Abstract

Fundo Visa

alvo atual do tratamento para câncer colorretal avançado está voltada principalmente para o receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR) de sinalização, mas os seus efeitos aditivos com quimioterapia ainda são limitados. Proteína Adam (ADAM) cliva o factor de crescimento epidérmico de ligação proheparin como factor de crescimento (proHB-EGF). E solúvel HB-EGF activa EGFR. Em paralelo, o fragmento carboxi-terminal de proHB-EGF (HB-EGF-CTF) transloca-se para a membrana nuclear interna, e, subsequentemente, exerce sobre a regulação da proliferação celular através da ligação de proteínas nucleares promielocítica dedo leucemia zinco (PLZF), um repressor transcricional , causando assim a sua exportação nuclear. Nossa hipótese é que a inibição da translocação nuclear HB-EGF-CTF pode ser uma nova estratégia na prevenção da proliferação celular.

Métodos

12

O-

tetradecanoylphorbor-13- acetato (TPA), foi tratada para activar ADAM. Nove mil compostos químicos foram rastreados para as suas eficácias em bloquear a ligação de HB-EGF-CTF de dedo de zinco de leucemia promielocítica (PLZF) com sistema Alphascreen. Os candidatos obtidos foram, em seguida, utilizado para bloquear a ligação de HB-EGF-CTF para PLZF em células de cancro do cólon, HCT 116 e HT29. A proliferação celular foi investigada com um ensaio de curva de crescimento. A localização intracelular e associação entre HB-EGF-CTF e PLZF, foi avaliada com coloração de imunofluorescência, e imunoprecipitação e Western blot, respectivamente. Os efeitos de candidatos obtidos na fosforilação de EGFR e sobre a translocação nuclear de HB-EGF-CTF e exportação de PLZF durante o receptor tipo 1 da angiotensina II (AT1R) knockdown também foram investigados.

Resultados

O telmisartan e candesartan foram encontrados para ser potenciais candidatos. Telmisartan inibiu a proliferação celular induzida por TPA mais forte do que o candesartan. Telmisartan, mas não candesartan bloqueou a translocação nuclear de HB-EGF-CTF, e ligação de HB-EGF-CTF para PLZF, durante a estimulação TPA. Ambos telmisartan e candesartan não inibiu a fosforilação induzida por TPA EGFR, e telmisartan, mas não candesartan, inibiu TPA-induzida translocação nuclear de HB-EGF-CTF após knockdown de AT1R.

Conclusões

a inibição da translocação nuclear de HB-EGF-CTF com telmisartan pode ser uma nova estratégia na prevenção da proliferação de células

citação:. Ozeki K, Tanida S, Morimoto C, Inoue Y, Mizoshita t, H Tsukamoto, et ai . (2013) O telmisartan inibe a proliferação celular por bloqueio de translocação nuclear do ProHB-EGF C-Terminal Fragmento em células de cancro do cólon. PLoS ONE 8 (2): e56770. doi: 10.1371 /journal.pone.0056770

editor: Jian-Xin Gao, Xangai Jiao Tong University School of Medicine, China

Recebido: 01 de agosto de 2012; Aceito: 15 de janeiro de 2013; Publicação: 22 de fevereiro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Ozeki et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por uma bolsa-in Aid para a investigação científica C (KAKENHI 22.590.704) da Sociedade Japonesa para a Promoção da Ciência (JSPS). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Os autores têm o seguinte interesse concorrentes: Yoshimasa Inoue e Eiji Nishiwaki são empregados por comercial empresa Carna Biosciences Incorporação. Não há mais patentes, produtos em desenvolvimento ou produtos comercializados a declarar. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento, como detalhado em linha no guia para os autores. Todos os autores declaram que não há conflito financeiro de interesse existe em relação ao conteúdo do artigo.

Introdução

O câncer colorretal é a principal causa de morte por neoplasia gastrointestinal [1]. Actualmente tratamentos terapêuticos para com cancros colo-rectal avançado está focado principalmente na concepção de agentes terapêuticos que é voltado para o receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR), o anticorpo monoclonal de bloqueio de anticorpos, tais como cetuximab e panitumumab [2], [3]. são obtidos os efeitos aditivos destes anticorpos terapêuticos mais quimioterapia de combinação sobre o cancro colo-rectal avançado, mas limitada porque a mutação aboliu KRAS estes efeitos [3], [4].

fragmentos N-terminais de ligandos de EGFR, incluindo heparina ligação ao factor de crescimento epidérmico como factor de crescimento (HB-EGF), que é considerada para ser envolvidos na proliferação de células, principalmente nas células de cancro do cólon se ligam a EGFR e induzir a sua fosforilação [5], [6], [7], [8], [ ,,,0],9]. do receptor acoplado a proteína G (GPCR) agonistas (por exemplo, interleucina-8) e 12

