Abstract

Apesar de gemcitabina é altamente ativo em vários tipos de câncer, intrínseca e adquirida resistência aos medicamentos continua a ser um grande desafio . A sobre-expressão de Bcl-2 tem sido associada com a resistência a gemcitabina. O objetivo deste estudo é determinar se gossipol pode superar a resistência gemcitabina em linhas de células com alto nível de Bcl-2 expressão em terapia de combinação de fármacos. O nosso estudo mostrou que, em 10 linhas celulares derivadas de cancros diferentes, elevada expressão de Bcl-2 de linha de base foi observada em linhas de células que eram resistentes a gemcitabina (GEM-R). Além disso, foi observado efeito sinérgico da terapia combinada em linhas de células resistentes à gemcitabina (GEM-R) com elevada expressão de Bcl-2, mas não de uma sensível ao gemcitabina linhas celulares (GEM-S), independentemente da expressão de Bcl-2. Gossipol tratamento resultou na diminuição de genes anti-apoptóticos tais como Bcl-2 e Bcl-XL e uma regulação positiva do gene de pró-apoptótica, Noxas. Além disso, a adição de gossipol a gemcitabina resultou em expressões mais baixos de genes anti-apoptóticos em comparação com gemcitabina sozinha. perfil de expressão gênica em GEM-R e linhas celulares GEM-S sugerem que os genes anti-apoptóticos tais como pAkt e PI3KR2 podem desempenhar papel importante na resistência gemcitabina, enquanto pró-apoptóticos Bcl-2 genes relacionados (Bad, Caspase-6 e Calpain- 1) pode regular a interação sinérgica em terapia de combinação

Citation:. Wong FY, Liem N, Xie C, Yan FL, Wong WC, Wang L, et al. (2012) terapia de combinação com Gossypol revela sinergia contra a resistência gemcitabina em células cancerosas com alta BCL-2 Expressão. PLoS ONE 7 (12): e50786. doi: 10.1371 /journal.pone.0050786

editor: Joseph Alan Bauer, Bauer Research Foundation, Estados Unidos da América

Recebido: 06 de julho de 2012; Aceito: 24 de outubro de 2012; Publicação: 04 de dezembro de 2012

Direitos de autor: © 2012 Wong et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho é apoiado por subsídio NMRC /TCR /001-NUH /2007 do Conselho de Investigação médica Nacional, Cingapura. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

gemcitabina (2 ‘, 2’-difluorodesoxicitidina, dFdC) é um análogo de nucleósido de pirimidina de desoxicitidina comumente usado nos cancros da mama [1], do pulmão de células não pequenas [2], pancreático [3] e do ovário [ ,,,0],4]. A gemcitabina entra na célula através de transportador nucleósido específico e sofre phospharylation intracelular de se converter em metabolitos de drogas activas. Uma vez dentro da célula, a gemcitabina é fosforilado por cinases desoxicitidina que então incorporar em DNA para inibir a síntese e a proliferação de células, enquanto se promove a apoptose em células cancerosas [5]. A sobre-expressão de genes anti-apoptóticos, como os da família Bcl-2 desempenham um papel crítico no que confere resistência a terapias anticancro convencionais [6], [7], [8]. Por exemplo,

Yu et ai

demonstrou uma correlação inversa entre a expressão de Bcl-2 e a quimiossensibilidade a várias drogas incluindo adriamicina e 5-fluorouracilo em células de cancro da mama. [9].

In vitro

linhas de células cultivadas derivadas de tumores de HCC primários que expressam elevados níveis dos anticorpos anti-apoptótica de Bcl-2 e Bcl-XL também foram encontrados para serem resistentes ao paclitaxel [10]. A regulação da família Bcl-2 tem sido implicado na resistência intrínseca gemcitabina em cancros pancreáticos e pulmonares [11], [12]. células de cancro pancreático que adquiriram resistência a droga após gemcitabina continuamente exposta a gemcitabina tinha a sobre-regulação dos genes anti-apoptóticos tais como Bcl-XL e Mcl-1 [13]. Estes achados sugerem que o nível elevado de família Bcl-2 pode desempenhar um papel importante no desenvolvimento de resistência a gemcitabina durante a quimioterapia.

