Abstract
Há muito que se presume, embora com surpreendentemente pouca evidência, uma competição entre o Core 1 Gal-transferase (C1GalT), Core 3 GlcNAc-transferase (C3GnT) e sialil-transferase (ST6GalNAc-T ) para o alongamento de glicanos do tipo mucina ligada a O iniciadas com GalNAcα-Ser /Thr. Este estudo testou se esta presunção por supressão selectiva de uma destas glicosiltransferases e, em seguida, analisadas as expressões dos produtos enzimáticos dos outros três glicosiltransferases. Verificou-se que a supressão de siRNA C1GalT marcadamente reduzida a expressão de Galβ1,3GalNAcα- (Núcleo 1) e, entretanto, aumentou a expressão de sialil-GalNAcα- (sialil-Tn), GalNAcα- (Tn) e GlcNAcβ1,3GalNAcα- ( core 3) -associated glicanos em células HT29 câncer de cólon e SW620 humanos. Isto suporta uma modificação competitiva do GalNAcα-Ser /Tre entre C1GalT, C3GnT e ST6GalNAc-T na biossíntese de O-glicano. Como Tn, TF e sialil-Tn são antígenos oncofetais e estão sobre-expresso na maioria dos cancros humanos, esta informação é útil para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas alvo-glicosiltransferase para tratamento de câncer
Citation:. Barrow H, Tam B, Duckworth CA, Rhodes JM, Yu LG (2013) Supressão do Núcleo 1 Gal-transferase é associado à redução da TF e aumento recíproco de Tn, sialil-Tn e core 3 glicanos em células cancerígenas do cólon humano. PLoS ONE 8 (3): e59792. doi: 10.1371 /journal.pone.0059792
Edição: Roger Chammas, Universidade de São Paulo, Brasil
Recebido: 19 Outubro, 2012; Aceito: 18 de fevereiro de 2013; Publicação: 25 de março de 2013
Direitos de autor: © 2013 Barrow et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiado em parte por uma concessão (CR777) do Fundo de Investigação North West Câncer e da Universidade de PhD Studentship. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
Conflito de interesses:. Lu-Gang Yu é membro do Conselho Editorial PLOS ONE. Os autores confirmam que esta participação no conselho editorial não altera a sua adesão a todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento.
Introdução
A biossíntese de
O
-Conectado mucina glicanos de tipo é um seqüencial processo de múltiplos passos, pós-translacional catalisada pelas expressões e atividades de uma série de glicosiltransferases. O processo de biossíntese começa com a adição de
N-acetil-galactosamina
(GalNAc) para a serina (Ser) ou treonina (Thr) resíduos das proteínas totalmente dobrado /montados para formar o primeiro ligada em O GalNAcα- Ser /estrutura Thr (anti gene Tn) catalisada por um ou dois de uma grande família de até 20 distinto de UDP-N-acetil-α-D-galactosamina polipéptido GalNAc-transferase (ppGalNAc-Ts) [1], [2]. Estas isoenzimas ppGalNAc-T têm diferentes, mas que se sobrepõem parcialmente, as especificidades de péptidos de proteínas em locais diferentes Ser e Thr e são expressos diferencialmente em células e tecidos durante as condições de desenvolvimento, diferenciação e de doença, tais como cancro [3], [4], [5 ]. Esta primeira etapa da biossíntese de tipo glicanos de mucina ligados em O é acreditado para começar em um compartimento entre ER-Golgi [6], [7], [8] e terminar no aparelho de Golgi [9], [10].
