Abstract

Micro RNAs (miRNAs) regular a expressão de genes alvo posttranscriptionally emparelhando incompletamente com mRNA de uma forma específica de sequência. Cerca de 30% dos genes humanos são regulados por miARNs, e um único miARN é capaz de reduzir a produção de centenas de proteínas por meio de emparelhamento incompleto após ligação miARN-ARNm. Ultimamente, tem vindo a surgir evidências implicando miRNAs no desenvolvimento dos cancros do pulmão. Em particular, o miR-19a, que é altamente expresso em células de cancro maligno do pulmão, é considerada a chave miARN para a tumorigénese. No entanto, seus alvos diretos permanecem subnotificação. No presente estudo, nós nos concentramos em seis potenciais genes alvo miR-19a selecionadas pelo software de previsão alvo miRNA. Para avaliar esses genes como genes diretos alvo miR-19a, realizamos luciferase, suspenso, e os ensaios de western blot. A actividade da luciferase dos plasmídeos com cada local de miR-19a-ligação foi observado para diminuir, enquanto o aumento da actividade de luciferase foi observada na presença de anti-miR-19a bloqueado ácido nucleico (LNA). O ensaio de pull-down mostrou biotinilada miR-19a para se ligar a proteínas ago2 e quatro dos seis potenciais mRNAs alvo. A análise Western blot mostrou que os níveis dos quatro genes de expressão alterada dependendo tratamento com mímico miR-19a ou anti-miR-19a-LNA. Finalmente,

FOXP1

,

TP53INP1

,

TNFAIP3

, e

TUSC2

foram identificados como alvos de miR-19a. Para examinar a função destes quatro genes alvo em células de cancro do pulmão, foram usadas LK79 (que tem uma elevada expressão de miR-19a) e A549 (que tem baixa expressão de miR-19a). A expressão das quatro proteínas alvo foi maior em células A549 do que em LK79. Os vetores de quatro miR-19a expressão de cDNA alvo suprimidos viabilidade celular, a formação de colónias, migração e invasão de A549 e células LK79, mas as células LK79 transfectadas com

FOXP1

e

TP53INP1

cDNAs não mostrou diferença em comparação com as células de controlo no ensaio de invasão

Citation:. Yamamoto K, Ito S, Hanafusa H, Shimizu K, Ouchida M (2015) Descobrindo alvos diretos de miR-19a Envolvidos na Lung Cancer progressão. PLoS ONE 10 (9): e0137887. doi: 10.1371 /journal.pone.0137887

editor: Partha Mukhopadhyay, National Institutes of Health, United States |

Recebido: 18 de junho de 2015; Aceito: 24 de agosto de 2015; Publicação: 14 de setembro de 2015

Direitos de autor: © 2015 Yamamoto et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por uma Grant-in-Aid do Ministério da Educação, Cultura, Desporto, Ciência e Tecnologia do Japão (No. 24.591.905 para MO). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

micro RNAs (miRNAs) são ~ 22 pb não codificante pequenos RNAs que posttranscriptionally regulam a expressão de genes de uma forma específica de sequência [1]. miARNs são codificados pelo tanto seus próprios genes ou incorporado em intrões dos genes “host” e são transcritos pela polimerase II de ARN, como uma parte de um transcrito longo tapado e poliadenilado (pri-miARN) [2]. Pri-miARNs submetido a processamento adicional, que envolve a excisão de uma estrutura de gancho de cabelo, juntamente com sequências de flanqueamento por um membro da família de ARNase III Drosha para criar pré-miARN [3-4]. Pré-miARNs são exportados para o citoplasma por exportina-5 onde eles são ainda clivado por Dicer que remove ciclo terminal de criação de um ARN duplex imperfeita [3-5]. Um dos fios é ligado preferencialmente pelo complexo de silenciamento induzido por ARN (RISC), que contém Argonaute (atrás) As proteínas da família. Embora ambas as vertentes podem tornar-se estavelmente associado a proteínas AGO família (carga etapa) apenas um fio (guia de filamentos; miRNA) é retida pela proteína atrás, enquanto a outra cadeia (vertente de passageiros; miRNA *) é degradada. Os humanos AGO proteínas (ago1 a 4) são caracterizadas por um domínio conservado piwi que é estruturalmente semelhante ao domínio de ARNase H. A piwi interage com a extremidade 5 ‘de miARN maduro e está envolvido na clivagem do ARNm alvo. Todos os quatro proteínas AGO humanos mostram preferências notavelmente semelhantes estruturais para duplexes de pequeno RNA: descasamentos centrais (posição guia 8-11) promovem RISC de carregamento, e inadequações na semente (posição de guia 2-7) ou regiões 3’-MID (posição de guia 12-15) são necessários para o desenrolamento [6]. É difícil para os pequenos duplexes de ARN que ostentam desajustes na região da semente para carregar em proteínas atrás [6-12]. Por outro lado, o reconhecimento de um miARN com mRNAs alvo requer jogos completos ou quase completos com a região da semente. Mais do que 2.500 miARNs são relatadas em humanos (GRCh38, https://www.mirbase.org/cgi-bin/browse.pl?org=has), e 30% dos genes humanos são considerados para ser regulada por miARNs [13] .

