Sumário

activação aberrante de β-catenina Tcf-4 sinalização /tem sido implicado na carcinogênese humana, incluindo cancro colorectal. Neste estudo, comparou-se os efeitos de TCF-4 knockdown com knockdown β-catenina sobre a proliferação celular, apoptose, e a quimiossensibilidade em SW480 e células cancerígenas do cólon HCT116 utilizando adenoviral de ARN gancho de cabelo curto mediada por vectores (shRNA). Os nossos resultados mostram que, em comparação com a p-catenina knockdown, TCF-4 knockdown de forma mais eficaz de formação de colónias inibida, a apoptose induzida, e aumento da 5-FU e a citotoxicidade mediada por oxaliplatina em células cancerígenas do cólon. Além disso, investigamos os mecanismos envolvidos nas várias eficiências observadas com β-catenina e Tcf-4 knockdown em células cancerígenas do cólon. FOXO4 é um membro da subfamília de factores de transcrição de mamífero forkhead FOXO e desempenha um papel importante no controlo da proliferação celular, apoptose, e a reparação do ADN. Os nossos dados mostraram que o nível de proteína de FOXO4 não se alterou após o tratamento com ambos β-catenina e Tcf-4 shRNA. No entanto, β-catenina shRNA foi encontrado para aumentar a acumulação de fosforilada FOXO4 S193 e diminui a expressão de genes alvo FOXO p27Kip1 e MnSOD, enquanto Tcf-4 shRNA mostrou o efeito oposto. Portanto, em comparação com a p-catenina knockdown, TCF-4 knockdown mostra melhor eficácia para inibir a proliferação e induzir a apoptose de células de cancro colorectal, as quais podem ser relacionadas com a actividade de transcrição aumentou FOXO4. Estes resultados sugerem que a Tcf-4 é um alvo terapêutico potencial atractivo para a terapia do cancro colo-rectal

citação:. J Xie, Xiang D-B, Wang H, Zhao C, Chen J, F Xiong, et ai. (2012) Inibição da Tcf-4 induz a apoptose e aumenta Chemosensitivity de células cancerígenas do cólon. PLoS ONE 7 (9): e45617. doi: 10.1371 /journal.pone.0045617

editor: Wael El-Rifai, Vanderbilt University Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 03 de abril de 2012; Aceito: 23 de agosto de 2012; Publicação: 24 de setembro de 2012

Direitos de autor: © Xie et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiado por subsídios da National Science Foundation Natural da China (No. 30.700.978). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a via canonical sinalização Wnt desempenha um papel central em muitos processos celulares, o desenvolvimento embrionário a partir de tecido adulto homeostase [1]. A actividade desta via de sinalização é determinada pela quantidade de β-catenina presente no citoplasma. Na ausência de sinalização Wnt, citoplasmática β-catenina é normalmente mantida a níveis baixos através contínua degradação da ubiquitina-proteassoma de mediada por β-catenina, que é regulada por um complexo de destruição composto da polipose adenomatosa coli (APC), glicogénio sintase kinase- 3β (GSK-3β), Axin /conductin, caseína quinase 1α (CK1α), e outras proteínas que medeiam estas reacções bioquímicas. A ligação de proteínas Wnt ao Fz complexo receptor de superfície celular /LRP facilita a fosforilação da cauda citoplasmática de proteína relacionada com receptor de LDL (LRP) cauda citoplasmática por GSK-3β [2]. Isto provoca a interacção do complexo Fz /LRP com Dishevelled (Dsh) e Axin, o que leva à inactivação do complexo de destruição, resultando na acumulação de não-fosforilado β-catenina no citoplasma. A β-catenina acumulada em seguida, transloca-se para o núcleo e liga-se a factores de transcrição Tcf /Lef para regular os genes alvo a jusante, tais como c-myc e Ciclina D1 [3] -. [5]

aberrante de Wnt /β sinalização -catenina foi relatada para contribuir para várias doenças humanas, incluindo cancro colo-rectal (CRC) [6], [7]. O gene APC ou o local de fosforilação por GSK-3β dentro do exão 3 de

