Abstract

O câncer colorretal (CRC) tem uma das maiores incidências entre todos os cânceres. A maioria dos CRCs são cancros esporádicos que ocorrem em indivíduos sem história familiar de CRC ou mutações hereditárias. Infelizmente, estudos de expressão todo o genoma de CRCs esporádicos são limitadas. Um estudo recente usou técnicas de microarray para identificar um gene preditor definido indicativo de susceptibilidade ao início precoce CRC. No entanto, os mecanismos moleculares do conjunto de genes de previsão não foram totalmente investigados no estudo anterior. Para entender os papéis funcionais do conjunto de genes preditor, no presente estudo foi aplicado um modelo estatístico baseado em subpathway aos dados de microarranjos do estudo anterior e mecanismos identificados que são razoavelmente associados com o conjunto de genes preditor. Curiosamente, subpathways significativos pertencentes a 2 vias KEGG (adesão focal; citotoxicidade mediada por células natural killer) foram encontrados para estar envolvido nos pacientes com CCR de início precoce. Também mostrou que as vias 2 eram funcionalmente envolvidos no gene preditor definido usando uma técnica de texto-mineração. Entrada de um único membro do conjunto gene preditor desencadeou uma via de adesão focal, que confere anti-apoptose em pacientes CRC início precoce. Além disso, a inspecção intensiva do gene preditor definido em termos de 2 vias sugerido que algumas entradas do conjunto de genes preditor foram implicados na imunossupressão, juntamente com a transição epitelial-mesenquimal (EMT) nos pacientes de CRC de início precoce. Além disso, comparamos nosso modelo estatístico baseado em subpathway com um modelo estatístico baseado no conjunto de genes, MIT Gene Set Enriquecimento Análise (GSEA). Nosso método apresentou melhor desempenho que GSEA no sentido de que o nosso método era mais consistente com um conjunto via relacionada ao câncer conhecido. Assim, a sugestão biológica gerada por nossa abordagem baseada em subpathway parece bastante razoável e merece um estudo mais aprofundado experimental na CRC de início precoce em termos de desdiferenciação ou diferenciação, que é sublinhada no EMT e imunossupressão

Citation:. Nam S, Parque T (2012) Avaliação Caminho-Based in Early Onset Câncer Colorretal Sugere Adesão focal e imunossupressão junto com transição epitelial-mesenquimal. PLoS ONE 7 (4): e31685. doi: 10.1371 /journal.pone.0031685

Autor: Christina Chan, Michigan State University, Estados Unidos da América

Recebido: 03 de julho de 2011; Aceito: 13 de janeiro de 2012; Publicação: 09 de abril de 2012

Direitos de autor: © 2012 Nam, Park. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O trabalho de TP foi apoiado por uma bolsa da Fundação Nacional de Pesquisa da Coreia financiado pelo governo da Coreia (MEST) (20080062618). O trabalho de SN foi apoiada por K-10-L05-C01-S13 do Instituto Coreano de Ciência e Tecnologia da Informação. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

polipose adenomatosa familiar (FAP) e câncer colorretal hereditário sem polipose (HNPCC) são doenças autossômicas dominantes que resultam de mutações hereditárias genéticas na polipose adenomatosa coli (APC) e genes de reparo [1]. No entanto, estas doenças são responsáveis ​​por apenas 25% do número total de casos colorrectal nos Estados Unidos em 2010 [2]. Os restantes 75% dos cancros são declaradamente cânceres colorretais esporádicos (CRCs) sem história familiar [2] (www.cancer.gov), para o qual o mecanismo ainda não está claro [3].

Hong et al. [3] identificados 7 genes altamente regulados positivamente (

Cyr61

,

EGR1

,

FOSB

,

FOS

,

VIP

,

UCHL1

,

KRT24

) em pacientes com CCR esporádicos de início precoce que foram usados ​​como um conjunto gene preditor avaliada com uma técnica de microarray. Para os experimentos, de aparência normal da mucosa adjacente ao tumor foi obtido a partir dos pacientes de CRC e de mucosa normal foi obtido a partir de controlos saudáveis. Eles também fornecida uma discussão sobre as vias de sinalização (cinase de MAP (MAPK) de sinalização, a sinalização NFAT-imunitário, a sinalização hipoxia, a sinalização de insulina, a sinalização de PI3K-AKT, a sinalização de Wnt, receptor acoplado a proteína G (GPCR) de sinalização).

no presente estudo, nós exploramos ainda mais o conjunto de dados de microarrays, a fim de adicionar um potencial regulador a montante de algumas das vias de sinalização enumerados nos pacientes CRC de início precoce avaliadas no Hong et al. estudo [3]. Especificamente, foi realizada a análise estatística avançada para melhorar a compreensão molecular do conjunto gene preditor usando text-mineração e subpathways significativos relacionados com os casos de CRC de início precoce.