O câncer de pulmão é responsável por 19,4% de todas as mortes relacionadas com o cancro, que constitui cerca de 1,59 milhões de mortes em todo o mundo em 2012 (https://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs297/en/) . a progressão do câncer de pulmão está associado a várias alterações genéticas e epigenéticas que afetam a expressão do gene de uma ampla variedade de genes. Em particular, as alterações na expressão de mais de duas dezenas de miARN tem sido relatada em doentes com cancro do pulmão [14], incluindo a superexpressão recentemente relatado do cluster miR-17-92 (oncomiR-1) que codifica, entre outros, o miR-19a e 19b [14]. OncomiR-1 está envolvido na regulação da sobrevivência celular, a proliferação, a diferenciação e a angiogénese [15, 16]. Alguns genes, tais como

STAT3

e

MAPK14

, que estão envolvidos na tumorigênese, têm sido relatados como genes alvo de miR-17-92 em células de câncer de pulmão [17]. MiR-19a, que é altamente expresso em células de cancro maligno do pulmão, é considerada a chave miARN na tumorigénese [18]. taxa de crescimento e viabilidade celular diferem entre os linfomas transfectadas com selvagem ou mutado miR-19a; por conseguinte, o miR-19a pode também ser associado com o crescimento das células [18]. Além disso, o miR-19a ativa a via Akt-mTOR reprimindo o supressor de tumor

PTEN

[18, 19]. Além disso,

SOCS-1 | [20],

THBS1

[21],

IMPDH1

,

NPEPL1

[22], e

TNF -α

também são conhecidos como alvos de miR-19a [23].

no entanto, como ligação de miRNA-mRNA depende de sequências de sementes e de emparelhamento imperfeito de suas vertentes, miR-19a deve ter ainda não identificada alvo genes que influenciam o aparecimento e progressão do câncer de pulmão. No presente estudo, identificamos genes novo alvo de miR-19a e mostrou a capacidade de supressão dos genes-alvo sobre o crescimento, migração e invasão de células de câncer de pulmão.

Materiais e Métodos

Seleção de genes candidatos alvo miR-19a

genes alvo potencial de miR-19a foram previstos usando o seguinte software miRNA previsão alvo: PicTar (https://pictar.bio.nyu.edu), TargetScan ( https://targetscan.org), Miranda (https://cbio.mskcc.org) e miGTS (Kyowa Hakko Kirin Co. Ltd. de Tóquio, Japão). A predição produziu 3,398 genes. Para limitar a gama de possíveis alvos de miR-19a, genes envolvidos no câncer foram extraídos por refinamento da busca pela inclusão de mais de duas palavras relacionadas com o cancro (tumor, supressor, e apoptose) na pesquisa preliminar literatura. Embora mais de 10 genes manteve-se como candidatos alvo miR-19a, seis genes (excluindo os genes já reportados como alvos de miR-19a), ou seja, a caixa forkhead P1 (

FOXP1

), nuclear danos-inducible dependente de p53 protein 1 (

TP53INP1

), proteína 3 TNF-α induzida (

TNFAIP3

), tumor supressor Candidate 2 (

TUSC2

), a SIVA fator de indução de apoptose 1 (

SIVA1

) e de necrose tumoral superfamília do receptor do factor 12A (

TNFRSF12A

), foram selecionados para este estudo.