β-catenina

gene (

CTNNB1

) está mutado em muitas células de cancro, incluindo CRC, resultando na actividade de transcrição activada de sinalização β-catenina /Tcf [8]. Além disso, a translocação nuclear de β-catenina em CRC é significativamente associados com a progressão do tumor e a sobrevivência pobre [9], [10]. Por conseguinte, o controlo de β-catenina e /ou o controlo da sua expressão de genes alvo a jusante representa um alvo ideal para a terapêutica e a quimioprevenção [11] cancerosas, [12], [13] .Van de Wetering

et ai. relataram que knockdown de β-catenina por pequenos ARN interferentes (siRNAs) ou knockdown de TCF-4 por dominante negativo TCF-4 (dnTCF) eficientemente inibida a actividade do TOPFlash TCF-repórter e induziu a paragem do ciclo celular e a paragem do crescimento no cólon LS174T células de câncer [14], [15]. No entanto, Tang

et ai. Relatou que

knockdown de TCF-4 por ARNsi aumento do crescimento de células em DLD-1, células de cancro do cólon [16]. Estas discrepâncias sugerem que diferentes linhas celulares podem responder de forma diferente a TCF-4 knockdown.

FOXO4 é um membro da subfamília de factores de transcrição de mamífero FOXO forkhead [17] que são importantes numa variedade de processos, incluindo a proliferação celular , diferenciação, apoptose, reparo do DNA, e proteção contra o estresse [18]. É um alvo a jusante AKT e torna-se fosforilada na serina e treonina três resíduos altamente conservados (Thr-28, Ser-193 e Ser-258) no momento da activação de PKB /AKT. Estudos recentes têm mostrado que β-catenina se liga ao factor de transcrição FOXO, que desempenha um papel supressor de tumor numa variedade de cancros. β-catenina se liga a FOXO e aumenta a actividade de transcrição [19]. Além disso, a proteína quinase dependente de GMPc (PKG) inibe a sinalização TCF em células cancerígenas do cólon, bloqueando a expressão β-catenina e activando FOXO4 [20]. Portanto, β-catenina parece servir um duplo efeito, equilibrando positiva (através Tcf-4) e negativa (através FOXO4) regulação da proliferação celular e da apoptose.

Neste estudo, a hipótese de que o factor de transcrição a jusante TCF-4 é um alvo terapêutico mais promissora do que a β-catenina para o tratamento de CRC. Nosso objetivo foi comparar os efeitos de Tcf-4 knockdown e knockdown β-catenina na proliferação celular, apoptose e quimio-sensibilidade na SW480 (mutante

APC

, do tipo selvagem

CTNNB1

) e HCT116 (mutante

CTNNB1

, do tipo selvagem

APC

) linhas celulares de cancro do cólon usando short RNA hairpin (shRNA). Nós mostramos que, comparado com beta-catenin knockdown, Tcf-4 knockdown inibe significativamente a proliferação celular, induz a apoptose celular, e melhora a quimio-sensibilidade das células cancerígenas do cólon através da regulação positiva da atividade transcricional FOXO4.

Materiais e Métodos

Cultura de células e Reagentes

SW480 e células HCT-116 foram adquiridos a partir da American Type Culture Collection (Manassas, VA, EUA) e mantidas em RPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS) e 100 L /ml de penicilina e estreptomicina, em condições de cultura padrão. A oxaliplatina, 5-fluorouracilo (5-FU), e tetrazólio metil tiazolilo (MTT) foram adquiridos da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA). O plasmídeo pDC316-EGFP-U6 foi fornecido pela Vector Gene Technology Company Limited (VGTC, Beijing, China) e o plasmídeo pBHGloxΔE1, 3Cre foi fornecida por Microbix Biosystems, Inc. (Microbix, Toronto, Canadá).

adenovírus recombinante vetores

Com base nas sequências de cDNA (

β-catenina

GenBank não.