O

tetradecanoilforbol-13-acetato (TPA) induzida transactivação de EGFR por meio de uma desintegrina e metaloproteinase (ADAM) – clivado proHB-EGF [10], [11]. Os fragmentos carboxi -terminal de proHB-EGF (HB-EGF-CTF) produzido por ectodomínio derramamento translocar para a membrana nuclear interna, subsequentemente exercer sobre a regulação da proliferação celular através da ligação de proteínas nucleares promielocítica leucemia dedo de zinco (PLZF), um repressor transcricional , causando assim a sua exportação nuclear [12], [13]. Por conseguinte, a inibição da sinalização da translocação nuclear de HB-EGF-CTF é considerado como uma nova estratégia contra o desenvolvimento do cancro colo-rectal. No entanto, não há nenhuma evidência de agentes terapêuticos que bloqueiam especificamente a translocação nuclear de HB-EGF-FTC e a ligação do que a PLZF

Assim, os objectivos do presente estudo foram:. I) para tela potente química compostos que são capazes de inibir as interacções entre HB-EGF-CTF e PLZF através de GST-puxar para baixo de ensaio, de ressonância de plasmon de superfície (SPR) e espectroscopia Alphascreen tecnologia, ii) validar os efeitos inibidores destes compostos potentes sobre a proliferação celular, e iii ) atestar a importância de inibir a translocação nuclear de HB-EGF-CTF na proliferação de células de câncer de cólon.

Materiais e Métodos

Materiais

TPA foi comprado de celular tecnologia de sinalização (Berverly, MA, EUA). anticorpo policlonal anti-EGFR, anti-fosfotirosina anticorpo monoclonal (4G10) e normal IgG foram adquiridos a Millipore (Billerica, MA, EUA). O inibidor da tirosina-cinase EGFR AG1478 e anticorpo anti-PLZF foram adquiridos a partir de Calbiochem (La Jolla, CA, EUA). Candesartan foi obtido a partir de Takeda Pharmaceutical Company Limited (Osaka, Japão) e telmisartan era um tipo dotado da Boehringer Ingelheim (Ingelheim, Alemanha). Olmesartan e losartan foram adquiridos a partir de Daiichi Sankyo Company Limited (Tóquio, Japão) e da Merck Sharp Dohme (Whitehouse Station, NJ, EUA), respectivamente. O anticorpo anti-HB-EGF-CTF policlonal [12], e inibidor da metaloproteinase, KB-R7785 [14], foram preparados. O anticorpo anti-FLAG M2 monoclonal e o receptor do proliferador de peroxissoma activado (PPAR) γ antagonista, GW9662 [15], [16], foram adquiridos da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA).

Preparação de plasmídeo

Um plasmídeo que codifica FLAG marcada com PLZF foi gerado por subclonagem da sequência de cDNA FLAG e PLZF humana em pcDNA3.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA). Plasmídeos para a expressão recombinante de derivados PLZF marcada com Flag, EGFR fundida com GST ligantes-CTF, e PCP (proteína fluoresceína cyan) tagged PLZF foram preparados [12]. Os dedos de zinco (ZnF) 5-8, e, EGFR-CTF foram clonados em pGEX6P-1 (GE Healthcare, Little Chalfont, UK).

Cultura celular

linhas celulares de cancro do cólon humano, HT29 e HCT116 (American Type Culture Collection, Rockville, MD, EUA), foram cultivadas com McCoy’s5A (Sigma), CaCo2 (American Type Culture Collection) foram cultivadas com meio modificado por Dulbecco de Eagle (DMEM) com soro bovino fetal a 20% ( FBS). E SW480 (American Type Culture Collection) foi cultivado DMEM com FBS a 10%. células HT1080 e queratinócitos humanos primários foram cultivados [12], [17].

GST pull-down Ensaio

GST e proHB-EGF-CTF fundido-GST, GST transformando fator de crescimento α (TGF-α) -CTF, GST- anfirregulina (AR) -CTF, e GST- epirregulina (EPR) -CTF foram preparados [12]. Após a ligação de GST e GST-EGFR-ligandos CTF para as esferas de glutationa-Sepharose, os lisados ​​que contêm vários derivados de PLZF FLAG-tag foram incubadas com 20 uL de pérolas durante 2 h a 4 ° C. Após a lavagem, as proteínas ligadas foram analisados ​​com immunoblotting utilizando um anticorpo anti-FLAG.