Gossipol é um composto polifenólico isolado a partir da planta de algodão (

Gossypium Malvaceae

). Inicialmente, utilizada como um agente de controlo da fertilidade masculina, foi recentemente descoberto que têm propriedades anti-tumorgenic em uma variedade de cancros [14]. Gossipol existe em duas formas enantioméricas, (+) e (-), e de ocorrência natural gossipol existe como uma mistura racémica de (+) e (-) enantiómeros. O enantiómero (-) do Gossipol foi reconhecida como tendo efeito citotóxico mais potente que o enantiómero (+) ou racémico gossipol. Gossipol é um mimético de BH3 que inibe a função das proteínas anti-apoptóticas Bcl-2 por meio de interacções com os bolsos de BH3-ligação de Bcl-2 e Bcl-XL proteínas [15]. Vários estudos in vitro têm relatado que gossipol poderiam inibir o crescimento celular em uma ampla gama de cancros incluindo os do cólon [16], da próstata [17], do pulmão [18], e tumores da mama [19]. Em células de cancro da próstata PC-3, gossipol apoptose induzida por inibição da heterodimerização de Bcl-2 /Bcl-XL complexo [17]. A indução da apoptose por meio de gossipol também foi observado por a regulação das proteínas anti-apoptóticas da família Bcl-2 em HT-29 do cancro do cólon e da leucemia linfocítica crónica [16], [20]. Além disso, gossipol tem a capacidade de ultrapassar a resistência da droga a outros fármacos quimioterapêuticos convencionais. Gossipol foi mostrado para induzir eficazmente morte celular em linhas de células de leucemia quimiorresistentes que sobre-expressam Bcl-2 e Bcl-XL [21]. Tinha sido relatado que poderia gossipol induz apoptose com eficiência elevada em linhas celulares de cancro da cabeça e pescoço resistentes à cisplatina que expressam elevados níveis de Bcl-XL. [22]. Cengiz E et al. observada apoptose que o tratamento combinado de gossipol e docetaxel pode sinergicamente induzidos em PC-3, linha celular de cancro da próstata [23]. Estes estudos sugeriram que a combinação de gossipol com outros fármacos podem melhorar a eficiência da indução de apoptose em terapia do cancro.

Os objectivos deste estudo foram (1) correlacionar a expressão da proteína Bcl-2 com resistência gemcitabina (jóia- R) em gástrica, linhas celulares de nasofaringe e cancro da mama, (2) avaliar a combinação de gemcitabina e gossipol em linhas celulares de cancro GEM-R com elevado nível de Bcl-2 expressão e (3) determinar os mecanismos envolvidos na reversão da resistência a gemcitabina pela gossipol.

Materiais e Métodos

linhas de células e reagentes

linhas celulares de cancro nasofaríngeo CNE1, CNE2, HONE1 foram todas derivadas de tumores de NPC chineses indiferenciadas, enquanto HK1 era de uma bem diferenciadas NPC chinês [24], [25]; linhas celulares de cancro da mama SKBR3, T47D, MCF-7 e de células de cancro gástrico linhas AGS, SNU1 foram adquiridas a partir da ATCC, EUA; enquanto YCC16 foi obtido a partir de Duke NUS, Singapura, Todas as linhas celulares foram cultivadas a 37 ° C em atmosfera humidificada contendo 5% de CO

2 e mantidas em meio RPMI 1640 (Gibco, Grand Island, NY) contendo 10% inactivado pelo calor fetal de soro de bovino (Gibco; Grand Island, NY) e 1% de penicilina /estreptomicina (Gibco, Grand Island, NY). Mycoplasma estado das células foi testado rotineiramente usando MycoAlert Mycoplasma Detection Kit ™ (Lonza, ME, EUA). status de Mycoplasma de todas as linhagens de células desenvolvidas neste estudo foram negativos. Gossipol (Sigma-Aldrich; St Louis, MO), e gemcitabina (Sigma-Aldrich; St Louis, MO) foram dissolvidos em DMSO a uma concentração de 10 mM e armazenados a -20 ° C. AT-101 foi fornecido por Ascenta Therapeutics e preparado como estoque 10 mM com DMSO. Os anticorpos primários consistindo de anti-caspase-6, anti-Bcl-xl e anti-Bad, anti-Bak, anti-Bax, anti-pAKT, anti-PIK3R2, anti-calpaina-1 e anti-actina foram adquiridos a partir de Cell Signaling tecnologia (Cell Signaling, MA, EUA). Primária anti-Noxas foi adquirido de Calbiochem (Merck; Alemanha); e anti-Bcl-2 e anti-Mcl-1 foi adquirido da Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz Biotechnology; CA, EUA). anticorpos secundários (IgG anti-coelho, ligado a HRP e anti-IgG de ratinho, ligado a HRP) foram adquiridos a partir de tecnologia de sinalização celular (Cell Signaling, MA, EUA)

A viabilidade celular e a proliferação Ensaios

.