NM_001098209,

Tcf-4

GenBank não. NM_030756), um par de oligonucleótidos específicos com uma pequena gancho de cabelo e a sua sequência de controlo negativo foram concebidas e sintetizadas, e, em seguida, inserido um pequeno plasmídeo de vaivém pDC316-EGFP-U6 aos locais de enzimas de restrição BamH I e Hind III. Oligonucleotídeos foram concebidos com os seguintes primários [21]:

Encaminhar β-catenina shRNA primário

‘- GATCCCGTGGGTGGTATAGAGGCTCTTCAAGAGAGAGCCTCTATACCACCCACTTTTTGGAAA-3′, inverta β-catenina shRNA primário:. 5’-AGCTTTTCCAAAAAGTGGGTGGTATAGAGGCTCTCTCTTGAAGAGCCTCTATACCACCCACGG-3 ‘;

Encaminhar Tcf-4 shRNA Primer

5′-GATCCCCGGAGCGACAGCTTCATATGTTCAAGAGACATATGAAGCTGTCGCTCCTTTTTGGAAA-3′, inverta Tcf-4 shRNA primário:

5′-AGCTTTTCCAAAAAGGAGCGACAGCTTCATATGTCTCTTGAACATATGAAGCTGTCGCTCCGGG-3;

Controle shRNA:. direcção para a frente

5′-GATCCCCCAGTAACTGAATAGCTACCTTCAAGAGAGGTAGCTATTCAGTTACTGTTTTTGGAAA-3 ‘, direção inversa. 5’-AGCTTTTCCAAAAACAGTAACTGAATAGCTACCTCTCTTGAAGGTAGCTATTCAGTTACTGGGG-3 ‘. O controle shRNA não tem homologia com quaisquer genes humanos relevantes. Todas as construções foram verificadas por sequenciação de ADN. Os plasmídeos resultantes foram vaivém co-transfectado com o plasmídeo de resgate adenovírus pBHGloxΔE1, 3Cre em células 293 para adquirir adenovírus recombinante. eficiência adenovírus recombinante foi detectada através da análise do efeito citopático e expressão EGFP nas células. Os títulos de adenovírus foram medidos após amplificação e purificação utilizando ensaios de TCID50.

Ensaio de formação de colónias

células SW480 foram infectados com o adenovírus recombinantes, durante 90 minutos, e após 24 h, foram semeadas a 300 células /poço em placas de 6 poços e deixadas a aderir durante 24 h. Após a incubação, o meio foi mudado e as placas foram incubadas durante mais 10 dias nas mesmas condições de cultura. As colónias foram fixadas e coradas com 0,1% de violeta cristal em etanol a 100% e, em seguida, contados. Os clones de pelo menos 50 células foram contadas como uma colónia.

Citotoxicidade

SW480 células foram infectadas com os adenovírus recombinantes, durante 90 minutos, e após 24 h, foram colocadas em placas em 96 poços placas a 4000 células /poço. Após 24 h de cultura, as células foram tratadas com as concentrações indicadas de 5-FU ou a oxaliplatina durante 72 h. Em seguida, 20 ul de MTT (5 g /L) foi adicionado a cada poço e incubou-se durante mais 4 h. Os meios de cultura foram, em seguida, descartado, 0,15 mL de sulfóxido de dimetilo (DMSO) foi adicionado, e as placas foram incubadas durante 10 minutos adicionais com vibração. A absorvância foi medida a 490 nm utilizando um leitor de microplacas (modelo 550, Bio-Rad, EUA).

Ensaio de Apoptose

SW480 foram plaqueadas células em placas de seis poços a uma densidade de 0,5 × 10

6 células /poço. Vinte e quatro horas após o plaqueamento, as células a 70% de confluência foram infectadas com adenovírus, durante 90 min e depois lavada para remover os adenovírus. Após uma cultura adicional de 24 h, o índice apoptótico foi avaliada por citometria de fluxo utilizando anexina V-FITC kit como descrito anteriormente [22].

Análise Western Blot

As células foram colhidas e as proteínas totais foram extraídas com inibidores de protease contendo tampão RIPA. Western blot foi realizada tal como anteriormente descrito [22]. Resumidamente, aliquotas iguais de proteína (50 ug) em cada uma das amostras foram resolvidas por electroforese em 10 ou 12% de dodecil sulfato de sódio poliacrilamida gel (SDS-PAGE) e as proteínas foram transferidas para membranas de difluoreto de polivinilideno (PVDF). Após o bloqueio com leite seco não gordo a 5%, as membranas foram incubadas com anticorpos contra a p-catenina (1:5,000), TCF-4 (1:1,000), c-myc (1:2000), ciclina D1 (1: 2000), FOXO4 (1:1000), FOXO4 S193 (1:500), p27Kip1 (1:2000), MnSOD (1:2000), Caspase-3 (1:500), e β-actina (1:3000) . As membranas foram depois incubadas com um anticorpo conjugado com peroxidase de rábano-secundário (1:2000) (Pierce, Rockford, IL, EUA). As proteínas foram detectadas com um sistema de detecção de quimioluminescência aumentada (Pierce), e a emissão de luz foi capturado em filme de raios X Kodak.