cultura celular

fibroblastos de pulmão normal humana A linha de células WI-38 e a linha celular de rim embrionário humano HEK293 normais foram adquiridos à American Type Culture Collection (ATCC). linhas celulares de carcinoma de células pequenas do pulmão humano SBC-5 e LK-79 humana e de células não-pequenas do pulmão linhas celulares PC3, PC14, LK2, NCI-H23, NCI-H460, NCI-H520, SQ5, Lu65A, lusófonas 99c, RERF-LCMS, e A549 foram usadas no nosso laboratório [24]. HEK293, SBC-5, Lu-65A, PC3, PC14, LK2, NCI-H23, NCI-H460, NCI-H520, SQ5, Lu-99c, e RERF-LCMS foram cultivadas em DMEM (Life Technologies, Foster City, CA , EUA) ou RPMI-1640 (Wako, Osaka, Japão). LK-79 e A549 foram cultivadas em mistura de DMEM e meio RPMI-1640 (1: 1) suplementado com FBS a 10% (Life Technologies), 100 unidades /mL de penicilina G e 100 mg /mL de estreptomicina (Meiji Seika, Tóquio, Japão). Todas as células foram incubadas a 37 ° C numa atmosfera humidificada contendo 5% de CO

2.

experiências de transfecção foram realizadas exógena de miARN com mímico miR-19a (1, 5, e 10 nM) (CosmoBio, Tóquio, Japão) usando HiPerFect Transfection Reagent (Qiagen, Venlo, Países Baixos). As sequências foram as seguintes: o miR-19a mímico, sentido 5′-p-AUC CGC GCG GUA AUA CGU AUU-3’e anti-sentido 5′-p-GUA UAC UCG CGC GGA CUA UUU-3 ‘; aleatório miRNA (controle de miRNA), sentido 5′-p-UGU GCA AAU CUA UGC AAA ACU GA-3’e anti-5’-P- UUA GUU UUG CAU AGU UGC AC-3 ‘. A expressão de miR-19a foi derrubado por transfecção com anti-miR-19a bloqueado ácidos nucleicos (LNA) (30 nM; 5’-TCA GTT TTG CAT AGA TTT GCA CA-3 ‘) ou um oligonucleótido de controlo-LNA alvo GFP (5’ -ATC ACT CTC GGC ATG GAC GAG C-3 ‘) (Gene desenho Inc., Osaka, Japão) usando HiPerFect Transfection Reagent (Qiagen). Os miR-19a plasmídeos de expressão de ADNc alvo foram transf ectados para as células usando Lipofectamine 2000 (Life Technologies). As células transfectadas foram submetidas a ensaios de viabilidade celular e extracção de RNA de 24 h após a transfecção, e a extracção de proteínas 72 h após a transfecção. A viabilidade celular foi determinada utilizando um ensaio de sal de tetrazólio solúvel em água, a saber, o 2- [2-metoxi-4-nitrofenil] -3- [4-nitrofenil] -5- [2,4-dissulfofenil] -2H-tetrazólio monossódico ensaio de sal (WST-1; Roche Applied Science, Mannheim, Alemanha).

Colony ensaio de formação de

FOXP1

,

TP53INP1

,

TNFAIP3

, e

TUSC2

plasmídeos de expressão de ADNc foram transfectadas em células A549 LK79 e usando Lipofectamine 2000 e seleccionados por G418 (100-400 ug /mL) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA ) em placas de 6 poços. Após 3 semanas, as colónias constituídas por mais do que 200 células foram coradas com violeta de cristal. O número de colónias foi então contado, e os valores médios foram calculados em poços em triplicado.

O crescimento celular

A549 ou LK79 células transfectadas com

FOXP1

,

TP53INP1

,

TNFAIP3

, ou

TUSC2

expressão cDNA plasmídeo vector foram selecionados por G418 para obter células com expressão estável. Após 3 semanas, a população de grandes quantidades de células resistentes a G418 foi recolhido e utilizado para o ensaio de crescimento de células, o ensaio de migração, e ensaio de invasão. Para o ensaio de crescimento celular, as células com expressão estável foram cultivadas a 500 células /poço numa placa de 96 poços. Após 24, 48 e 72 h, as células foram contadas utilizando coloração Hoechst 33342 e microscopia. Os valores médios das células com núcleos claramente coradas foram calculados em poços em triplicado.

ensaio de migração

As células foram cultivadas até 95% de confluência numa placa de 60 mm e riscada com uma ponta de pipeta. As células flutuantes foram removidos por lavagem com solução salina tamponada com fosfato (PBS), e as imagens microscópicas das feridas foram obtidas às 24 h.

ensaio de invasão

Um Corning Matrigel Invasão câmara (24- bem chapa 8,0 micron; Corning, NY, EUA) foi utilizado para o ensaio de invasão. A549 (1 × 10