Para avaliar a quimio-sensibilidade de células de tumor, a viabilidade celular foi medida pela MTS (CellTiter 96 AQ Colorimétrico

ueous Uma solução de células Ensaio de Proliferação) (Promega; WI, EUA). A suspensão de células foi cultivada em placas de 96 poços de microtitulação de fundo plano a uma concentração de 2 x 10

3 células /por cavidade e incubadas durante a noite. Os tratamentos medicamentosos foram realizados como se segue: gossipol (0,1 uM -100 uM), a gemcitabina (0,001 uM-100 uM) ou uma combinação de ambos os fármacos em concentrações varia. Cada droga foi testada em triplicado. As placas foram incubadas a 37 ° C numa atmosfera humidificada contendo 5% de CO

2 durante 72 h. Os poços de microtitulação contendo as células tumorais sem nenhuma droga tratamentos foram utilizados como controlos, e os poços contendo apenas meio completo foram usados ​​como controlos em branco para a redução do corante não específico. As células foram incubadas durante 72 h antes da adição de solução de MTS (1 mg /mL por poço) e a absorvância foi lida a 490 nm utilizando um leitor de microplacas espectrofotométrico (Bio-Rad; CA, EUA). A viabilidade celular por cento, para diferentes concentrações de fármaco foi calculada como a taxa de inibição de (a absorvância dos poços tratados significar /absorvância de poços de controlo média) x 100%. IC

50 foi calculada pela GraphPad Prism v4.0 (GraphPad Software, Inc, CA, EUA).

Combinação Índice Análise

A interacção entre gencitabina e gossipol foi analisada com o software CalcuSyn (Biosoft, Cambridge, Reino Unido) como descrito anteriormente [26]. Resumidamente, o rácio de concentração constante de gemcitabina e gossipol a 0,25x, 0,5x, 1x, 2x e 4x foi utilizado para avaliar a sinergia de tratamento de combinação. Os valores IC foram calculados de acordo com os níveis de inibição do crescimento (fração afetado) por cada agente individualmente e combinação de gemcitabina com gossipol. índice de combinação foi calculada para ilustrar sinergismo (CI 0,9), o antagonismo (CI 1,1). e aditiva (IC = 0,9-1,1)

Estatísticas de Análise Ensaio MTS

Os incrementos de dosagem foram log-transformados, permitindo igual espaçamento horizontal de pontos de dados na curva de resposta à dose. curva de ranhura foi representada graficamente a partir de análise de spline /LOWESS ajuste por GraphPad Prism v4.0 e a concentração resultou em morte celular de 50% foi determinado a partir da curva gerada. IC

50 foi calculada pela antilog o valor obtido. Todos os dados são apresentados como média ± erro padrão (EP) a partir de pelo menos duas experiências independentes.

Western Blot e análise de proteínas

As células tratadas com droga foram lavadas com PBS gelado e ressuspensas em lise tampão (CelLytic; Sigma-Aldrich; St Louis, MO) na presença de um cocktail inibidor de protease (Roche; Mannheim, Alemanha). Os lisados ​​foram sonicadas, incubadas em gelo durante 20 min e centrifugada a 14000 rpm durante 20 min a 4 ° C. As concentrações de proteína foram determinadas usando o ensaio de Bradford (Bio-Rad, CA, EUA). 20 ^ g de amostras de proteína foram separados por electroforese em 12% SDS-PAGE e electrotransferidas para uma membrana de PVDF (Immun-Blot de PVDF; Bio-Rad, CA, EUA). As membranas foram bloqueadas durante uma hora à temperatura ambiente em leite seco não gordo a 5% (Bio-Rad; CA, EUA) e subsequentemente incubadas com anticorpos primários durante a noite a 4 ° C. Os respectivos anticorpos primários foram utilizados como se segue: anti-Bcl-XL (Cell Signaling, MA, EUA) a uma diluição 1:1000, anti-Bad (Cell Signaling, MA, EUA) a 1; 1000 de diluição, anti-Bak (celular sinalização; MA, EUA) 1:1000 diluição, anti Bax-(Cell Signaling, MA, EUA) 1:3000 diluição, anti-caspase-6 (Cell Signaling, MA, EUA) 1:1000 diluição, anti-P1K3R2 (Cell sinalização; MA, EUA) 1:1000 diluição, anti pAKT-(Cell Signaling, MA, EUA) a 1:1000 diluição, anti-calpaína-1 (Cell Signaling, MA, EUA) a 1:1000 diluição, anti-actina (carregamento de controlo; Cell Signaling, MA, EUA) em 1:3000 de diluição, anti-Bcl-2 (Santa Cruz Biotechnology; CA, EUA) 1:3000 diluição, e anti-Mcl-1 (Santa Cruz Biotechnology; CA, EUA ) em 1:3000 diluição, e anti-Noxas (Calbiochem, Merck; Alemanha) 1:1000 diluição. Após três lavagens com Tween 20 em PBS, as membranas foram incubadas durante 1 h à temperatura ambiente com os anticorpos secundários anti-coelho e anti-murganho conjugadas com peroxidase de rábano correspondente. As membranas foram lavadas quatro vezes com PBS /Tween 20, e os sinais foram visualizados por ECL reagente (Sistema AmershamTM ECL Além disso Western Blotting Detection; GE Healthcare; Buckinghamshire, Reino Unido), seguido por exposição a filme de quimioluminescência (Amersham HyperfilmTM ECL; GE Healthcare ; Buckinghamshire, Reino Unido). análises de imunotransferência foram repetidas pelo menos duas vezes para cada proteína testada.