A transfecção e Reporter Gene Assay

Para medições de β-catenina /TCF-4 actividade de transcrição, um par de plasmídeos repórter da luciferase (TOPflash /FOPflash; Upstate Biotechnology) foram usadas. O plasmídeo pRL-TK gene repórter de luciferase (Promega) foi co-transfectado para normalizar para a eficiência de transfecção. transfecção transiente foi realizada utilizando Fugene 6 (Roche, Indianapolis, IN, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. As células foram infectadas com os adenovírus recombinantes, durante 90 minutos, e após 24 h, foram subsequentemente co-transfectadas com o repórter luciferase TOPflash (ou mutante controlo FOP flash de vector) e pRL-TK. Depois de uma incubação adicional de 24 h, as células foram recolhidas para medição da actividade de luciferase utilizando o sistema de ensaio de repórter de luciferase dupla (Promega). Três experiências duplicadas foram realizadas.

Análise Estatística

Os dados foram expressos como a média ± desvio padrão (DP). A significância estatística das diferenças foi determinado por uma análise forma da variância (ANOVA) utilizando o software v12.0 SPSS (SPSS, Chicago, Illinois, EUA). Um valor de

P

. 0,05 foi considerado estatisticamente significativo

Resultados de

1. Knockdown de TCF-4 ou β-catenina por transdução mediada por adenovirus dos shRNA

Para a expressão de knockdown Tcf-4 ou β-catenina, vectores adenovirais foram gerados para expressar um shRNA segmentação Tcf-4 ou β- catenina. A análise Western blot revelaram uma diminuição dependente da dose, na expressão da proteína Tcf-4 ou β-catenina às 48 h pós-infecção com os respectivos vectores adenovirais em células SW480 e HCT116, enquanto nenhuma alteração na expressão da proteína foi observada após a infecção com um adenovirus contendo mexidos shRNA (Fig. 1).

SW480 e células HCT116 foram tratadas com diferentes multiplicidade de infecção (MOI) de adenovírus realização shRNA. As amostras foram coletadas em 48 h após a infecção. A análise Western blot dos lisados ​​celulares para a expressão da proteína de β-catenina (a) e Tcf-4 (b).

2. Tcf-4 Knockdown Suprime Wnt Signaling

SW480 e linhas de células HCT116 têm atividade constitutivamente ativo β-catenina /Tcf-4 da transcrição. Portanto, as células foram transfectadas transitoriamente com um plasmídeo repórter TCF, TOPflash, que consiste em três TCF locais a montante de um promotor mínimo de TK e a luciferase de quadro de leitura aberto, ou plasmídeo de controlo, FOPflash, que é idêntico ao TOPflash excepto que ele contém mutante de ligação locais de ligação TCF inactivas. A Figura 2a mostrou que tanto β-catenina shRNA e Tcf-4 shRNA marcadamente suprimida a actividade endógena β-catenina /TCF-4 transcrição em comparação com o controlo de shRNA em ambas as linhas de células SW480 e HCT116.

Células

SW480 e HCT116 foram tratados com adenovírus (MOI 50) que transportam shRNA. um, às 24 h pós-infecção, as células foram co-transfectadas com genes repórter abrigando locais TCF-4 de ligação (TOPflash) ou um local de ligação a Tcf mutante (FOPflash), respectivamente, em conjunto com pRL-TK. A actividade de luciferase foi determinada 24 h pós-transfecção, normalizados contra os valores para a actividade de pRL-TK correspondente. Os valores representam médias ± S.D. de três experiências independentes. *

P Art 0,01 versus controlo shRNA. b, às 48 h após a infecção, as células foram colhidas e expressão da proteína foi determinada por western blot.