5) ou LK79 (2,5 × 10

4) As células foram cultivadas com DMEM isento de soro na câmara superior separada das câmaras inferiores, que foram fornecidas com DMEM com FBS a 10% por permeável membranas de PET transparente. Após 24 h, as células foram fixadas e coradas com Cyto Breve A e solução B (Muto Pure Chemicals, Tóquio, Japão). As células não invasivas sobre o lado superior da membrana foram suavemente removidas por limpeza, e as células no lado inferior foram corados e observado por um microscópio. O número de células invasoras foi contado, e os valores médios foram calculados em sete campos por câmara.

ensaio de pull-down de mRNAs alvo de miR-19a

HEK293 células semi-confluentes em 90- placas de cultura de mm foram lavadas com PBS frio, colhidos por um raspador, e tratou-se com 0,5 mL de Tris-HCl 25 (pH 7,5), KCl 70 mM, EDTA 2,5 mM, 0,05% de NP-40, 80 U /ml de ARNase Inibidor (Life Technologies), e um cocktail de inibidores de protease × (Sigma-Aldrich) em gelo durante 20 min e centrifugou-se a 12.000

× g

durante 15 min a 4 ° C. O sobrenadante foi transferido para um novo tubo. Biotinylated RNA de cadeia dupla (8 nmol) de miR-19a (sentido 5′-p-UGU GCA AAU CUA UGC AAA ACU GA-biotina-3’e anti-5′-p-AGU UUU GCA UAG AUU UGC AUA AG-3 ‘) ou controlo ARN aleatório (sentido 5′-p-AUC CGC GCG AUA GUA CGU AUU-biotina-3’e anti-sentido 5’-p-UAC GUA CUA UCG CGC GGA UUU-3 ‘) foi adicionada ao sobrenadante (500 ul) e incubou-se a 4 ° C durante 30 min, com 8 rpm de agitação e, em seguida, a 30 ° C durante 1 h, com 30 rpm agitação. O extracto foi incubado a 4 ° C durante 1 h com 10 mL de estreptavidina Mute�a Matrix (Roche Applied Science), que foi pré-tratada com tampão de extracção [250 ug de BSA livre de ARNase e 100 ug de ARNt de levedura em 500 ul de 25 mM Tris-HCl (pH 7,5), KCl 70 mM, EDTA 2,5 mM, e 0,05% de NP-40] durante 3 h e lavada com o mesmo tampão duas vezes. O complexo /ARNm de estreptavidina /biotina-miARN foi recolhido após uma centrifugação a 5000

× g

durante 30 s e lavados 5 vezes a 4 ° C durante 5 min com agitação de 8-rpm utilizando Tris-HCl 20 ( pH 7,4), KCl 400 mM e 0,5% de NP-40. O complexo /ARNm biotina-miARN foi eluida com 250 uL de Tris-HCl 20 (pH 7,4), KCl 400 mM, 0,5% de NP-40, biotina 5 mM, e 80 U de inibidor /ml de ARNase, a 42 ° C durante 5 min. O

PTEN

gene, relatado para ser um alvo miR-19a, foi utilizado como controlo positivo, e

DAPK1

, cuja sequência não corresponde com sequências de semente de miR-19a na extremidade 3 ‘não traduzida região (UTR) do seu mRNA, foi utilizado como controle negativo.

os plasmídeos

o cDNAs de

FOXP1

,

TP53INP1

,

TNFAIP3

, e

TUSC2

foram amplificados utilizando PCR com os iniciadores específicos do gene e cADN humana normal transcritos de modo inverso a partir de mRNA usando HEK293 ReverTra kit Ace-α (Toyobo, Osaka, Japão). Os cDNAs foram clonados em pBluescript e confirmado por sequenciação de ADN utilizando o sequenciador ABI 3100 (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA). sequências etiqueta FLAG foram fundidos na extremidade 5 ‘do ADNc no quadro, e foram inseridos no vector pIRES2-EGFP (Clontech, Mountain View, CA, EUA) com

Nhe I e

Sal sítios de restrição

i. Estas sequências foram confirmadas pelo seqüenciamento de DNA.

repórter luciferase ensaio

Os fragmentos de 3′-UTR contendo uma possível região miR-19a-obrigatório em todos os genes candidatos foram sintetizados como oligonucleotídeos para ambas as vertentes, as quais pode produzir

Xba

Eu coesa termina após recozimento. As cadeias duplas recozidos foram clonados no 3′-UTR