Superfície Plasmon Resonance (SPR) Espectroscopia

Um núcleo BIA S51 SPR System® (GE Cuidados de Saúde) foi usado para qualitativamente e quantitativamente analisar as interacções entre os quatro imobilizada EGFR-ligando-CTFs (isto é, HB-EGF-CTF, TGF-α-CTF, AR-FTC, e EPR-CTF) e GST-Zn 5-8 de PLZF, que eram medido em unidades de ressonância (RU). O recombinante biotina-EGFR ligando-CTFs (Peptide Institute, Inc., Osaka, Japão) foram imobilizados individualmente (~1000 RU) por meio de acoplamento grupo amino em estreptavidina (SA) chips certificados. Vários concentração de GST-Zn5-8 foram adicionados em tampão de corrida de HEPES (10 mM de HEPES, pH 7,4, NaCl 150 mM, 0,005% tensioactivo P20) a uma taxa de fluxo de 30 mL /min durante 2 min. Os chips sensores foram dissociadas por uma injecção de 30 segundos de mM de Glicina-HCl a 10, pH 1,5. Os diagramas sensores foram analisados ​​com o Software BIA de avaliação (versão 4.1; BIAcore). As constantes de equilíbrio de dissociação ( ‘constante de ligação “; KD) de cada reacção foram calculadas dividindo-se as taxas de dissociação (‘ taxa off ‘; kd) pelas taxas de associação (” sobre a taxa de’; ka) (isto é, Kd = kd /ka) .

Imagem de PCP Proteínas de fusão e quantificação de celulares fracções com Nuclear localizada CFP-PLZF

células HT1080 transfectadas transitoriamente, e HT1080 estável /HB-EGF, HT1080 /TGF-α, HT1080 /AR, e células HT1080 /EPR foram cultivadas durante 24 h e, em seguida, as células foram pré-tratadas com 10? M KB-R7785 em meio isento de soro durante 30 min. As células foram em seguida incubadas em meio isento de soro com 100 nM de TPA durante 1 h. localização subcelular da proteína de fusão PCP foi examinada sob um microscópio de epifluorescência (Eclipse TE3000, Nikon, Tokyo, Japão) [12].

ALPHASCREEN Ensaios

Um Alphascreen System® (PerkinElmer, Shelton, CT , EUA) foi utilizado para pesquisar uma biblioteca de compostos químicos (9000 Carna Bioscience Inc., Kobe, Japão) cyclopaedically para a sua eficácia no bloqueio da interacção entre ligandos biotinilados-EGFR-CTF e GST-Zn5-8 de PLZF. 5 ul de 1,25 ug /mL de recombinante GST-ZnF5-8 foi incubado com 2,5 mL de 1,25 ug /ml de biotina-EGFR-ligandos CTF durante 30 min, e 2,5 mL de anticorpo anti-GST (1,8 ug /ml) foi adicionado durante ao longo de 1 h. Em seguida, 5 mL de doadores revestida com estreptavidina e GST anti-IgG conjugado com pérolas aceitadoras (mistura 01:01) foram incubadas durante 2 h no escuro. sinais AlphaScreen (contagens por segundo) foram analisados ​​com um leitor de microplacas EnVision (Perkin-Elmer). Os ensaios foram realizados a 23 ° C em tampão contendo HEPES 25 mM, MgCl 1 mM de

2, 20 mM de NaCl, pH 7,4, BSA a 0,1%.

Ensaio de Proliferação Celular (CCK-8 Kit de Ensaio)

Uma contagem celular Kit8 (CCK-8) (Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japão) foi usada para determinar a proliferação celular. Resumidamente, 2 × 10

5 células por poço, foram cultivadas em placas de cultura de 96 poços com 10% de FBS durante 24 h. Em seguida, FBS foi substituído com meio isento de soro durante 72 h com ou sem 30 uM de 12 compostos candidatos e telmisartan ou candesartan (0,3, 3 e 30 uM), e 30 uM de GW9662 durante a estimulação com 100 nM de TPA. 10 uL de CCK-8 solução foi então adicionada a cada poço, e incubou-se a 37 ° C durante um adicional de 2 h. A densidade óptica (OD) foi examinada a num comprimento de onda de 450 nm.

Monitorização crescimentos de células únicas

As células foram semeadas a uma densidade de 5 x 10

2 células por 10 cm de altura de um prato no dia 0 em meio de crescimento normal a 10% de FBS. Após 24 h (no dia1), as células bastante isoladas e morfologicamente saudáveis ​​foram marcadas com microscopia de contraste de fase. O meio foi substituído por 5% de meio de FBS (controlo) com ou sem 100 nM de TPA, 10 mM de KB-R7785, 100 nM de AG1478, 30 uM de telmisartan e candesartan, e 50 ng /mL de recombinante de HB-EGF ( Sigma). O meio foi trocado a cada 48 h com meio fresco. A morfologia celular e as contagens foram marcados a cada 24 h [18].