A nossa abordagem envolve texto de mineração pública [4] usando um novo modelo estatístico que manipula regulação (por exemplo, inibição, activação) entre entradas biológicos, e executa um teste de permutação de identificação subpathway de um determinado percurso. Nós identificado pela primeira vez subpathways estatisticamente significativas em relação aos primeiros CRCs início de vias KEGG [5] com o modelo, e um texto de mineração posteriormente utilizado [4] para confirmar associações literatura entre o conjunto gene preditor e alguns subpathways significativas representativas.

o nosso modelo proposto sugere que, de início precoce CRC é envolvido em subcomponentes do circuito de adesão focal e a via citotoxicidade mediada por células assassinas naturais (NK). A via citotoxicidade mediada por células NK em dicas específicas na presença de células imunes em pacientes de CRC e de início precoce, o que implica a comunicação parácrina entre as células imunitárias (por exemplo, células NK, células T, células NK T) e várias outras células [6 ]. Além disso, o nosso resultado indica que as vias de sinalização anteriormente relatados (Wnt, PI3K-AKT, MAPK) [3] são provavelmente em cascata através do seu montante quinase de adesão focal (FAK), [7], que pertence ao circuito de adesão focal. Portanto, FAK [7] pode ser um valioso candidato alvo terapêutico para o diagnóstico conjunto de genes preditor CRC início precoce. Além disso, nossa análise de texto de mineração das 2 vias, juntamente com o conjunto de genes preditor implícito que alguns elementos do conjunto de genes preditor estão envolvidos na sobrevivência celular e epitelial-mesenquimal de transição (EMT) [8], [9], [10] através da via de adesão focal e imunossupressão [8], [10], [11].

resultados

Visão geral

o conceito principal do nosso modelo estatístico foi o de identificar estatisticamente subpathways significativas cujos (por exemplo, micro-arranjo) expressão concordou com as informações de regulação (por exemplo, activação, de inibição) (Figura 1A) na base de dados via KEGG. A nossa abordagem é brevemente descrito aqui.

A. Regras para combinar uma vantagem de duas entidades adjacentes em KEGG vias com suas mudanças de expressão gênica. Dada uma vantagem, o gene 1 é chamado um nó de origem da qual a borda sai, e o gene 2 um sorvedouro de que a borda entra. B. Diagrama esquemático do modelo estatístico. Dado um subpathway, foi identificado o segmento mais longo (subpathway bem definido) a partir do nó de folha. Calculou-se uma estatística S para o subpathway bem definida. A distribuição nula de S foi obtido através de 1.000.000 permutações etiqueta de amostra e o valor p para o S observada foi finalmente calculada (veja

Materiais e Métodos

para detalhes). ovais vermelhas estão sobre-regulada nos pacientes com câncer, e os verdes para baixo-regulado.

As vias KEGG não-metabólicas foram reduzidos em subpathways lineares, como descrito em

Materiais e Métodos

(Figura 2). Neste estudo, o termo “subpathway linear” é usado equivalente a “subpathway”. Nós, então, selecionados subpathways bem definidas em que a expressão do gene acordados com a informação de regulação de acordo com as regras estabelecidas (Figura 1A) como candidatos para medir sua significância estatística (veja

Materiais e Métodos

). Uma estatística

S

para cada subpathway bem definida foi calculado e sua importância avaliada pelo cálculo do empírica

p

-valor via permutações etiqueta da amostra (Figura 1B).

Um total de 90 vias KEGG foram divididos em mais de 130 milhões subpathways lineares extensas que consideraram todas as atribuições de genes múltiplos. Entre estes subpathways, foram identificados 4.644 subpathways bem definidas e sua importância avaliada através de testes de permutação. Posteriormente, a análise de associação de texto de mineração foi realizada para os subpathways significativas bem definidas selecionados; uma discussão mais aprofundada sobre os seus papéis funcionais é fornecida a seguir.

significativas subpathways bem definidas

Realizamos testes de comparação múltipla, controlando a taxa de falsa descoberta (FDR) [12]. O FDR

q

-Valores foram calculados usando o

p

-Valores através da realização de 1 milhão de testes de permutação (Figura S1). O

p

-valor que correspondeu a um FDR de 5% era 0,01386, o que rendeu 1.289 significativas subpathways bem definidas. Desde que optou por não fornecer interpretação biológica detalhada de todas estas subpathways bem definidos significativos, nós nos concentramos em exame do top 30% destes subpathways bem definidas para fornecer uma descrição mais detalhada biológica.