Xba I

local de

Renilla luciferase

no vector pTK-HRG, que foi um vector phRG-B (Promega, Madison, WI, EUA) tendo cDNA luciferase a jusante do promotor da cinase de timidina de herpes que tínhamos inserido. Os fragmentos inseridos foram sequenciados, e seu número de orientação e fragmento foram determinados. Para o ensaio de luciferase, o pTK-HRG constrói (180 ng) foram co-transfectadas com o plasmídeo repórter de luciferase poa-SRa-luciferase de pirilampo (20 ng) como um controlo interno nas células HEK293. O pTK-HRG construir sem inserto foi usado como um controlo. A actividade de luciferase foi medida 48 h após a transfecção utilizando um sistema de ensaio de repórter duplo de luciferase (Promega) num instrumento Labosystems Luminoskan RT (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA). A actividade luciferase relativo foi calculado através da normalização

Renilla

luminescência de luminescência do vaga-lume. Para cada ensaio experimental, cada amostra foi ensaiada em duplicado. O

p

-valor foi calculada usando a bicaudal

t

-teste. Por outro ensaio de luciferase, as construções de pTK-HRG foram co-transfectadas com LNA anti-miR-19a ou LNA controlo (100 nM) sob as mesmas condições. O pTK-HRG construir tendo uma incompatibilidade com a região central de sequências de sementes miR-19a foi utilizado como controle negativo.

quantitativa transcrição reversa PCR

O puxou para baixo biotina-miRNA /complexo de ARNm foi tratada com o procedimento de extracção com clorofórmio de guanidinio-fenol com ISOGEN-LS (Nippon Gene, Tóquio, Japão), seguido de ADNase I (Sigma-Aldrich) e tratamento ISOGEN-LS. O ARNm foi transcrito em sentido inverso, um volume total de 20 uL usando o kit ReverTra Ace-α. O cDNA do complexo /ARNm biotina-miARN foi amplificado por PCR num volume de 20 uL contendo 0,2-L de cada reacção de transcrição reversa e 10 uL do TaqMan Universal 2 × PCR Master Mix (Life Technologies) num Real- rápida 7300 tempo sistema de PCR (40 ciclos de 95 ° C durante 15 s e 58 ° C durante 5 min). Os iniciadores para detectar ADNc alvo candidato miR-19a foram concebidos flanqueando uma região possível miR-19a-ligação no ARNm alvo (S1 Tabela). As sequências de sonda TaqMan com 5′-FAM e 3′-TAMRA rotulagem para PCR em tempo real são mostrados na Tabela S2. O nível de expressão, ou seja, o valor limiar de ciclo (CT), de cada ARNm alvo na amostra suspenso com miR-19a-biotina foi comparado com o valor CT do que na amostra suspenso com miR-aleatória-biotina e mostrada como a razão relativa. Cada PCR foi realizada quatro vezes, eo

p

-valor foi calculada usando a bicaudal

t

-teste.

Para análise da expressão de miR-19a, celular total O ARN foi extraído utilizando ISOGEN (Nippon Gene). A análise em tempo real PCR quantitativo de miR-19a foi realizada com um TaqMan MicroRNA Transcrição Reversa Kit, TaqMan 2 × Universal PCR master mix e TaqMan MicroRNA Ensaio (Life Technologies). O ARN total (10 ng) foi sujeitos a transcrição reversa num volume total de 15 uL utilizando um kit TaqMan MicroRNA Transcrição Reversa. Alíquotas de cada reacção de transcrição reversa foram amplificadas por PCR num volume total de 20 ul contendo 10 ul da TaqMan 2 × Universal PCR Master Mix. A PCR foi realizada num Sistema de PCR 7300 rápido em tempo real com 50 ciclos de 95 ° C durante 15 s e 60 ° C durante 60 s. O nível de expressão (valor CT) de miR-19a foi normalizada para o valor de CT de um ARN nuclear pequeno, U6B, que foi co-amplificado como um controle endógeno. O ΔCT foi calculada como a diferença nos valores de CT entre o miR-19a e o U6B controlo interno em cada amostra. As comparações dos níveis de expressão de miARN foram conduzidos utilizando o método ΔΔCT, onde ΔΔCT foi a diferença nos valores ΔCT de uma amostra de teste em comparação com a da amostra de controlo, e 2

-ΔΔCT representa a mudança vezes na expressão de miARN.