Microscopia de imunofluorescência

As células que formaram uma colónia foram mudadas para meio isento de soro durante 48 h e, em seguida, incubadas durante 60 min em 5 % de meio de FBS condicionada com ou sem 10 uM de KB-R7785, 100 nM de AG1478, 50 ng /mL de recombinante HB-EGF, 30 | iM de telmisartan, e 30 uM de candesartan. Subsequentemente, as células foram tratadas com 100 nM de TPA durante 90 min, e em seguida fixadas com etanol e acetona. A localização subcelular de HB-EGF-CTF e PLZF foi analisada com imunofluorescência. Foram utilizados anticorpos primários contra HB-EGF-CTF ou PLZF. Os anticorpos secundários foram Alexa Fluor 594 anti-IgG de coelho Alexa Fluor ou anti-IgG de ratinho (Invitrogen). As imagens foram obtidas em um Eclipse 80i microscópio de fluorescência (Nikon).

Imunoprecipitação e Western Blot

As células em um estado subconfluentes foram mudadas para meio isento de soro durante 48 h e tratada com TPA na vezes indicado. O telmisartan e candesartan foram adicionados às células durante 60 minutos, antes de os estímulos. As células foram lisadas com tampão de lise, e os sobrenadantes foram colhidos e incubados com 1 ug de anti-EGFR humano ou anticorpos policlonais anti-HB-EGF-CTF durante 2 h a 4 ° C com rotação-sobre-extremidade final. Imunoprecipitação e Western blotting foram realizadas [11]. Os anticorpos primários utilizados foram 4G10 ou anti-PLZF, e anti-HB-EGF-CTF. Os anticorpos secundários utilizados foram anti-IgG de ratinho ligado a HRP ou anticorpos anti-IgG de coelho ligado a HRP (Cell Signaling Technology). As membranas foram desenvolvidas em um sistema de detecção de mancha ocidental ECL (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, Inglaterra).

Silencing a Angiotensina II do tipo 1 Receptor (AT1R) e ADAM12

As células foram transfectadas com 30 ^ M de AT1R e siRNAs Scramble (Santa Cruz, Delaware, CA, EUA), e com 10 mM de ADAM12 e siRNAs Scramble (Invitrogen), utilizando o reagente lipofectamina (Invitrogen). 72 h depois as células foram transfectadas, a expressão de AT1R e ADAM12 (Santa Cruz Biotechnology) foram analisados ​​por transferência de Western.

Estatísticas

Os dados são expressos como média ± SEM. A ANOVA one-way e teste de procedimento de comparações múltiplas de Turkey-Kramer foram usados ​​para determinar diferenças estatisticamente significativas (P 0,05)

Resultados

duplas vias de sinalização de EGFR fosforilação e HB-EGF C. -terminal Fragmento Translocação Nuclear durante a proliferação celular (Citado de Ref No. [19] e de modificação.)

12

O

-tetradecanoylphorbor-13-acetato de receptor do factor de crescimento epidérmico induzida (TPA) (EGFR) transactivação através de uma desintegrina e metaloproteinase (ADAM) – factor de crescimento de ligação a proheparin clivado do tipo EGF (EGF-proHB) e regula a proliferação das células [10]. Em paralelo, os fragmentos carboxi-terminal (CTF) do proHB-EGF (HB-EGF-CTF) translocar na membrana nuclear interna, posteriormente exercem sobre a regulação da proliferação celular através da ligação da proteína nuclear promielocítica dedo leucemia zinco (PLZF), um repressor da transcrição, causando assim a sua exportação nuclear (Fig. 1) [19].

Citado a partir de [19] e modificado. TPA induz uma clivagem mediada por ADAM de proHB-EGF, e resulta no desprendimento ectodomínio do seu fragmento N-terminal e a geração de um fragmento C-terminal intracelular (CTF). O HB-EGF solúvel se liga ao EGFR e induz uma rápida fosforilação transitória de EGFR. A fosforilação resulta na transcrição de vários genes. Enquanto isso, o HB-EGF-CTF é translocado para o núcleo, onde posteriormente induz a exportação nuclear de PLZF. Isto resulta na progressão do ciclo celular. Os blocos potente inibidor da translocação nuclear de HB-EGF-CTF. P indica fosforilação. Abreviaturas: EGFR; receptor do factor de crescimento epidérmico, TPA; 12-

O

tetradecanoilforbol-13-acetato, PKCδ; proteína quinase Cδ, ADAM; Proteína Adam, HB-EGF; heparina de ligação ao factor de crescimento do tipo EGF, CTF; fragmento C-terminal, de MAPK; activada por mitogénio proteína quinase, PLZF; promielocítica dedo leucemia zinco.