a seguir à formação de GalNAcα-ser /Tre, o resíduo GalNAc pode ser modificado com um resíduo Gal catalisada pelo núcleo 1 de Gal-transferase (C1GalT) [11] para a formação da estrutura do núcleo 1, Galβ1,3GalNAcα – [Thomsen Friedenreich-(TF) antigénio]. O resíduo GalNAc de GalNAcα-Ser /Thr pode também ser modificado com um resíduo GlcNAc catalisada pelo núcleo 3 GlcNAc-transferase (C3GnT) para a formação da estrutura de núcleo 3 de GlcNAcβ1,3GalNAcα-. O resíduo GalNAc de GalNAcα-Ser /Thr pode também ser modificado com um resíduo de ácido siálico por uma sialil-transferase (ST6GalNAc-T) para formar o antigénio (sialil-Tn) β1,6GalNAcα- ácido-siálico [12], [13] . ST6GalNAc-I acredita-se ser o predominante sialil-transferase para a formação de sialil-Tn [13]. A formação de sialil-Tn termina a cadeia de açúcar, enquanto a TF e Core 3 estruturas pode ainda ser actuado por outras glicosiltransferases de uma forma gradual para produzir até 8 estruturas de glicosilação do núcleo complexo [14]. O núcleo 1 a 3 estruturas de glicano pode também ser modificado por acetilação, fucosilação, sialilação ou sulfatação.
tem sido especulado que a competição C1GalT, C3GnT e ST6GalNAc-T para modificar o resíduo GalNAc do recém sintetizado GalNAcα-Ser /Thr para a formação de TF, Core 3 ou sialy-Tn estruturas em células vivas [15], [16], [17]. No entanto, a evidência direta que suporte esta modificação competitiva do GalNA-modificação é surpreendentemente falta. Mutação ou inactivação de Cosmc, uma chaperona molecular localizada no RE que é necessário para a actividade da enzima de C1GalT [18], tem sido mostrado para ser associada com a síndrome de Tn, uma doença auto-imune rara em que sub-populações de células do sangue transportar os incompletamente antigénio Tn glicosilada [19]. O tratamento de células cancerosas humanas com o inibidor de O-glicosilação Benzil-GalNAc, um inibidor competitivo para C1GalT transferase e alfa-2,3-sialiltransferase, diminui a expressão de ácidos siálicos celulares e aumenta a expressão de TF [20].
neste estudo, avaliou-se a consequência da supressão seletiva do C1GalT por siRNA em expressões de TF, Tn, sialil-Tn e core glicanos 3-associado em células cancerígenas do cólon humano.
Materiais e Métodos
Materiais
siRNA constrói contra C1GalT e mexidos controle não-targeting siRNA foram obtidos a partir Dharmcon (Perbio Science, Northumberland, UK). Biotinylated-
Griffonia simplicifolia
lectina II (GSL-II) foi comprado de laboratórios vetorial (Peterborough, Reino Unido). Os anticorpos monoclonais contra Tn (clone HB-Tn1) e sialil-Tn (clone HB-STN1) foram adquiridos a partir de Dako (Patologia produtos, Ely, RU). Conjugado com FITC aglutinina de amendoim (PNA-FITC) foi obtido a partir de Sigma.
Linhas Celulares
o cancro do cólon humano HT29 e células SW620 foram obtidas a partir da cultura celular Colecção Europeia na Public Health Laboratory, Porton Down Wiltshire, Reino Unido e cultivadas em DMEM suplementado com 10% de FCS, 100 U /ml de penicilina, 100 ug /ml de estreptomicina e glutamina a 4 mM como previamente descrito [21].
a supressão da expressão C1GalT por siARN
As células foram cultivadas em triplicado em placas de 96 poços (5,0 x 10
3 células /poço) em DMEM isento de anti-bióticos contendo 5% de FCS a 37 ° C durante 24 h antes incubadas com ou sem 100 nM de ARNsi contra C1GalT ou controlo scrambled não segmentação de siRNA a 37 ° C durante 48 h. As células foram lavadas e lisadas para a quantificação de proteínas e caça-níqueis borrões.
Slot de Blotting
Os extratos de proteínas celulares foram transferidas para membrana de nitrocelulose com PR600 SlotBlot (Hoeffer Scientific Instruments, CA). As manchas foram bloqueadas com 5% de BSA, 0,5% Tween-20 em PBS a 4 ° C durante a noite antes da aplicação de anticorpos monoclonais contra TF (FT5) (0,2 ug /ml) [22], Tn (0,2 ug /ml), sialil -tn (0,03 ug /ml) ou biotinilado GSL-II (0,6 ng /ml) durante 1 h. Após a lavagem e subsequente aplicação de peroxidase conjugada com o anticorpo secundário (3 ng /ml) ou peroxidase de Extravidin (Sigma, diluição 1:10,000) durante 1 h, as membranas foram lavadas e visualizadas utilizando um kit de detecção de imunotransferência sinal de super-quimioluminescência (Pierce ; Rockford IL, EUA). análise de densitometria das manchas foi realizada utilizando o software Image Lab (Bio-Rad, Hemel Hempstead, UK).