Para análise em tempo real PCR quantitativo dos genes-alvo miR-19a,

FOXP1

,

TP53INP1

,

TNFAIP3

, e

ARNm celular foi transcrito de forma inversa com o kit de ReverTra Ás First Strand cDNA Synthesis (Toyobo), e o ADNc foi amplificado por PCR num volume total de 20 uL contendo 0,2 uL de cada reacção de transcrição reversa e 10 ul da TaqMan 2 × universal mistura de PCR master (Life Technologies) de uma forma rápida real-Time PCR System 7300, com 40 ciclos de 95 ° C durante 15 s e 58 ° C durante 5 min. Os iniciadores e sondas utilizados para detectar estes ADNc foram os mesmos que aqueles para a detecção de cDNAs de o complexo biotina-miARN /ARNm descrito acima. O CT foi calculada como a diferença nos valores de CT entre cada gene alvo miR-19a e o gene β-actina em uma amostra. Os níveis de mRNA alvo de expressão, também foram medidos utilizando o método ΔΔCT.

Western análise de transferência

Para confirmação de proteína ago2 ligação com a biotina-miRNA /mRNA em cima

in vitro

pull-down, o complexo foi combinado com tampão de carregamento de gel, aquecida a 95 ° C durante 10 min, e em seguida separados em 12% de gel de SDS-poliacrilamida e electrotransferência de difluoreto de polivinilideno (PVDF) membranas (Life Technologies). As membranas foram bloqueadas durante a noite a 4 ° C em BSA a 3% /PBS e depois incubadas durante 4 h a temperatura ambiente com anticorpo monoclonal anti-ago2 (No.016-20861, Wako, Osaka, Japão). Os filtros foram lavados com PBS /0,05% de Tween-20 e depois incubadas com anticorpos conjugados com fosfatase alcalina. O sinal de proteína foi visualizada utilizando FLA-3000 (Fujifilm, Tóquio, Japão).

Para o efeito de miR-19a sobre a expressão da proteína, 72 h após a transfecção de células HEK293 e A549 com o imitador de miR-19a ou anti-miR-19a-LNA, as amostras de proteína (25 ug) foram separados em 8% ou 12% de géis de SDS-poliacrilamida, electrotransferidas para membranas de PVDF, e incubadas durante a noite a 4 ° C com os seguintes anticorpos: anti-TP53INP1 (t -17; Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, EUA), anti-FOXP1 (ab16645; Abcam, Cambridge, UK), anti-TNFAIP3 (ab74037; Abcam), anti-TUSC2 (ab70182; Abcam), anti-SIVA1 (ab67620 ; Abcam), e anti-TNFRSF12A (ITEM-4; Santa Cruz Biotechnology). Anti-β-actina (AC-15; Sigma-Aldrich). Foi utilizado como um controlo de carga

A análise estatística

As proporções relativas de luciferase, expressão de ARN, a viabilidade celular, crescimento celular, formação de colónias e invasão experiências são expressos como os valores médios ± DP e foram analisados ​​pela bicaudal

t

-test. Um valor de

p Art 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Resultados

Avaliação de miR-19a genes candidatos alvo por parte do ensaio de repórter luciferase

Estamos focados em candidatos de genes alvo de seis miR-19a,

FOXP1

,

TP53INP1

,

TNFAIP3

,

TUSC2

,

SIVA1

, e

TNFRSF12A

, que tinha foram selecionadas usando software de previsão miARN alvo. As sequências de nucleótidos da possível local de ligação de miARN na 3′-UTR dos seus mRNAs foram obtidos a partir de software miARN alvo predição (Fig 1A). Para verificar se os locais de ligação de miRNA são regulados pelo miR-19a

in vivo

, construímos plasmídeos repórter luciferase com cada local de ligação no 3′-UTR do

Renilla luciferase

miR-19a do gene (Figura 1B). plasmídeos repórter luciferase com as sequências sem correspondência com a região da semente do miR-19a compreendido o controle negativo. Nós transfectadas