Arrays Gene Expression

todo o genoma expressão profiling de 2 linhas celulares de cancro (CNE2 e SNU1) foram realizadas usando o HumanHT-12 todo o genoma expressão do gene ensaio de hibridização direta v4 (Illumina, San Diego, EUA). O ARN total a partir de células tratadas com fármaco foi extraído usando o reagente TRIzol (Invitrogen, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. As amostras de ARN foram quantificados utilizando um espectrofotómetro de ND-1000 (Thermo Fisher Scientific, EUA) e avaliadas para a degradação usando o Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, EUA) antes de análise de expressão do gene matriz. O ARN total (500 ng) foi convertido em cDNA, seguido de um

In vitro

transcrição de ARNc marcado com biotina a síntese utilizando o kit de amplificação de ARN IIumina® TotalPrep (Illumina, San Diego, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. Labeled ARNc foram ressuspensas com reagentes de hibridação e hibridado com a HumanHT-12 V4 BeadChips durante 18 horas em 58 ° C forno de hibridação. Os BeadChips foram lavadas, bloqueadas e coradas para se preparar para a digitalização. A intensidade da fluorescência para cada sonda foi digitalizado utilizando o Illumina BeadArray Reader. Três experimentos independentes foram conduzidos para cada amostra.

Seleção Estatístico de pós-tratamento de genes diferencialmente expressos

diferencialmente expressam genes entre os grupos de tratamento da toxicodependência (gemcitabina e combinação de gemcitabina e gossipol) nos dois linhas celulares (CNE2 e SNU1, respectivamente) foram determinar com base na metodologia discutido em Wong et.al [27]. Para cada gene, o ANOVA de uma via é primeiramente aplicado para testar as diferenças entre as médias dos dois grupos de tratamento a um nível de significância de 0,05. Se a hipótese nula é rejeitada, o teste post-hoc de Dunnett foi realizado para determinar as diferenças entre quaisquer duas comparações na taxa de erro família-wise de 0,05. As comparações são (i) o controlo (sem tratamento) versus tratamento gemcitabina e (ii) o controlo versus o tratamento de combinação. Um gene é expresso diferencialmente marcado (para cima ou para baixo-regulado) se, pelo menos, uma de comparação é detectado pelo procedimento post-hoc. As listas de genes diferencial a partir de cada linha celular foram sobrepostas e mapeado para vias KEGG como previamente descrito na base de dados DAVID [28]. valor de atenuação de 0,1 foi criado para determinar a significância do enriquecimento gene prazo no sistema de anotação DAVID. Uma lista gene de 14065 e 11342 genes diferencialmente expressos de ambas as linhas celulares foram selecionados para uma avaliação mais aprofundada.