Nossa hipótese é que a inibição da translocação nuclear de HB-EGF-CTF pode levar a uma nova estratégia para a proliferação de células de prevenção durante o desenvolvimento do câncer de cólon.

No entanto, não há atualmente nenhuma evidência de candidatos potentes que especificamente bloquear a sinalização de translocação nuclear de HB-EGF-CTF.

o CTF de ligantes de EGFR interagiram com a parte específica do PLZF (ZnF5-8) Nós usamos o celular HT1080 linhas porque as células HT1080 expressam pouco endógenos precursores HB-EGF, e eles são úteis para analisar os sítios de ligação entre HB-EGF-CTF e PLZF e exportação nuclear de PLZF após superexpressão precursores HB-EGF e derivados PLZF [12]. O primeiro certificado a interacção entre os domínios citoplásmicos de ligandos de EGFR PLZF e em células HT1080 que expressam os quatro proEGFR-ligandos e PLZF Antes do rastreio os candidatos potentes. Dado que PLZF coimmunoprecipitates com um anticorpo contra o CVA de proHB-EGF em células HT1080 que sobre-expressam proHB-EGF e PLZF etiquetado FLAG-[12], um coimmunoprecipitation de PLZF foi realizada com anticorpos contra o CVA dos quatro ligandos de EGFR (HB-EGF , TGF-α, AR, EPR), em células HT1080. O gene PLZF comprimento total marcado com FLAG foi transientemente transfectada para células que expressam de forma estável proHB-EGF, proTGF-α, PROAR ou proEPR (Fig. 2A). PLZF foi expressa nestas células (Fig. 2B, pista 1). Após a estimulação de TPA para 1 h, proteína PLZF marcado com FLAG que imunoprecipitada com cada anticorpo foi detectada por immunoblotting com um anticorpo anti-FLAG (Fig.2B, pista 2).

(A) Esquema de FLAG-tagged PLZF comprimento total consistindo de FLAG, BTB, Centro, e nove ZnFs. células (B) HT1080 que expressam estavelmente pró-HB-EGF, pró-TGF-α, pró-AR e pró-EPR foram transitoriamente transfectadas com um vector que codifica PLZF marcado com FLAG expressão. a expressão da proteína PLZF de lisados ​​celulares (lane1), bem como, as células tratadas com 100 nM de TPA durante 1 h, e sondadas com anticorpos anti-FLAG após imunoprecipitação com anticorpo anti-EGFR ligandos CTF anticorpos (lane2) e um anticorpo de coelho anti-normais IgG (lane3). (C) GST pull-down ensaio. Os lisados ​​celulares contendo derivados PLZF marcado com FLAG foram incubados com GST (faixa 2), GST-HB-EGF-CTF (pista 3), a GST-TGF-α-CTF (Lane4), GST-AR-CTF (pista 5), e GST-EPR-CTF (pista 6) os grânulos durante 2 h, e as proteínas ligadas foram detectados por imunotransf erência com um anticorpo anti-FLAG. (D) Esquema de derivados PLZF marcada com Flag. As propriedades de ligação de derivados PLZF a GST-corte com fusível HB-EGF-CTF, TGF-α-CTF, AR-CTF e EPR-CTF GST em um ensaio de pull-down, resumidas nas pistas direito de cada estrutura. propriedades de ligação são baseadas na estimativa de intensidade da banda com o são em relação à banda de controlo, indicado pelo ++ ( 50%), + (50-10%), e – ( 10%)

.