Renilla

plasmídeos repórter luciferase rolamento possíveis locais de miR-19a-ligação de candidatos alvo miR-19a e controle interno de vaga-lume plasmídeos de luciferase em células HEK293 em que a expressão de miR-19a foi confirmada. Os plasmídeos foram então examinados quanto à actividade de luciferase por o sistema luciferase dupla. A actividade da luciferase de todos os plasmídeos com os sítios de ligação de miARN foi significativamente menor do que a do controlo de vector vazio (Figura 1C), o que sugere que o miR-19a-ligação sequências em cada miR-19a ARNm alvo candidatos serão correctamente reconhecidos por miR- endógena 19-a em células HEK293. Além disso, foi examinada a actividade de luciferase dos plasmídeos portadores de sítios de ligação de miARN sob o miR-19a knockdown por co-transfecção com LNA anti-miR-19a. A actividade da luciferase de todos os plasmídeos com os sítios de ligação a miARN aumentou significativamente nas células tratadas com LNA anti-miR-19a como comparada com a das células tratadas com LNA controlo (Fig 1D). Estes resultados sugerem a possibilidade de que esses genes são genes alvo miR-19a. Em seguida, realizou outros experimentos para avaliar a possibilidade de estes serem genes alvo miR-19a.

(A) Visão de miR-19a mRNAs candidatos alvo. Os locais de miR-19a vinculativo-identificados utilizando software PicTar, TargetScan, ou Miranda são mostrados na região 3 ‘não traduzida (UTR) do miR-19a mRNAs candidatos alvo. (B) Construção de vectores de luciferase. Os locais de miR-19a-ligação dos genes candidatos e sequências de controlo negativo (negativo Ctrl) foram clonados a jusante da ORF luciferase no

Xba

site eu restrição do vector pTK-HRG. Sense (

superior

) e antisense (

menor

) vertentes de sequências complementares indicam o local alvo miRNA das sequências de mRNA 3′-UTR e miR-19a, respectivamente. Sublinhados indicam sequências de sementes miR-19a. O plasmídeo controlo negativo tem descasamentos no centro de sequências de sementes miR-19a. (C) A actividade luciferase de construções com sites de miR-19a-ligação foi comparada com a do vector vazio, que não tinha inserção no

Xba

local I (No-Insert Ctrl), e foram analisados ​​estatisticamente . (D) plasmídeos de luciferase com o site de miR-19a vinculativo e plasmídeo de controlo negativo foram transfectadas com anti-miR-19a-LNA ou control-LNA (Ctrl). A actividade da luciferase de células tratadas com anti-miR-19a-LNA foi comparada com a de células tratadas com o controlo-LNA. *,

p Art 0,05 e **,

p Art 0,005 utilizando duas caudas

t

-Testes.

Avaliação de genes candidatos por um

in vitro

ensaio de pull-down usando biotinilada miR-19a

genes miARN alvo foram recentemente recuperado por um processo de dois passos em que o complexo de ARNm /miARN /FLAG-ago2 foi primeiro puxado para baixo com um anticorpo anti-FLAG, e, em seguida, o complexo /biotinilado miARN ARNm foi purificado por esferas de estreptavidina no extracto das células transfectadas com miARN biotinilado e o vector de expressão de cDNA FLAG-ago2 [25]. Portanto, para avaliar os nossos genes candidatos como alvos de miR-19a, adotamos a melhoria da

in vitro

ensaio de pull-down (Fig 2A). Em primeiro lugar, o extracto de células foi suavemente preparados a partir de células HEK293 em que foi detectada uma expressão suficiente de cada ARNm candidato (Fig 2B). A biotinilada miR-19a double-stranded RNA ou controlar aleatória foi incubada no extrato celular para produzir um complexo da biotinilado miRNA cadeia simples com RISC e mRNA. O complexo biotinilado miARN /ARNm /RISC foi incubada com esferas de estreptavidina no extracto, recolhidos por centrifugação breve, e eluiu-se com tampão de eluição contendo biotina 5 mM a partir de contas de estreptavidina. O complexo biotinilado miARN /ARNm foi tratado por extracção com fenol-clorofórmio, ADNase I, e transcrição reversa. Antes da análise por RT-PCR dos genes candidatos alvo, que se confirmou o complexo de miR-19a /ARNm biotinilado contém o componente ago2 RISC por western blotting. O complexo suspenso com biotinilado miR-19a exibiu o sinal da proteína ago2 (Figura 2C, faixa 1), enquanto nenhum sinal foi observado para o complexo suspenso com ARN aleatório biotinilado (Figura 2C, faixa 2), sugerindo que biotinilada miR-19a, alvo de ARNm e ago2 pode formar um complexo neste ensaio suspenso. Em seguida, comparamos a quantidade de mRNAs alvo candidato nos complexos puxado para baixo usando biotinilada miR-19a e controlar RNA aleatórias por quantitativa PCR em tempo real. Os iniciadores de PCR para os genes alvo candidatos foram concebidos para amplificar a região (100 ~ 300 pb) contendo o miR-19a-ligação sítios no seu 3′-UTR (S1 Tabela). Entre os seis candidatos,