A maioria dos subpathways selecionados discutiremos pertence a 6 vias KEGG (Figura S2): adesão focal (KEGG hsa04510), caminhos em câncer (KEGG hsa05200), citotoxicidade mediada por células NK (KEGG hsa04650), via de sinalização MAPK (KEGG hsa04010), Wnt via de sinalização (KEGG hsa04310) e neurotrofina via de sinalização (KEGG hsa04722). Para a discussão funcional e visualização, mapeamos funcionalmente interessantes subpathways bem definidas (Tabela S1) do 6 KEGG vias em diagramas via KEGG (Figuras 3 e 4; Figuras S3, S4, S5 e S6). Em particular, nós nos concentramos em 3 vias (de adesão focal, citotoxicidade mediada por células NK, Pathways em câncer) que não tinham sido explicitamente mencionado no Hong anterior et al. estudo [3]. As entradas dos genes subpathways bem definidas incluído na discussão funcional e visualização dos 3 caminhos encontram-se resumidos na Tabela 1.

Se a dobra-a mudança do grupo de doente com cancro em relação ao grupo de controlo saudável é maior do que um gene é vermelho, caso contrário verde. Ver Tabela 1 e Tabela S1 para obter informações detalhadas.

mesma designação Figura 3.

Validação da significativa bem definida subpathways

Nós validado as entradas na Tabela 1 utilizando uma ferramenta de texto de mineração independente MedLine [4], PubGene. O objetivo deste foi para confirmar se a literatura apoiada co-ocorrências diretas entre o termo “cancro colo-rectal” e as entradas na Tabela 1. Descobrimos que 79% das entradas na Tabela 1 tinha interações diretas na análise PubGene (Tabela S2 ). Assim, concluímos que os nossos resultados do modelo fornecido um acordo razoável com a literatura analisada.

Pathways no câncer (hsa05200)

A via hsa05200 KEGG (percursos em câncer, Figura S3) é auto evidente. sinalização de factor de crescimento, a sinalização Wnt e de sinalização MAPK, que estão localizados na parte esquerda da Figura S3, foram activados nas amostras de pacientes de CRC. Os sinais são forças motrizes comuns durante a carcinogênese [8], [13]. mucosa aparentemente normal nos pacientes com CCR tem um potencial intrínseco para posterior transformação.

circuito de adesão focal (hsa04510)

A Figura 3 mostra a via de adesão focal. Este resultado indica que a parte de fundo do percurso é altamente envolvido com os pacientes de CRC, e FAK (pTK2, Tabela 1) é não só um sorvedouro de seus receptores a montante, mas também um nó de origem para a sua jusante transduções de sinalização (Wnt, PI3K -Akt /PKB, e MAPK sinais) para a sobrevivência. PTEN (Tabela 1) [14], um supressor de tumores e antagonizer da via de sinalização de PI3K-AKT /PKB, foi regulada negativamente na via de adesão focal na análise dos pacientes com CCR ‘amostras em comparação com a dos controlos saudáveis’ amostras.

Hong et al. [3] sugerido que a via de sinalização Wnt está envolvido em pacientes de CRC. O nosso resultado a respeito da via de adesão focal (Figura 3) suporta a ideia de que a GSK-3β (GSK3B, Tabela 1) regulada por PI3K-AKT /sinalização PKB da FAK jusante foi regulada negativamente nos pacientes de CRC, e também que β-catenina (CTNNB1 , Tabela 1) foi altamente expressa por regulação negativa da sinalização de Wnt inibidor de GSK-3β nos pacientes de CRC. Ao olhar mais para as informações na Figura S5, determinou-se que a expressão genética de vários ativadores e inibidores relacionados com a sinalização Wnt activação é consistente com a regulação dos fluxos. Outra via, MAPK sinalização (Figura S4) que foi regulada positivamente nos pacientes de CRC também é localizado a jusante da FAK (Figura 3).

3 Uma vez que os sinais activados (Wnt, PI3K-AKT /PKB, e sinais MAPK ) estão localizados a jusante da FAK pertencente à via de adesão focal, FAK [7], [15] pode ser um alvo terapêutico para o diagnóstico conjunto de genes preditor CRC início precoce. Além disso, porque os papéis cruciais de Wnt, PI3K-AKT /PKB, e MAPK sinalização lançar luz sobre EMT [9], tem vindo a aumentar gradualmente importância dada à FAK.