Resultados

Sensibilidade de linhas celulares de cancro a gemcitabina em Relacionamento com Bcl-2 Expressão

Quatro linhas celulares de cancro nasofaríngeo (CNP) foram tratados com várias concentrações de gemcitabina (0,001 a 100 uM) para avaliar a quimiossensibilidade de gemcitabina. Houve uma larga gama na IC

50 sensibilidade de gemcitabina em que CNE2 foi encontrado para ser resistente a gemcitabina, com IC

50 mais de 100 uM (Figura 1A) e HK1 foi encontrada para ser mais sensível a gemcitabina. Para investigar se a resistência gemcitabina está relacionado com a elevada expressão de Bcl-2, foi examinada a expressão da linha de base de Bcl-2 em todas as linhas celulares de NPC. Observou-se que a linha celular que tinha elevada expressão de Bcl-2 (CNE2, Figura 1B) era resistente a gemcitabina. A associação entre a resistência gemcitabina e expressão de Bcl-2 foi ainda analisada em 3 linhas celulares de cancro da mama e 3 célula cancerosa gástrica de forma consistente, MCF-7, linha celular de cancro da mama e linha celular de cancro gástrico YCC16 que teve alta expressão de Bcl-2 eram resistentes à gemcitabina (Figura 2 e 3). Com a excepção de SNU1, baixo nível ou nenhuma expressão de Bcl-2 foram encontrados em linhas de células que eram sensíveis a gemcitabina.

(A) IC

50 de gemcitabina de linhas celulares de cancro da nasofaringe. A média de IC

50 ± Erro Padrão (SE) de pelo menos duas experiências independentes foram realizados em triplicado. As células foram tratadas com gemcitabina, durante 72 h e a proliferação celular foi avaliada utilizando o ensaio de MTS. (B) Immunoblot de Bcl-2 expressão de base em linhas celulares de cancro da nasofaringe.

(A) IC

50 de gemcitabina de linhas celulares de cancro da mama. A média de IC

50 ± Erro Padrão (SE) de pelo menos duas experiências independentes foram realizados em triplicado. As células foram tratadas com gemcitabina, durante 72 h e a proliferação celular foi avaliada utilizando o ensaio de MTS. (B) Immunoblot de Bcl-2 expressão basal em linhas celulares de cancro da mama.

(A) IC

50 de gemcitabina de linhas celulares de cancro gástrico. A média de IC

50 de ± Erro Padrão (SE) de pelo menos duas experiências independentes foram realizados em triplicado. As células foram tratadas com gemcitabina, durante 72 h e a proliferação celular foi avaliada utilizando o ensaio de MTS. (B) Immunoblot de Bcl-2 expressão de base em linhas celulares de cancro gástrico.

Semelhante resposta à droga de linhas celulares de cancro entre Gossypol e AT101

Três linhas celulares de cancro gástrico (AGS, YCC16 e SNU1) foram tratados com gossipol e AT101 para determinar o seu IC

50, respectivamente. Como esperado, (-) – Gossipol foi mais potente do que o Gossipol racémica mas foram em geral menos do que diferenças em 10FOLD IC

50 entre as duas drogas em linhas de células gástricas. Todos subsequente estudos in vitro foram realizadas utilizando o gossipol racémica (Tabela 1) como havia pouca diferença na citotoxicidade celular usando qualquer um dos fármacos. Gossipol foi encontrada para ter uma actividade moderada em todos os dez linhas de células (Figura 4). Ao contrário de gemcitabina, não houve associação clara entre o nível de expressão de Bcl-2 nas linhas de células ao IC

50 do fármaco.

nasofaríngeo (n = 4), mama (n = 3) e gástrica (n = 3) linhas celulares de cancro foram testados quanto à sua sensibilidade ao gossipol. A média de IC

50 de ± Erro Padrão (SE) de pelo menos duas experiências independentes foram realizados em triplicado. As células foram tratadas com gossipol durante 72 horas e proliferação celular foi avaliada utilizando o ensaio MTS.

sinérgica interação medicamentosa entre Gossypol e gemcitabina na gemcitabina-resistência (GEM-R) Linha celular com alta Bcl-2 Expressão

Para determinar a possível interação sinergismo entre gossipol e gemcitabina, o tratamento medicamentoso combinação foram realizadas em todas as linhas de células 10 cancro. Com a excepção de SNU1, o sinergismo foi observada nas linhas celulares que tinham elevada expressão de Bcl-2, mas não em linhas celulares que expressavam baixo Bcl-2 (Tabela 2, Figura S1). Colectivamente, estas observações sugerem que existe uma tendência em que as linhas celulares resistentes a gemcitabina que expressavam elevado nível de Bcl-2 são sinérgicos para os tratamentos de combinação de fármacos com gemcitabina e gossipol.