FOXP1

,

TP53INP1

,

TNFAIP3

, e

TUSC2

níveis de mRNA foram significativamente maiores no complexo puxado para baixo com miR biotinilado -19a do que os do controlo (Figura 2D). Para a confirmação deste sistema suspenso, examinámos um gene alvo de miR-19a controlo positivo,

PTEN

, bem como um gene de controlo negativo, cuja sequência não se encontraram as sequências de semente de miR-19a. Detectamos um aumento do nível de

PTEN e ARNm de diminuição do nível de ARNm do gene do controlo negativo no complexo suspenso usando biotinilado miR-19a. Portanto, nós nos concentramos em avaliar

FOXP1,

TP53INP1

,

TNFAIP3

, e

TUSC2

genes como alvos de miR-19a.

(a) Visão geral do

in vitro ensaio

pull-down. A biotinilada miR-19a de cadeia dupla ou controlar ARN aleatório foi incubada no extracto celular (passo 1) para produzir um complexo da miARN biotinilado de cadeia simples com o ARNm alvo e RISC (passo 2). O complexo de ARNm /miARN alvo biotinilado foi incubado com contas de estreptavidina e puxada para baixo (passo 3). O complexo foi tratado com DNase I e por transcritos de modo inverso (passo 4). (B) A expressão de ARNm de miR-19a candidatos alvo em células HEK293.

PTEN

, conhecido como um dos genes alvo de miR-19a, foi utilizado como um controlo positivo. O gene, cuja sequência não se encontraram sequências de sementes com miR-19a, foi utilizado como controlo negativo. (C) Confirmação de proteína ago2 em biotinilado complexo mRNA /target miRNA por transferência Western com o anticorpo ago2. Biotinilado miR-19a (pista 1), o controlo biotinilado ARN aleatório (pista 2), e biotina (pista 3) foram usadas para o ensaio de pull-down e sujeitos a SDS-poliacrilamida de electroforese em gel e transferência de Western. extracto celular total foi utilizado como controlo positivo (pista 4). (D) de detecção de mRNAs alvo em complexo biotinilado ARNm miARN /alvo por em tempo real de RT-PCR. O nível relativo de cada ARNm alvo no complexo puxado para baixo, usando biotinilado miR-19a foi comparada com a do complexo puxado para baixo, usando a ARN aleatório controlo biotinilado. **,

p Art 0,005 utilizando duas caudas

t

-Testes.

Avaliação de quatro genes candidatos por western blot

Genes

FOXP1

,

TP53INP1

,

TNFAIP3

, e

TUSC2

foram avaliadas como alvos de miR-19a utilizando outra análise para examinar regulação pós-transcricional por miR-19a nas células. Em primeiro lugar, o miR-19a mímica ou controlar miARN aleatória foi transfectado para células HEK293 para examinar se o miR-19a reduziu a expressão das quatro proteínas alvo miR-19a. Por transferência de Western em 72 h após transfecção, a diminuição da expressão das quatro proteínas alvo foi observada em células tratadas imitam-miR-19a como comparada com a de células tratadas com miARN de controlo (Fig 3A). Em segundo lugar, LNA anti-miR-19a ou controlo LNA foi transfectado para células HEK293 que derrubar endógena miR-19a, e a expressão das quatro proteínas candidatas foi analisada por Western blotting. A expressão aumentada das quatro proteínas alvo foi observada nas células tratadas com LNA anti-miR-19a como comparada com a de células tratadas com LNA de controlo (Fig 3B). Tomados em conjunto,

FOXP1

,

TP53INP1

,

TNFAIP3

, e

TUSC2

foram confirmados para ser genes alvo miR-19a. Nenhuma mudança na SIVA1 ou TNFRSF12A expressão foi observada em células tratadas com LNA anti-miR-19a como comparada com a de células de controlo tratadas com LNA (S1 FIG).

(A) Análise da expressão de proteínas candidatas por western blot análise utilizando proteínas de células HEK293 transfectadas com mímica miR-19a ou controle oligo RNA.-, RNA oligo controle; +, Mímica miR-19a. (B) Análise da expressão de proteínas candidatas por análise de western blot utilizando proteínas de células HEK293 transfectadas com LNA anti-miR-19a ou LNA.- controle, LNA controle;