A ciclina D1

e

c-Myc

são conhecidos β-catenina /TCF-4 genes alvo, e, por conseguinte, também investigamos a expressão de proteínas de ciclina D1 e c-Myc por transferência de western. A Figura 2b mostra que β-catenina ou shRNA Tcf-4 shRNA tratamento resultou numa diminuição acentuada na Ciclina D1 e proteína c-Myc em ambas as células SW480 e HCT116.

3. TCF-4 knockdown Melhora FOXO4 Actividade

Para analisar o nível de proteína e activação da proteína FOXO4, células SW480 e HCT116 foram cultivadas durante 48 h após a infecção com adenovírus, e o nível de proteína foi avaliada por Western blot. O nível de proteína de FOXO4 não foi alterado significativamente após tratamento com β-catenina ou shRNA Tcf-4 shRNA (Fig. 3). No entanto, o nível de proteína fosforilada FOXO4 S193 foi marcadamente aumentada após o tratamento com β-catenina shRNA, e diminuíram após o tratamento com a Tcf-4 shRNA (Fig. 3). Os níveis de genes alvo FOXO p27Kip1 e MnSOD de expressão foram acentuadamente reduzidas após tratamento com β-catenina shRNA e aumentou após o tratamento com a Tcf-4 shRNA (Fig. 3).

SW480 e células HCT116 foram tratados com adenovírus ( 50 MOI) transportando shRNA. As amostras foram coletadas em 48 h após a infecção. O nível de proteína de FOXO4, fosforilada FOXO4 S193, p27Kip1 e MnSOD foi determinada por western blot.

4. Tcf-4 Knockdown inibe a proliferação celular e induz a apoptose em células celular câncer colorretal

A seguir, investigou o efeito da Tcf-4 knockdown na proliferação celular e apoptose em SW480 e células HCT116. A proliferação celular foi determinada utilizando um ensaio de formação de colónias. Tal como mostrado na Figura 4a, TCF-4 knockdown induziu uma inibição significativamente mais forte de proliferação de células em comparação com a p-catenina em ambos knockdown SW480 e células HCT-116 (P 0,05, P 0,01, respectivamente). Para investigar se a inibição do crescimento Tcf-4-shRNA mediada está associada com apoptose, tratadas e células não tratadas foram analisadas por citometria de fluxo. Como se mostra na Figura 4b, ambos β-catenina shRNA e Tcf-4 shRNA induziu um aumento significativo no número de células apoptóticas em comparação com células não tratadas e de controlo shRNA grupos tratados (p 0,01), e Tcf-4 shRNA induziu um número maior células de apoptose do que a p-catenina shRNA (p 0,01). A enzima pró-apoptóticas caspase-3 é activado num ponto de convergência entre os percursos de indução de apoptose intrínsecos e extrínsecos [23]. Assim, examinamos a clivagem de caspase-3 como um marcador de apoptose. Consistente com a citometria de fluxo descobertas, TCF-4 shRNA induziu um aumento maior na clivagem de caspase-3 em comparação com a p-catenina shRNA (Fig. 4c).

As células foram tratadas com adenovírus (MOI 50) que transportam para shRNA 24 h. A, A proliferação celular foi determinada utilizando um ensaio de formação de colónias. b, apoptose celular foi determinada utilizando a coloração de anexina V-FITC. C, a expressão de pró-apoptótica enzima caspase-3 foi determinada por Western blot. Cada ponto de dados representa a média ± S.D. de três ou mais independentes determinações. *

P Art 0,01 versus controlo shRNA;

#

P Art 0,05 em relação β-catenina shRNA;

##

P

. 0,01 versus β-catenina shRNA

5. TCF-4 knockdown Melhora Chemosensitivity em células de cancro colorectal

SW480 e HCT116 células foram pré-tratadas com os adenovírus recombinantes que transportam o respectivo shRNA e foram então tratadas com 5-FU ou oxaliplatina a várias concentrações durante 72 h. A viabilidade celular foi determinada utilizando um ensaio MTT. Como mostrado na Figura 5, β-catenina tratamento shRNA aumentou 5-FU e a citotoxicidade mediada por oxaliplatina. Além disso, TCF-4 tratamento de shRNA resultou num aumento mais significativo da citotoxicidade em relação a p-catenina tratamento shRNA em cada ponto de concentração de 5-FU e oxaliplatina (p 0,01).