Fluorescência Imuno-histoquímica
células SW620 foram cultivadas em lâminas de 8 poços de câmara (BD Biosciences) (1 × 10
4 células /poço) em DMEM isento de anti-bióticos contendo 5% de FCS a 37 ° C durante 24 h antes da incubação, com ou sem 100 nM de ARNsi contra C1GalT ou controlo scrambled não segmentação de siRNA a 37 ° C durante 48 h. As células foram fixadas em paraformaldeído a 2% durante 10 min. Após duas lavagens com PBS, as células foram incubadas com soro de coelho a 10% durante 1 hora antes da aplicação de anticorpos contra STN, Tn (ambos soro de coelho diluição 1/100 em 10%), FITC-PNA (5 ug /ml) ou biotinilado GSL-II (5 ug /ml) durante 2 horas. As células foram lavadas com PBS e aplicada com anticorpo secundário conjugado com FITC (diluição 1:100) ou FITC-estreptavidina (diluição 1:1,000) durante 1 h. As células foram lavadas com PBS, montadas com DAPI contendo meio de montagem de fluorescência e fotografada com um microscópio de fluorescência Olympus B51 usando uma objectiva de 40x.
Resultados e Discussão
Supressão do C1GalT foi conseguida por tratamento siRNA de células HT29 câncer de cólon e SW620 humanos. A eficiência de C1GalT knock-down foi monitorizada por expressão celular de TF com anticorpo anti-TF. tratamento C1GalT siRNA de células HT29, durante 48 horas provocou supressão efectiva da expressão C1Gal1T como manifestado por 86 ± 3% (média ± SD) de redução da expressão de TF celular (Fig. 1 A e B). Uma redução similar da expressão de TF foi também observada em células SW620 após o tratamento C1GalT siRNA (Figura 2 A e B).
A:. Glicano expressão HT29 em resposta celular para C1GalT ou ARNsi de controlo. Após o tratamento das células com C1GalT siRNA ou controlar não-alvo siRNA (con-siRNA), expressões celulares do TF, Tn, sialil-Tn e vinculativa GSL-II (glicanos GlcNAc, Core 3-associado) foram avaliadas por manchas de entalhe com anticorpos monoclonais contra TF (TF5), Tn (HB-Tn1), sialy-Tn (HB-STN1) ou com biotina-GSL-II. borrões paralelas foram sondados com anticorpo contra β-actina de carga de proteína iguais. avaliações duplicados são mostrados para cada blot. B: Quantificação das expressões do TF celular, Tn, sialy-Tn e vinculativa GSL-II (glicanos GlcNAc, Core 3-associada), na resposta das células HT29 a C1GalT siRNA. As densidades dos entalhes blots foram quantificados * e as expressões de glicano são expressos como percentagem de alteração para o controlo não-siRNA após normalização com carga de proteína. * As densidades blot de expressão TF de células HT29 tratados não tratados e C1GalT siRNA foram 5004 e 715; Tn 1314 e 4345; sialil-Tn 1634 e 4868; GSL-II de ligação (Core 3) 489 e 1156 e Tublin 1898 e 1928.
A: expressão glicano SW620 em resposta celular para C1GalT ou ARNsi de controlo. Após o tratamento das células com C1GalT siRNA ou controlar não-alvo siRNA (con-siRNA), expressões celulares do TF, Tn, sialil-Tn e vinculativa GSL-II (glicanos GlcNAc, Core 3-associado) foram avaliadas por manchas de entalhe com anticorpos monoclonais contra TF, Tn, Tn-sialy ou com biotina-GSL-II. borrões paralelas foram sondados com anticorpo contra β-actina de carga de proteína iguais. avaliações duplicados são mostrados para cada blot. B: Quantificação das expressões do TF celular, Tn, sialy-Tn e GSL-II de ligação (glicanos GlcNAc, Core 3-associados), em resposta celular SW620 para siRNA C1GalT. As densidades dos entalhes blots foram quantificados * e as expressões de glicano são expressos como percentagem de alteração para o controlo não-siRNA após normalização com carga de proteína. * As densidades blot de expressão TF de células SW620 tratados não tratados e C1GalT siRNA foram 5144 e 834; Tn 1437 e 4313; sialil-Tn 1748 e 4792; GSL-II de ligação (Core 3) 481 e 1229 e Tublin 1984 e 1982.