em seguida, determinou-se as regiões de ligação de PLZF para os domínios citoplásmicos de ligandos pró-EGFR em HT1080 no ensaio de GST pull-down. Um ensaio de GST pull-down mostrou a interacção entre o ligando de EGFR-CTFs e ZnF 5-8 de PLZF. Cada recombinante fundida-GST CTF (GST-CTF) puxado para baixo PLZF FLAG-marcado igualmente em lisados ​​celulares preparados a partir de células HT1080 expressando marcado com FLAG PLZF (Fig. 2C, painel 1). Foi investigada mais das regiões de ligação da CTFs em PLZF. Vários derivados PLZF marcada com Flag (Fig. 2D) foram preparadas e incubadas com recombinante GST-EGFR ligando-CTFs. A região dedo toda zinco (ZnF1-9) e ZnF5-8 foram puxados para baixo em partes iguais pela GST-TGF-α-CTF, GST-AR-CTF e GST-EPR-CTF, bem como HB-EGF-CTF, mas não GST sozinho (Fig. 2C, os painéis 3 e 4). Nenhum dos quatro GST-CTFs puxou para baixo o mutante de deleção falta uma região dedo de zinco (BTB + Center) (Fig. 2C, painel 2). Em seguida, testamos se os mutantes de deleção de ZnF6-7 (PLZF /ΔZnF6-7) e ZnF5-8 (PLZF /ΔZnF5-8) vincular a GST-CTFs. A supressão de ZnF6-7 revogada a ligação de PLZF a GST-TGF-α-CTF e GST-HB-EGF-CTF, sugerindo que o TGF-α-CTF e HB-EGF-CTF interagir com PLZF através ZnF6-7. Em contraste, PLZF /ΔZF6-7 ligado fracamente a GST-AR-CTF e GST-EPR-CTF (Fig. 2C, painel 5). Por fim, foi testado se ZF5-8 é uma região crítica para interagir com AR-CTF ou EPR-CTF. PLZF /ΔZnF5-8 nenhum limite ao GST-CTFs (Fig. 2C, painel 6). Estes dados sugerem que a região ZnF5-8 é fundamental para as interações entre PLZF eo CTFs.

Afinidade de ligação fraca de HB-EGF-CTF e PLZF foi importante para a exportação nuclear de PLZF

Para esclarecer melhor se os quatro CTFs interagir diretamente com PLZF, analisamos a ligação entre o CTFs e recombinante ZnF5-8 marcado com GST (GST-ZnF5-8) usando um sistema de SPR. GST-ZnF5-8 ligado com biotina imobilizada-AR-CTF e biotina-EPR-CTF (Fig. 3A) com uma concentração de 0,03-1,0 uM. O

K

D para a interação entre GST-ZnF5-8 e biotina-AR-CTF foi de 76,5 nM, e para GST-ZnF5-8 e biotina-EPR-CTF foi de 146 nM (Tabela 1 ). Em contraste, o

K

valor D para a interação entre GST-ZnF5-8 e biotina-HB-EGF-CTF não foi calculado devido a sua dissociação rápida. O sinal de ligação de GST-ZnF5-8 de biotina imobilizada com TGF-α-CTF foi observada, mas foi inferior ao de biotina-FTC-AR ou biotina-EPR-CTF. Assim, a constante de dissociação não pôde ser calculado devido à ausência de ligação dependente da dose de GST-ZF5-8 a uma concentração de ≤0.5 uM e interferência com os resíduos SH livres das sete cisteínas de TGF-α-CTF (Fig . 3A).

(a) interação direta entre EGFR-ligante-CTF e PLZF (marcado-ZnF5-8 GST-) com o sistema SPR. O recombinante biotina-EGFR ligando-CTFs foram imobilizados individualmente, por chips de sensor SA. GST-Zn5-8 com concentrações que variam de 0,03 a 1,0? M, em seguida, foi injectado com tampão a 25 ° C e um caudal de 30 mL /min durante 2 min em execução. (B) O vector de expressão que codifica PCP-PLZF foi co-transfectado para células HT1080 de tipo selvagem e células HT1080 que expressam de forma estável, quer proHB-EGF, proTGF-α, PROAR ou proEPR. As células foram cultivadas durante 24 h e, em seguida, pré-tratados em meio isento de soro com KB-R7785. As células foram então tratadas no meio condicionado isento de soro com TPA, e observou-se a localização subcelular da proteína de fusão PCP. Para determinar a percentagem de células (média ± DP) que demonstram a localização nuclear de PCP-PLZF, as células foram contadas em pelo menos duas transfecções, e pelo menos 200 células que expressam PCP-PLZF foram examinados em cada experiência. * P 0,05 para o efeito durante o tratamento com TPA estímulo versus nenhum tratamento, e ** P 0,05 para o efeito inibitório durante o tratamento KB-R7785 versus o tratamento com TPA. (C) Um diagrama esquemático do sistema de alto rendimento Alphascreen. Após excitação a 680 nm, o oxigénio ambiente é convertido em oxigénio singuleto (

1O

2) por um fotossensibilizador presente nas esferas dadoras. Se as contas aceitadoras estão em estreita proximidade ( 200 nm),