A reversão de resistência gemcitabina por Gossipol foi associado com aumento da regulação do Noxa e Down-regulação do Bcl-2 e Bcl-xl

Para investigar os mecanismos moleculares subjacentes à interacção sinérgica entre gossipol e gemcitabina, examinamos as mudanças da pró-apoptótica e anti- proteínas apoptóticos Bcl-2 em linhas celulares de expressão elevada GEM-R (YCC16, CNE2 e MCF7). Como mostrado na Figura 5, as proteínas anti-apoptóticas (Bcl-2 e /ou Bcl-xl) foram regulados positivamente em todas as linhas de Bcl-2 que sobre-expressam células GEM-R, após o tratamento gemcitabina. Em contraste, o tratamento com gossipol levou à diminuição da regulação de proteínas anti-apoptóticas (Bcl-2 e /ou Bcl-XL) e a regulação positiva de proteína pro-apoptótica, (Noxas e Mcl-1

s) ( A Figura 5). Uma diminuição global na expressão de Bcl-2 também foi observada em todas as linhas celulares GEM-R tratados com gossipol ou tratamento de drogas combinadas. No entanto, a regulação negativa de Bcl-XL também foi observado em células MCF-7, quando as células foram tratadas com quer gossipol ou tratamento de drogas combinadas. Um aumento na clivagem do pró-apoptótica de Mcl-1

S expressão em todos os 2 Bcl-linhas de células que sobre-expressam GEM-R foi observado após o tratamento combinado de drogas. No entanto expressões de Bax e Bak permaneceram inalterados após tratamento medicamentoso. Colectivamente, estas observações sugeriram que gossipol reversão da resistência a gemcitabina envolve a regulação negativa de proteínas anti-apoptóticas (Bcl-2 e /ou Bcl-XL) e a regulação positiva de proteínas pró-apoptóticas (Noxas e Mcl-1

S).

Imunotransferência de expressão de proteínas de apoptose em linhas celulares resistentes a gemcitabina (GEM-R), quando tratados com a combinação de gossipol e gemcitabina durante 48 horas. Os resultados apresentados são representativos de duas experiências independentes.

Mudanças Significativas em apoptose Pathway Contribuição à resposta diferencial a gemcitabina e Gossypol

perfil de expressão do genoma inteiro foi realizado em SNU1 (jóia- S) e CNE2 (GEM-R) para avaliar mecanismos alternativos de suas diferenças em resposta à droga para gemcitabina sozinha e gemcitabina /combinação gossipol (Figura 6). Um total de 2702 genes foram diferencialmente expressos em amostras pré e pós-tratamento e foi mapeado para 61 processos biológicos enriquecidos utilizando análise de caminho KEGG. Os processos biológicos mais significativos regulados por estes genes incluem spliceosome, ciclo celular, metabolismo de pirimidina, sinalização de p53 e vias apoptóticas (ver informação; Tabela S1). O tratamento com gemcitabina predominantemente levou a sobre-regulação destes genes resposta ao tratamento em CNE2 (GEM-R), mas um sub-regulação SNU1 (GEM-S) (Figura 6), o que sugere que a sobre-regulação destes genes envolvendo em p53 e vias apoptóticas podem contribuir para a resistência gemcitabina. Além disso, quase metade destes genes de resposta tratamento foram regulados negativamente em CNE2 (GEM-R) após o tratamento com gossipol e gemcitabina com alterações mínimas observadas em SNU1 (GEM-S).

Heatmap de 2702 significativa diferencialmente genes expressos em gemcitabina resistentes, GEM-R e gemcitabina sensíveis, GEM-S tratadas com gemcitabina sozinha (Gem) ou em combinação com gossipol (+ Gem GOS), em relação às linhas de células de controlo não tratados correspondentes. Os níveis de cada gene de expressão são mais elevados e menor do que o controle, mostrado em vermelho e verde, respectivamente.

Diminuição Anti- e pró-apoptóticos expressão dos genes no GEM-R e GEM-S Linhas de celular quando gossipol foi combinado com o tratamento gemcitabina

para avaliar ainda mais genes que podem ser responsáveis ​​para a sensibilidade gemcitabina e sinergismo com o tratamento combinado com gemcitabina e gossipol, decidimos concentrar apenas em genes relacionados à apoptose na via de KEGG que foram diferencialmente modulada após o tratamento de gemcitabina sozinha e depois da terapia combinada. Foram identificados 65 genes (31 anti-apoptose e 34 pr�apoptose) na via apoptótica que foram significativamente regulados em CNE2 (GEM-R), e 49 genes (23 anti-apoptose e 26 pro-apoptose) que foram significativamente regulados em SNU1 (GEM-S) (ver informação; Tabela S2).