As células foram infectadas com adenovirus (MOI 50) transportando shRNA; 48 h pós-infecção, as células foram tratadas com 5-FU ou oxaliplatina a várias concentrações durante 72 h. A viabilidade celular foi determinada utilizando um ensaio MTT. Os gráficos de barras representam os valores médios de determinações em triplicado ± sd

Discussão

O câncer colorretal (CRC) é um dos tumores malignos mais comuns do adulto que ocorrem em todo o mundo em termos de morbidade e mortalidade . Apesar das melhorias no tratamento médico, os resultados do tratamento para a doença localmente avançada e metastático continua a ser decepcionante, com taxas de sobrevida em 5 anos inferior a 10% em pacientes com metástase. sinalização via Wnt aberrante é um evento precoce em progressão de 90% de CRC. Ela ocorre por meio de mutações, principalmente, de

APC

(até 80%) e menos frequentemente do

β-catenina

(cerca de 10%) ou AXIN2 [24]. Mutações no

APC /Tablet genes β-catenina, o que resulta na activação aberrante da β-catenina /TCF-4 via, são comuns em CRC, sugerindo que a inibição direccionada desta via pode ser uma abordagem terapêutica potencial para controlar CRC. Nós e outros autores relataram anteriormente que os compostos naturais e fármacos anti-inflamatórios não-esteróides (NSAID) inibem a via Wnt /β-catenina sinalização [22], [25], [26], [27], [28]. No entanto, não existe actualmente nenhum inibidor selectivo para esta via disponível como um agente terapêutico. Estudos recentes têm mostrado que shRNA mediada por silenciamento do gene de β-catenina inibe significativamente a proliferação celular e induz a apoptose de células em células de cancro do cólon humano [29], [30], [31].

No presente estudo, focamos especificamente em comparar as eficácias de knockdown β-catenina e Tcf-4 knockdown em células de câncer de cólon, e investigados os possíveis mecanismos moleculares responsáveis ​​por esses efeitos. Mostrámos que Tcf-4 knockdown induz uma inibição significativamente mais forte da proliferação celular, indução de apoptose, e aumento da quimio-sensibilidade em células de cancro de cólon em comparação com a p-catenina knockdown

Activado β-catenina /TCF-4. sinalização por acumulação de β-catenina no núcleo tem sido implicado na carcinogénese humana, incluindo CRC. Esta acumulação pode resultar da mutação de um ou outro gene supressor de tumor

APC

ou

β-catenina

si. Pelo menos 60% dos casos esporádicos CRC contêm uma mutação APC, e quase metade deles apresentar alterações em ambos os alelos APC, [33], [34] [32]. No presente estudo, foi conduzido um estudo mecanicista detalhada para avaliar a eficácia de inibição da β-catenina /TCF-4 de sinalização na CRC humano utilizando a linha de células de CRC SW480 humano, o qual contém a APC mutante e de tipo selvagem β-catenina, e a linha de células HCT116, que abriga mutante β-catenina e da APC do tipo selvagem. O primeiro construídos vectores adenovirais que transportam β-catenina humano ou TCF-4 shRNA, a fim de knockdown da expressão de β-catenina ou TCF-4. A análise Western blot revelaram uma diminuição dependente da dose na Tcf-4 ou a expressão da proteína β-catenina em células SW480 e HCT116 às 48 h pós-infecção com os respectivos vectores adenovirais. Além disso, tanto β-catenina shRNA e Tcf-4 shRNA marcadamente suprimida /actividade β-catenina Tcf-4 transcricional, assim como a expressão de dois genes alvo conhecido, a ciclina D1 e c-Myc, em SW480 e células HCT-116. Estes dados indicam que tanto knockdown β-catenina e Tcf-4 knockdown suprimir a atividade /β-catenina Tcf-4

in vitro

.

A coordenação entre proliferação celular e apoptose desempenha um papel muito importante na carcinogênese e desenvolvimento de câncer de cólon. A β-catenina /Tcf-4 via é uma via importante de sinalização que inclina a balança da proliferação celular e apoptose em células cancerosas. No nosso estudo, β-catenina knockdown proliferação celular e inibiu a apoptose celular induzida em ambas as células SW480 e HCT116. Em comparação com knockdown β-catenina, TCF-4 knockdown induziu uma significativamente maior de inibição da proliferação das células e indução de apoptose. Além disso, descobrimos que a Tcf-4 knockdown aumentou significativamente a quimiossensibilidade de ambas as células SW480 e HCT116 a 5-FU e oxaliplatina.

