos t se miR-493 regula estas vias alvejando E2F1. A sobre-regulação de miR-493, através da transfecção de miR-493, em células 95D e H1975 diminuiu os níveis de fosforilação de AKT e seu alvo a jusante GSK3β (figura 6A). Da mesma forma, o miR-493 também suprimiu os níveis de ERK fosforilada (figura 6A). Observamos também que o knockdown de miR-493 através de transfecção com anticorpos anti-miR-493 na HBE, A549 e células H1299, em que o nível de expressão relativa de miR-493 era mais elevada, o aumento dos níveis de AKT fosforilado, GSK3b e ERK ( A figura 6B). Estes resultados de transferência de Western demonstrou que o miR-493 é regulador negativo do AKT e ERK. Subsequentemente, as experiências de socorro foram realizadas por sobre-expressam o vector de E2F1-Δ3′- UTR (sem um endógena 3′-UTR) em células tratadas com miR-493. A regulação negativa induzida pelo miR-493 de E2F1 foi resgatado mediante a introdução de E2F1 (Figura 6C), e os níveis de fosforilação da Akt e ERK foram alterados de uma forma semelhante. Estas observações sugerem que o miR-493 inibe a AKT e ERK pela segmentação E2F1.

(A) o miR-493 reduziu a actividade superexpressão do AKT e ERK em células H1975 e 95D. (B) o knockdown de miR-493 por com anti-miR- 493 aumentou a actividade de AKT e sinalização ERK na HBE, A549 e células H1299. (C) miR-493 (ou controle de corrida) transfecção seguido por E2F1 (ou vector simulado) transfecção de 24 horas depois, em 95D células afeta AKT e ERK sinalização. A actividade de Akt foi medida através da análise da expressão de AKT fosforilado (pAKT), enquanto que a actividade da via EKR foi medida por análise de expressão de ERK fosforilada (pERK).

Discussão

embora um punhado de estudos identificaram miRNAs específicos envolvidos na tumorigênese humana e progressão [10], [11], [12]. Acreditamos também mais esforço deve ser feito para identificar miRNAs relevantes, bem como os mecanismos específicos pelos quais eles realizam suas funções específicas, em particular no que respeita à oncogênese e progressão de diferentes tipos de tumores. Aqui, identifica-se que o miR-493, um potencial supressor de tumor candidato miARN [22], [23], foi marcadamente reduzida em cancro do pulmão e que menor expressão de miR-493 foi associado com a metástase do tumor e prognóstico pobre (figura 1C, D e Tabela 1). A expressão ectópica de miR-493 marcadamente atenuada a capacidade das células para proliferar e invadem em células de cancro do pulmão H1975 95D e in vitro e in vivo.

Até à data, a caracterização de miR-493 função não foi grande , apesar de vários alvos foram identificados com um papel chave na migração celular e metástase vias, incluindo FZD4, RhoC, MKK7 e IGF1R [22], [23], [24]. Aqui, nós identificamos um novo alvo de miR-493, E2F1. E2F1 é um factor de transcrição importante que desempenha um papel fundamental na progressão do ciclo celular e é fortemente regulada pela proteína do retinoblastoma (Rb) [25]. A inactivação da Rb liberta E2F1 do complexo supressor, que, por sua vez, induz a expressão de genes alvo contínua cujos produtos promover a progressão do ciclo celular [26]. A expressão ectópica de resultados E2F1 na transformação neoplásica de células de roedores [27], [28], e os resultados de modelos transgénicos indicam que o aumento da actividade E2F1 está associada com o desenvolvimento do tumor em vários tecidos [29], [30], [31] . Anormalidades na expressão do gene E2F1 e /ou amplificação do gene E2F1 têm sido descritos em várias linhas celulares de cancro e tipos de tumor, incluindo cancro do pulmão [32], [33]. De nota, a superexpressão de E2F1 está frequentemente associado a tumores de alto grau e mau prognóstico sobrevida do paciente [29], [31], [34], sugerindo que suas propriedades oncogênicas estender para além da capacidade de estimular o crescimento aberrante de células neoplásicas. Consistente com estes resultados, a evidência mais recente descobriu que E2F1 é mais relevante para metástase e chemoresistance [18] câncer, [19], [35]. Aqui, mostramos que a expressão de E2F1 é elevada no cancro do pulmão. Enquanto isso, determinamos que miR-493 directamente metas e inibe a expressão E2F1protein. Uma análise repórter luciferase dupla indicou que o miR-493 poderia ligar-se à sequência na extremidade 3 ‘UTR de E2F1 (figura 4B). Além disso, a introdução de miR-493 diminuiu a expressão de ARNm e proteína E2F1 celular (Figura 5C, D) .Whereas, quando inibir oligonucleótidos contra o miR-493 foi foram transfectados em HBE, A549 e células H1277, um padrão de expressão foi inversa observada entre o miR-493 e E2F1 proteína (Figura 6 B). Porque E2F1 desempenha um papel significativo na regulação da proliferação celular, sobrevivência e invasão, nós investigamos se E2F1 contribui para o efeito de miR-493 sobre estes fenótipos de células de cancro do pulmão. Foram construídos fragmentos de siRNA alvejando E2F1 para derrubar a expressão de E2F1, e descobriram que o knock-down de E2F1 pode, em parte simular o crescimento celular (Figura 5 A) e a invasão de células (figura 5 D, E) fenótipo induzida pela sobre-expressão de miR-493. Além disso, a sobre-expressão de E2F1 (sem um endógena 3’-UTR) resgatou a inibição do crescimento celular e invasão causada por miR-493 (figura 5B, D e E).