Em CNE2 (GEM-R), descobrimos que a maioria dos genes anti-apoptóticos foram significativamente regulada para cima quando as células foram tratadas com gemcitabina (Figura 7A). Por outro lado, a maior parte destes genes anti-apoptóticos foram regulados negativamente quando SNU1 (GEM-S) foi tratada com gemcitabina sozinha (Figura 7B). Observou-se também que as expressões de genes da maioria destes genes anti-apoptóticos foram significativamente diminuída quando foi adicionado ao gossipol gemcitabina em CNE2 (GEM-R) (Figura 7A). Da mesma forma os genes anti-apoptóticos que foram regulados negativamente em SNU1 (GEM-S) após o tratamento gemcitabina, também foram encontrados para ser futher regulada negativamente quando as células foram tratadas com a terapia de combinação (Figura 7B). No entanto, foram também mais genes anti-apoptoptic, inicialmente regulada para cima por gemcitabina, mas foram regulados negativamente em CNE2 (GEM-R) (11 genes) após a combinação do gossipol e gemcitabina, em comparação com SNU1 (4 genes) (Figura 7A e B ).

O log relativa

2 mudança dobra para agrupamento de genes anti-apoptótica (A-B) e aglomerado de genes pró-apoptóticos (C-D), tratados com gemcitabina sozinha (Gem) e em combinação com gossipol (Gem + GOS). Apenas os genes que foram diferencialmente expressos significativamente do grupo de controlo não tratado são representados no gráfico. Todos os valores no eixo dos Y foram comparadas com os controlos não tratados de respectivas linhas celulares. Valores acima de zero genes indicados que foram up-regulados na sua expressão. Valores abaixo de zero genes indicados que foram regulados negativamente em sua expressão e os valores a zero indicaram nenhuma mudança para a expressão do gene. O log

2 níveis de genes associados foram normalizados para a amostra não tratada.

tendência semelhante de genes diminuiu expressões pró-apoptóticos foi observada em ambas as linhas de células tratadas com a terapia de combinação de drogas em comparação com linhas celulares tratados com gemcitabina sozinha (Figura 7C e D). No entanto, apesar da diminuição na expressão do gene pró-apoptótico, não foram mais genes pró-apoptóticos em CNE2 (GEM-R) (15/29 genes) que permaneceu sobre-reguladas após o tratamento combinado (Figura 7C), em comparação com SNU1 (GEM -S) 4/12 (genes) no mesmo tratamento (Figura 7D). Deve notar-se que apenas a expressão do gene de NFKBIA foi encontrado para ser-se-reglated em SNU1 (GEM-S) após terapia de combinação quando em comparação com a sua expressão do gene durante o tratamento gemcitabina (Figura 7D).

Validação de anti-apoptótica Gene Cluster no GEM-R e pró-apoptóticos Gene Cluster no GEM-S

Para validar o conjunto de genes anti e pró-apoptóticos em CNE2 (GEM-R) e SNU1 (GEM-S linhas celulares) mostrada na Figura 7, foram investigadas 5 genes seleccionados na via de apoptose KEGG que pode ter papel importante na apoptose em resposta a tratamento gemcitabina e gossipol (Figura 8). Semelhante ao ensaio de expressão genética, o anti-apoptótica PIK3R2 e expressão da proteína pAKT foram encontrados para ser regulada para cima quando CNE2 linha celular (GEM-R), foi tratada com gemcitabina, com uma redução no nível de proteína observada apenas em pAKT quando as células foram tratadas com tratamento de combinação (Figura 9). A linha de células A gemcitabina SNU1 tratada (GEM-S) apresentaram alterações mínimas na expressão da proteína PIK3R2 e pAKT quando em comparação com células não tratadas, mas o tratamento de combinação com SNU1 (GEM-S) linha celular resultou numa redução significativa da expressão da proteína PIK3R2 e pAKT (Figura 9 ).

observamos que houve um pequeno aumento na expressão de proteínas de genes pró-apoptóticos, BAD, CASP6 e CAPN1 após o tratamento gemcitabina, tanto CNE2 (GEM-R) e SNU1 (jóia- S) A linha de células (Figura 9). BAD, CASP6 e CAPN1 foram encontrados para ser regulada negativamente durante o tratamento em combinação linha celular GEM-S, mas não linha celular GEM-R (figura 9). Estas observações Concorda com os resultados na Figura 5, e sugerem que alternativas Bcl-2 vias que envolveram AKT, PI3K, BAD, CASP6 e CAPN1 pode ajudar a explicar a resposta diferencial à gemcitabina e interacções sinérgicas em tratamento de combinação de gemcitabina e gossipol.