Tendo efetivamente suprimida a expressão C1GalT, nós então comparadas as expressões de celulares de sialil-Tn (STN), Tn e Core 3 glicanos. As expressões de sialil-Tn celular e glicanos Tn foram avaliadas por manchas de entalhe com anticorpos contra sialy-Tn e Tn. Sem anticorpo contra Core 3 glicano é actualmente disponíveis e que, por conseguinte, utilizado o
griffonia simplicifolia
lectina II (GSL-II) de ligação como um indicador da expressão de glicanos do núcleo 3-associados. GSL-II é isolado a partir de uma lectina
Griffonia (Bandeiraea) simplicifolia
e reconhece os resíduos de GlcNAc a- e p-ligada no terminal não redutor de todos os oligossacáridos [23]. Verificou-se que a supressão da C1GalT resultou em aumento 198 ± 8% de sialil-Tn e 136 ± 24% aumento de GSL-II de ligação (GlcNA-, Core 3), respectivamente, em HT29 e 174 ± 11% e 155 ± 37 % de aumento em células SW620 (Fig. 1 e Fig. 2). Supressão de C1GalT também foi visto a ser acompanhada por um aumento acentuado de expressão Tn no HT29 (231 ± 6%) e SW620 (200 ± 5%) células.
Para confirmar estas alterações de glicosilação observados por slot de borrão, analisamos ainda mais as expressões destes glicanos em células SW620 na sua resposta à C1GalT siRNA pelo estudo imunoistoquímico. O tratamento das células com C1GalT siRNA mais uma vez mostrou redução clara de expressão TF celular (ligação PNA) e marcado aumento de Tn, sialil-Tn e Core 3 (ligação GSL-II) expressões enquanto o tratamento das células com siRNA controle mostraram pouco efeito sobre as expressões destes glicanos (Fig. 3).
Sub-confluentes células SW620 cultivadas em 8 poços lâminas de câmara de vidro foram tratados com ou sem C1GalT siRNA ou controlar não-alvo siRNA para 48 horas antes das manifestações de TF celular, Tn, sialil-Tn e GSL-II de ligação (core 3-associado) glicanos foram avaliados por imuno-histoquímica de fluorescência utilizando biotina-PNA, biotina-GSL-II ou anticorpos contra Tn (HB-Tn1) ou sialil-Tn (HB -STn1). Imagens representativas são mostrados.
Estes resultados demonstram que a supressão da C1GalT que controla a biossíntese da estrutura do núcleo 1 de glicanos ligados em O tipo mucina é acompanhado pelo aumento expressões de sialil-Tn e GSL- II vinculativo (core 3) em células cancerígenas do cólon humano. Este suporta a modificação longo suspeita competitiva do resíduo GalNAc de GalNAcα-Ser /Thr entre C1GalT, C3GnT e ST6GalNAc-T na biossíntese de glicanos complexos do tipo mucina O-ligados. Um diagrama esquemático de iniciação e alongamento dos glicanos ligados em O tipo mucina, suportado por este estudo, está mostrado na Figura 4.