Um estudo recente indicou que E2F1- a progressão do tumor foi dependente mediada pela activação das cascatas citoplasmáticos Ras /Raf sinalização [19], como o MEK-ERK e PI3K /AKT, a maioria dos quais regulam a proliferação celular, sobrevivência e invasão. Neste estudo mostramos que o miR-493 pode inibir a actividade constitutiva da Akt e ERK vias alvejando E2F1. Subsequentemente, as experiências de salvamento indicou que a regulação negativa induzida pelo miR-493 de E2F1 foi resgatado mediante a introdução de E2F1 (figura 3B), e os níveis de fosforilação da Akt e ERK foram alterados de uma forma semelhante. Estas observações sugerem que o miR-493 inibe as vias de AKT e ERK pela segmentação E2F1.

Tomados em conjunto, os dados obtidos no nosso estudo sugere que o miR-493 pode ser um potencial miARN supressora de tumor que inibe a invasão de células e proliferação de bloqueando E2F1 no cancro do pulmão, e, posteriormente, suprime a AKT jusante e vias de sinalização ERK, para controlar a proliferação celular, invasão e tumorigênese. No entanto, estudos futuros terão de detectar mais alvos candidatos em tipos de câncer adicionais para esclarecer completamente a função de miR-493 na tumorigênese.

Materiais e Métodos

As linhas celulares e cultura

pulmão humano de linhas celulares de cancro (H1975, A549, H1299, H446), MRC5, uma linha diplóide humano normal de células de fibroblastos de pulmão, e imortalizadas de células epiteliais brônquicas humanas HBE foram obtidos a partir de e mantidos como recomendado pela American Type Culture Collection ( ATCC, Manassas, VA, EUA) .A linha de células de cancro do pulmão humano 95D foi obtido a partir do celular Banco da Academia chinesa de Ciências (Xangai, China). O H1975, A549, H1299, H446, HBE e 95D células foram mantidas em meio RPMI-1640 (Hyclone, EUA), suplementado com soro fetal bovino a 10% (FBS; Hyclone, EUA). As células MRC5 foram mantidas em meio DMEM (Hyclone, EUA), suplementado com 10% de soro fetal de bovino. (FBS; Hyclone, EUA) .As células foram incubadas numa atmosfera de 5% de CO2 a 37 ° C

as amostras dos pacientes

Todas as amostras de tecido foram recolhidas através de ressecção cirúrgica de pacientes diagnosticados entre março de 2009 e março de 2012, o Affiliated Tumor Hospital da Universidade de Medicina de Cantão (Guangzhou, Guangdong, China). consentimento informado por escrito foi obtido de todos os participantes do estudo. O protocolo do estudo foi aprovado pelo Comitê de University Medical GuangZhou Ética.

transcriptase reversa (RT)-PCR e qRT-PCR

O RNA total foi extraído a partir de células ou tecidos utilizando o reagente Trizol ( Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA), e as reacções RT foram realizadas utilizando um iniciador específico de miR-493. Os primers haste-laço RT específicas para miR-493 e U6 foram adquiridos de Ribobio co., Ltd (Guangzhou, China). As sequências dos iniciadores de E2F1 foram definidas como se segue: Iniciador directo: 5′-CCCATCCCAGGAGGTCACTT-3 ‘; Iniciador inverso: 5-CTGCAGGCTCACTGCTCTC-3 ‘. As sequências dos iniciadores de GAPDH foram definidas como se segue: Iniciador directo: 5’-CCACATCGCTCAGACACCAT-3 ‘; Iniciador inverso: 5’-TGACAAGCTTCCCGTTCTCA-3 ‘. PCR em tempo real foi realizado utilizando um protocolo padrão para o kit de SYBR Green PCR (Toyobo, Osaka, Japão). U6 e GAPDH foram utilizados como referências para os miARNs e ARNm, respectivamente. A