1O

2 transfere sua energia para tioxeno derivados presentes nas esferas aceitadoras que levam à emissão de luz a 520-620 nm. Um complexo é composto de pérolas de doadores revestidas de estreptavidina e biotinilado EGFR ligantes-CTF. Outra consiste em anti-GST esferas aceitadoras de anticorpo conjugado e GST-ZF5-8. Se ocorrer a associação entre o EGFR ligando-CTF e ZnF5-8, as contas estão perto o suficiente para permitir a detecção de um sinal. Quaisquer inibidores desta interacção iria aumentar a distância entre os grânulos, e o sinal seria perdida. (D) AlphaScreen sinais de GST ou GST-Zn5-8 incubadas com várias concentrações de biotina-HB-EGF-CTF. (E) AlphaScreen sinais de biotina-HB-EGF-CTF incubadas com várias concentrações de GST ou GST-Zn5-8. (E) As capacidades de ligação de HB-EGF, TGF-α, amphiregulin (AR), e epirregulina (EPR), para PLZF com sistema de Alphascreen.

Em seguida, para esclarecer exportação nuclear de PLZF desencadeada pelo derramamento TPA-indutível de ligandos de EGFR, a localização subcelular da proteína PLZF foi examinada durante a translocação intracelular dos quatro CTFs. O vector de expressão que codifica PCP-PLZF foi transfectado em células HT1080 e células HT1080 que expressam estavelmente transfectadas quer proHB-EGF, proTGF-α, PROAR ou proEPR. Sabe-se que as células do tipo selvagem HT1080 expressam constitutivamente menos HB-EGF e assim, a translocação nuclear de HB-EGF-CTF não é observado [14]. PCP-PLZF foi predominantemente localizadas no núcleo de células HT1080 e nos quatro transfectantes. o tratamento com TPA durante 1 h induziu uma distribuição de PCP-PLZF em todo o citoplasma das HT1080 /HB-EGF, HT1080 /TGF-α, e células EPR HT1080 /. No entanto, TPA não alterou a localização subcelular de PCP em PLZF-HT1080 e células HT1080 /AR. Os rácios de PFR-PLZF localizam no núcleo após derramamento TPA-indutível foram significativamente baixa em HT1080 /HB-EGF, HT1080 /TGF-α e células HT1080 /EPR (Fig. 3B). Pré-tratamento com 10 uM de KB-R7785, um inibidor de metaloproteinase, eficazmente revogada a frequência de exportação nuclear PCP-PLZF após a estimulação de TPA na HT1080 /HB-EGF, HT1080 /TGF-α e células HT1080 /EPR (Fig. 3B) . Curiosamente, a frequência da exportação nuclear de PLZF é inversamente correlacionada com a sua afinidade. Estes resultados indicam que a afinidade da interacção CTF-PLZF afeta localização intracelular e função do PLZF.

Alto rendimento Triagem Ensaio do sistema para os inibidores que bloqueiam a interação entre o ZnF5-8 de PLZF e AR ou HB -EGF-CTF Estreitado 12 candidatos e Quatro ARBs

um ensaio de rastreio de alto rendimento foi desenvolvido em um Alphascreen® para triagem de inibidores que bloqueiam a interação entre ZnF5-8 e CTFs. O design do ensaio Alphascreen baseia-se no facto de que um sinal pode ser detectado apenas quando dador revestido de estreptavidina e anti-GST esferas aceitadoras de anticorpo de conjugado são fechados dentro de uma distância de 200 nm. Os grânulos são postos em proximidade para esta reacção através de interacções específicas de complexos ZnF5-8 e CTFs acoplados a eles (Fig. 3C). O aumento das concentrações de biotina-HB-EGF-CTF dependente da dose aumentou o sinal Alphascreen, quando incubados com GST-ZnF5-8 (Fig. 3D). O aumento das concentrações de GST-ZnF5-8 também dependente da dose aumentou o sinal, quando incubadas com biotina-HB-EGF-CTF (Fig. 3E). Os sinais AlphaScreen para a interacção entre biotina-AR-CTF, biotina-EPR-CTF, biotina-TGF-α-FTC, e biotina-HB-EGF-GST com CVA-ZnF5-8 eram comparáveis ​​com as afinidades de ligação determinadas com SPR sistema (Fig. 3F).