Supressão do C1GalT também foi observado no presente estudo a resultar em aumento acentuado de expressão Tn celular. Isto indica que a formação final do TF celular, Tn, Tn sialil-glicanos e núcleo 3 são controlados não só pela atividade destas glicosiltransferases competitivos. As concentrações de nucleótido de açúcar-doador e a taxa de transporte do substrato ao longo do Golgi ter sido mostrado previamente para contribuir para a expressão de glicanos específicos [17]. O posicionamento relativo das glicosiltransferases dentro do Golgi, também é relatado para ser um determinante importante. Trabalho por Kellokompu e colaboradores [24], [25] e por se estabeleceu [26] mostrou que o Golgi desarranjo ocorre em cancros epiteliais e pode ser mimetizado por agentes que bloqueiam a acidificação de Golgi normais, em ambos os casos, conduzindo ao aumento da formação de antigénios de hidratos de carbono oncofetais . Além disso, a expressão e a acção de chaperones moleculares ER-localizadas também pode desempenhar um papel na expressão dos glicanos oncofetais por controlo da dobragem e, portanto, a actividade das glicosil-transferases relevantes [18]. Assim, as expressões celulares globais de Tn, sialy-TN, TF e Core 3 estruturas são a consequência de uma série de fatores complexos que incluem a concorrência entre as glicosiltransferases relevantes, o arranjo espacial das glicosiltransferases dentro do Golgi, a disponibilidade de açúcar nucleotídeo -donors no aparelho de Golgi e ações de chaperones moleculares relevantes.
os antígenos Tn, TF e sialil-Tn são todos conhecidos como estruturas de carboidratos oncofetais. Eles são expressos no epitélio fetal, em seguida, tornar-se escondido por outros resíduos de açúcar em tecido adulto saudável, mas reaparecer em células displásicas cancerosas e pré-cancerosas. Estima-se que até 90% de todos os cancros humanos transportar estes antigénios de hidratos de carbono oncofetais [27], [28], [29], [30]. Aumento na ocorrência destas estruturas de hidratos de carbono oncofetais está associada com o desenvolvimento e a progressão de diversos cancros humanos incluindo da mama [31], do cólon [27], [32] e pancreático [33] cancros. Evidências crescentes sugerem que a alteração destes glicanos oncofetais pode desempenhar um papel activo na metástase. A deleção de um núcleo derivado de O-glicanos intestinais foi recentemente demonstrado que causam colite espontânea em ratos [34]. Down-regulação da expressão C3GnT6 está associada ao aumento displasia /neoplasia em câncer colorretal humano [35]. Sobre a expressão do antígeno sialil-Tn por células cancerosas tem mostrado para causar comportamentos de células mais agressivas, como aumento da adesão a matriz extra-celular e aumento da migração e invasão
in vitro
[36], [37] e
in vivo em ratinhos
imunodeficiência combinada (SCID) grave [37]. A sobre-expressão de ST6GalNAc-I demonstrou a co-localizada com sialil-Tn em metaplasia intestinal humana, assim como no carcinoma gástrico e tem sido sugerido para desempenhar um papel importante na sialil-Tn sobreexpressão em condições cancerosas [12], [13] . Um reforço da interacção entre TF expresso em proteína mucina associada a cancro de MUC1 e galectinas circulantes, como um resultado do aumento da expressão de /células de MUC1 por células cancerosas e também do aumento da libertação de galectinas por cancro do estroma de tecido //imuno-expressando TF em a circulação, ambos os quais são características comuns no cancro, foi mostrado para promover o espalhamento metastático de células de cancro para órgãos distantes [21], [38], [39]. Este efeito da interacção de TF /MUC1-galectina ocorre como um resultado do aumento da adesão heterotípica de células de cancro para endotélio vascular [38] e também como um resultado da agregação homotípica de células de cancro para formar êmbolos micro-tumor que prolongar a sobrevivência de células de tumor no e permitir a circulação alojamento dentro de capilares no local metastático [40], [41]. Também tem sido relatado que os pacientes de cancro da mama com níveis mais elevados de anticorpo anti-TF mostrar melhor prognóstico que os pacientes com níveis de anti-TF mais baixos [42]. Segmentação estes glicanos oncofetais por imunoterapia com peptídeos que mimetizam TF para o tratamento do câncer potencial tem mostrado resultados promissores em ratos [43].
Assim, a concorrência entre as glicosiltransferases para modificação do resíduo GalNAc de GalNAcα-Ser /Tre e as suas consequências para a expressão de antígenos de carboidratos oncofetais implica uma estratégia potencialmente útil para o desenvolvimento de terapias alvo-glicosiltransferase para o câncer.