-ΔΔCt método 2 foi utilizado para determinar as quantidades relativas de expressão do gene. Cada amostra foi analisada em triplicado.

análise Western blot

A concentração de proteína nos lisados ​​foi medida com o BCA Protein Assay Kit (Bio-Rad), e 30 ug de proteína misturada com 2 × SDS tampão de carga foi carregada por pista. As proteínas nos lisados ​​foram separados por 10% SDS-PAGE e transferidas para membranas de difluoreto de polivinilideno (Millipore). Em seguida, as membranas foram incubadas durante 12 horas a 4 ° C com um anti-soro contendo anticorpos contra E2F1, p-ERK, andβ-actina adquirido a Cell Signaling Technology, Akt, P-Akt, GSK3β e p-GSK3β e ERK adquiridos a Sigma Tecnologia -Aldrich. Um anticorpo secundário conjugado com peroxidase e reagentes de detecção de mancha Western ECL foram usadas para visualisethe proteínas alvo (ECL New England Biolabs), que foram quantificadas com um Bio Imagem Quantifier inteligente 1-D (Versão 2.2.1, Nihon-BioImage Ltd.). Um anticorpo anti-β actina foi usado como um controle de carga de proteína.

Imunohistoquímica

As lâminas de tecido incluiu 65 amostras de pulmão primário e correspondentes tecidos normais epiteliais do pulmão. A imuno-histoquímica foi realizada em tecido embebido em parafina e fixado em formalina, utilizando o anticorpo anti-E2F1 (tecnologia de sinalização celular) e o método de coloração de peroxidase de estreptavidina-padrão (kits de detecção biotina-estreptavidina (ABC), IHC Abcam Inc, EUA). Imuno-histoquímica resultados foram pontuados de acordo com a intensidade (0-4) e a percentagem de células positivas para marcar 0: sem coloração; 1: 10% de células positivas; 2: 11-50% de células positivas; 3: 51-75% de células positivas; 4: 0,75% expressão relativa positiva cells.The foi obtida multiplicando a intensidade pela percentagem

repórter luciferase ensaio

A pmirGLO Dual-Luciferase miRNA vetor de expressão alvo foi utilizado para a 3. ‘-UTR ensaios de luciferase (Promega). Os genes alvo de miRNA-493 foram selecionados com base nos algoritmos de digitalização alvo [microRNA.org (https://www.microrna.org/microrna/home.do) e TargetScan (https://www.targetscan.org/) ]. As sequências dos iniciadores utilizados foram definidas como se segue: iniciador directo E2F1: GCCTCGAGGAGATGCTCACCTTGTCTCTG, o iniciador inverso: CTAGCGGCCGCTGGATCTGCTTTTGAGTT. E2F1 mutante iniciador directo: GAGGTGAGTGGGG

ACAAGG

CTGATGTGGGCAGGAGGGGTG, mutante E2F1 inverte primário: CCTGCCCACATCAGCCTTGTCCCCACTCACCTCTCCCATCTC. Negrito indica o XhoI (CTCGAG) e sublinhado indica o site interno NotI. Itálico (wild: GACCTTCA, mutante: ACAAGG) indica a sequência alvo. Para o ensaio de luciferase de 3′-UTR, células 293T foram co-transfectadas com HSA-miR-493 e pmirGLO Dual-Luciferase miARN alvo vectores de expressão com o tipo selvagem ou a sequência alvo mutante utilizando o ensaio de luciferase de Lipofectamine 2000. O sido realizada utilizando o Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega) 48 horas após a transfecção. Os dados são apresentados como o valor médio ± desvio padrão para ensaios em triplicado e comparados com o nível de vectores sequência do tipo selvagem obtidos no tipo mutante sequência do vector de células transfectadas que são normalizados para 100%.

produção e infecção por lentivírus

Para construir um vector que expressa o miR-493, a sequência de precursor de miR-493 (MI0003132) foi sintetizado, recozido e, em seguida, inserido no fragmento BamHI-HindIII do vector PGCI-L3 (GeneCopoeia, Inc., Rockville, MD EUA) .Os lentivírus plasmídeos foram co-transfectadas com pLP1, PLP2, e PLP /VSVG (GeneCopoeia, Inc., Rockville, MD EUA) em células 293T (Invitrogen), e os sobrenadantes contendo vírus foram preparados de acordo com as instruções do fabricante. Para infecção por lentivírus, as células foram incubadas com os sobrenadantes contendo vírus, na presença de 6 ug /mL de polibreno. As células infectadas foram seleccionadas na presença de 2 ug /ml de puromicina para gerar duas linhas monoclonais estáveis ​​emparelhados de células (uma linha celular estável expressando o miR-493, 95D-miR-493, H1975-miR-493 e a sua linha de células estável de controlo, 95D -control ou controlo H1975-).