Uma análise com biotina-AR-CTF e GST-Zn5-8 de PLZF poderia indicar claramente os efeitos inibitórios dos candidatos obtidos na interacção da biotina-AR-CTF com GST-Zn5- 8 de PLZF porque Alphascreen sinal de biotina-FTC-AR foi maior do que a biotina-HB-EGF-CTF. Com base na sua eficácia de bloquear a ligação de AR-CTF, bem como HB-EGF-CTF e Zn5-8 de PLZF, doze candidatos, incluindo no.8016, 7701 e 7804 foram obtidos por rastreio de compostos químicos 9000 (Fig. 4A ). A% de inibição de 10 uM de nenhuma. 8016, 7701 e 7804 na interacção entre biotina-AR-CTF e GST-Zn5-8 de PLZF foram de 30,4, 60,5 e 49,9, respectivamente. O efeito inibitório do composto no.8016 na interacção não foi a mais elevada (Tabela 2). No entanto, No.8016 inibiu a proliferação celular mais forte entre os doze candidatos no ensaio de proliferação celular (Fig. 4B). Com base nos resultados de proliferação de células, que não seleccionado. 8016 como um candidato. A metade da concentração máxima inibitória (IC

50) obtida com o composto no. 8016 foi de 29,9 mM (Fig. 4C).

a fórmula estrutural do composto candidato (A) Doze com base na eficácia para bloquear a ligação de HB-EGF-CTF ou AR-CTF para Zn5-8 de PLZF com sistema de Alphascreen. (B) Efeitos inibidores dos compostos doze candidatos sobre a proliferação celular induzida por TPA em queratinócitos com um ensaio de proliferação celular. 2 × 10

4 as células foram tratadas, em meio condicionado com ou sem os doze compostos candidatos durante a estimulação de TPA, e a absorvância a 450 nm foi determinada a cada 12 h até 60 h. ** P 0,05 para os efeitos inibitórios durante o tratamento 12 candidatos contra o tratamento com TPA. (C, D) Os efeitos inibidores dos candidatos, especificamente no.8016 composto e o telmisartan, na ligação de AR-CTF para PLZF. Parcelas com a percentagem de inibição contra várias concentrações do composto no.8016 e telmisartan apresentados com os

50 valores IC observadas pelo sistema Alphascreen. (E) Efeitos inibidores dos três candidatos ARB na ligação de AR-CTF para PLZF. Parcelas com a percentagem de inibição contra várias concentrações de cada inibidor e inibição apresentaram IC

50 valores.

Em seguida, centrou-se na fórmula de estrutura específica do tetrazole bifenilo em composto candidato , e adicionalmente rastreados compostos químicos, incluindo BRA (ou seja, telmisartan, candesartan, olmesartan, losartan e). Com base na eficácia de bloquear a ligação de AR-CTF para PLZF, o IC

50 de telmisartan, candesartan, olmesartan, e losartan foram 27,8, 21,9, 87,7 e 28,4 uM, respectivamente, e a sua fórmula estrutural química são mostrados ( A Fig. 4D e e). Estes achados sugerem que telmisartan e candesartan são candidatos satisfatórios em bloqueando tanto HB-EGF-CTF e AR-CTF de interagir com PLZF.

No.8016 de compostos candidatos Doze e Telmisartan inibido de Proliferação Celular

células de queratinócitos tem um monte de endógenos precursores HB-EGF, e eles são úteis para analisar a proliferação celular através de sinalização HB-EGF-CTF. Utilizou-se as linhas de células HT1080 quando os inibidores foram testados [17]. Para examinar se os compostos candidatos que bloqueavam a interacção entre o CTFs e PLZF também a proliferação celular inibida, testámos os efeitos inibidores destes doze candidatos e quatro do receptor tipo 1 da angiotensina II (AT1R) bloqueadores (ARBs) sobre a proliferação celular induzida por TPA de queratinócitos com um ensaio de proliferação celular. As células foram tratadas, em meio condicionado com ou sem 30 uM dos compostos candidatos doze e 30 uM de ARA por até 60 horas na presença de TPA, e a absorvância foi medida a cada 12 h. Composto no.8016 telmisartan e foram encontrados para inibir a proliferação celular (Fig. 4B, 5B e D). Além disso, os valores de absorção recuperado gradualmente os níveis de induzida por TPA (isto é, sem o composto no.8016 e telmisartan), quando as células foram lavadas 12 h após a incubação com o composto no.8016 e telmisartan (Fig. 5A e C).

p> (AD) efeitos inibidores do composto no.8016 (a) e quatro BRAs (B) sobre a proliferação celular induzida por TPA em queratinócitos com um ensaio de proliferação celular. 2 × 10

4 as células foram tratadas, em meio condicionado com ou sem a no.8016 ou quatro BRAs durante a estimulação de TPA, e a absorvância a 450 nm foi determinada a cada 12 h até 60 h. (A, C) Inibição da proliferação de células com no.8016 e telmisartan foi verificada na sequência de uma lavagem em 12 h. Também foram observados (D) As células com microscopia.