Immunoblot de anti-apoptótica (pAKT e PI3KR2) e pró-apoptótica (BAD, CASP6 e CAPN1) genes em linha celular GEM-R e linhas celulares GEM-S. As células foram tratadas com gemcitabina e combinação com gossipol durante 48 horas. Os resultados apresentados são representativos de duas experiências independentes.

Discussão

High expressão Bcl-2 tem sido correlacionada com mau prognóstico clínico em pacientes com câncer [29], bem como a resistência à convencional fármacos quimioterapêuticos [30]. Han et al relataram que a sobre-expressão de Bcl-2 tem demonstrado ser significativamente associado com a diminuição da sensibilidade ao tratamento com gemcitabina, e que a sua expressão pode ser utilizado como um factor preditivo para a eficácia do tratamento com gemcitabina em doentes com cancro [12]. Os estudos in vitro também revelou uma correlação directa com elevado teor de Bcl-2 celular e resistência a gemcitabina em linhas celulares de carcinoma pancreático [11]. No entanto, houve conflito relatório observando nenhuma correlação entre a Bcl-2 e gemcitabina sensibilidade no pâncreas, próstata, pulmão e cancro da mama [31].

Em nosso estudo, descobrimos que nasofaríngea, mama e linhas celulares de cancro gástrico resistente a gemcitabina teve maior expressão de Bcl-2, e o tratamento com gemcitabina resultou numa sobre-regulação de anti-apoptótica de Bcl-2 ou Bcl-XL. Estas observações sugeriram que o nível de expressão do gene de anti-apoptótica de Bcl-2 e Bcl-XL foi importante na resistência a gemcitabina. Em apoio a esta conclusão, Schniewind et al encontraram uma correlação inversa significativa entre a expressão de Bcl-xl e gemcitabina apoptose induzida [32], e que o aumento da Bcl-xl expressão inibe a apoptose celular a drogas quimioterápicas [33].

vários relatórios demonstraram a eficácia do gossipol em alvejar células cancerosas com elevado nível de Bcl-2 e seus membros da família, por aumento da apoptose celular, quando utilizados como um único agente [19] ou em combinação com gemcitabina [34]. Macoska et al mostraram interacção sinérgica em linhas celulares de cancro da bexiga tratados com gossipol em combinação com gemcitabina ou a carboplatina, o que resulta em um aumento da apoptose através da diminuição da expressão de pró-sobrevivência expressão de Bcl-XL e Mcl-1 e aumentada de genes pró-apoptóticos [34]. No entanto, deve-se ter em mente que nem todos os Bcl-2 linhas celulares superexpressão podem se beneficiar da combinação de gossipol com gemcitabina. Em nosso estudo, foi observado potencial efeito antagonista de gossylpol e gemcitabina na SNU1, uma linha de células que tinham alto nível de Bcl-2, mas foi sensível a gemcitabina, sugerindo uma alternativa Bcl-2 via em resposta gemcitabina [35], [36] .

observou-se que as linhas celulares GEM-R, com uma alta Bcl-2 tinha regulado para cima pró-apoptótica Noxas e sub-regulada de Bcl-2 ou Bcl-XL expressão quando tratados com gossipol ou em combinação com gemcitabina (Figura 5). Tem sido sugerido que os alvos de gossipol Bcl-xl por inibição da actividade anti-apoptótica, o que resultar directamente na sobre-regulação da pró-apoptótica Noxas e expressão Puma [37]. A activação de Noxas poderia também conduzir a localização de BH3-dependente motivo para a mitocôndria e a interacção com o anti-apoptóticos membros da família Bcl-2, o que resulta na activação da apoptose [38]. Além disso, estudos demonstraram que a sobre-regulada genes pró-apoptóticos assim a diminuição da expressão de genes anti-apoptóticos foram capazes de aumentar gossipol apoptose induzida em vários tipos de células cancerosas [39], [40]. Também mostrou que Mcl-1

S foi aumentado em uma linha de células de GEM-R tratados com gossipol ou tratamento combinado (Figura 5). Esta observação pode ser suportado por Meng et al.