Além disso, investigamos os mecanismos envolvidos nas eficácias diferenciais de knockdown β-catenina e Tcf- 4 knockdown em células SW480 e HCT116. Os nossos dados mostraram que o nível de proteína de FOXO4 não se alterou após o tratamento com ambos β-catenina e Tcf-4 shRNA. No entanto, β-catenina shRNA foi encontrado para aumentar a acumulação de fosforilada FOXO4 S193 e diminui a expressão de genes alvo FOXO p27Kip1 e MnSOD, o que é consistente com um relatório anterior que mostra que β-catenina específico siARN inibiu a actividade repórter TCF e FOXO- sinalização dependente em células cancerígenas do cólon LS174 [19]. Em contraste, TCF-4 shRNA mostraram o papel regulador oposto a p-catenina em FOXO4. Estes achados sugerem que β-catenina shRNA induzida por down-regulação da sinalização dependentes de FOXO4 é independente sobre Tcf-4.

fatores FOXO desempenham um papel importante no controle da proliferação celular, apoptose, e estresse oxidativo [17]. [18]. Suas funções são regulados por múltiplas vias de sinalização, incluindo AKT. Na ausência de activação AKT, FOXO4 está localizado no núcleo, onde funciona como um factor de transcrição [35]. Após a activação AKT, FOXO4 torna-se fosforilada na serina e treonina três resíduos altamente conservados (Ser-193, Tre-28, e Ser-258), seguido de inactivação e exclusão nuclear [36]. Essers et ai. [19] mostrou que não havia a interacção funcional entre β-catenina e FOXO no stress oxidativo sinalização, e β-catenina específico shRNA reduzida TCF e FOXO actividade de transcrição em células de cancro do cólon LS174T, que expressam uma forma mutante de β-catenina. Acumulando evidências sugere que os factores FOXO funcionar como supressores de tumor em uma variedade de cancros. Tang et al. [37] também descobriram que FOXO4 inibiu a expressão de HIF-1α e VEGF nas células cancerosas. Além disso, um estudo recente mostrou que a sobre-expressão do tipo selvagem FOXO4 conduziu a um aumento na citotoxicidade mediada por doxorrubicina em células de cancro do cólon HCT116, que foi ainda agravada por sobre-expressão de um mutante FOXO4 localizada exclusivamente no núcleo [38].

por isso, os autores sugerem que a supra-regulação de actividade FOXO4 é responsável pela maior eficácia de TCF-4 shRNA efeitos em células de cancro de cólon em comparação com a p-catenina shRNA. Por um lado, Tcf-4 e FOXO4 pode estar competindo por β-catenina [19]. Quando a sinalização Tcf é inibida, β-catenina se liga directamente a FOXO4 e aumenta a actividade transcricional FOXO4. Por outro lado, TCF4 knockdown pode regular negativamente a certas vias de sinalização, tais como Akt. Um relatório recente mostra que uma redução significativa dos níveis de Akt2 e fosforilação de Akt foi detectada após knockdown de TCF-4, utilizando Tcf-4 siRNA em células de glioma [39]. Portanto, a inactivação da Akt por Tcf-4 resultados shRNA em desfosforilação de FOXO4, o que consequentemente activa a sinalização dependente de FOXO.

Em conclusão, temos demonstrado que tinha como alvo a inibição da β-catenina /Tcf-4 sinalização inibe celular proliferação, induz a apoptose, e aumenta a quimio-sensibilidade das células cancerígenas do cólon. Além disso, em comparação com a p-catenina knockdown, TCF-4 knockdown mostrou maior eficácia para inibir o crescimento de células de CRC e induzindo a apoptose, a qual pode estar relacionada com um aumento da actividade transcricional FOXO4. Estes resultados sugerem que a Tcf-4 pode ser um alvo terapêutico atractivo para a terapia de CRC. Futuros estudos são necessários para confirmar esses resultados e verificar a utilidade da segmentação Tcf-4.