Curiosamente, Cyr61, que foi incluído no o conjunto de genes preditor, é um ligando de ITGB5 (avp5 integrina, denotado como ITGB na Figura 3), de acordo com a base de dados KEGG BRITE [5]. A Figura 3 mostra que Cyr61 é um dos sinais mais a montante que desencadeia a FAK, o que implica que a FAK activa subsequentemente 3: sinais de Wnt, PI3K-AKT /PKB, e de sinalização MAPK. Recentemente, /PKB, e sinais de MAPK Wnt, PI3K-AKT foram mostrados para ser envolvido em EMT [9], e, aparentemente, mucosa normal em pacientes com CCR poderia sofrer transformação fenotípica por estes 3 sinais via o eixo Cyr61-FAK. Em outras palavras, algumas células na mucosa aparência normal em pacientes de CRC pode estar perto de células atípicas, utilizando EMT. Vamos descrever a evidência de EMT em termos de nível de expressão gênica e explorar qualquer possível associação entre o conjunto gene preditor e EMT no

Discussão

.

Outro achado relevante para a região a jusante do circuito de adesão focal é que a proteína anti-apoptose c-IAP (BIRC3, Tabela 1) [16], que é um regulador negativo de caspases (por exemplo, CASP3, CASP8, CASP9), foi também regulados positivamente nos pacientes de CRC. Assim, examinámos ainda as diferentes a jusante de c-IAP (inibidor de apoptose celular) na via de adesão focal, em que c-IAP, juntamente com survivina (BIRC5) também são proteínas anti-apoptóticas importantes. É de notar, que também tem sido demonstrado que a c-IAP e survivina também inibem as caspases a jusante de ambas as vias apoptóticas extrínsecas e intrínsecas [16]. Descobrimos que a maioria da proteína c-IAP foram regulados positivamente nos pacientes de CRC (Tabela 2). Assim, a via de adesão focal pode conferir inibição da atividade da caspase sobre a tumorigénese de células atípicas potenciais na mucosa aparentemente normal.

mediada por células NK via de citotoxicidade (hsa04650)

A nossa estatística análise indicou acordo significativa entre a expressão do gene dos pacientes de CRC e parte da via imune (hsa04650, Figura 4), o que implica a presença de outras células do sistema imunológico, bem como as células NK em amostras dos pacientes de CRC.

FAS em células alvo de células NK e o seu ligando (FASLG), que é produzido pelas células NK, foram altamente expresso em amostras dos pacientes de CRC. expressão alta FASLG nos pacientes com CCR está de acordo com observações clínicas anteriores [6], [17] em que a expressão alta FASLG foi correlacionada com alta incidência de metástases e menor sobrevida em pacientes com carcinoma colorretal e em outros pacientes com carcinoma.

na mucosa aparentemente normal dos pacientes com CCR, várias células alvo, incluindo células potencialmente atípicos podem sobreviver de sinalização de receptor de morte FASLG-FAS escapando de sinalização apoptótica quer extrínseco ou intrínseco. Na verdade, os sinais apoptóticos foram inibidas nos pacientes de CRC porque a c-IAP [16] que inibiu caspases foram regulados positivamente nos pacientes com CCR em termos de expressão do gene (Tabelas 1 e 2). Outra possibilidade é que a regulação positiva FASLG pelas células alvo, incluindo células potencialmente atípicos, pode iniciar fratricide e de suicídio entre as células do sistema imunológico com a FAS benéfico para a transformação de células potencialmente atípicos.

No entanto, a existência de alta interferão-gama ( IFN-γ) expressão secretada por células NK ou células do sistema imunológico em pacientes CRC permanece controverso porque a citotoxicidade das células NK é acreditado tradicional para controlar vigilância imunológica sobre câncer e células atípicas. Recentemente, uma relação significativa entre a imunidade anti-tumor e a sobrevivência de células cancerosas tem sido relatada [6], [18]. Além disso, o IFN-γ é conhecido por estar envolvido na vigilância imunológica contra as células cancerosas, em múltiplos efeitos fenotípicos sobre as células somáticas (por exemplo, progressão do ciclo celular, a proliferação, a diferenciação celular, transformação), e no cancro de escape de células [11], [18] , [19], [20]. Assim, no

Discussão

, descrevemos outras funções de IFN-γ, especialmente em termos de as células cancerosas forma ou células potencialmente atípicos em pacientes com CCR poderia ajustar o sistema imunológico local através de imunossupressão, a fim de escapar da vigilância imunológica .

Associação entre adesão focal, citotoxicidade mediada por células NK, eo gene preditor CRC início precoce set Online

Como mencionado no texto acima, Hong et al. [3] relatou que a susceptibilidade de início precoce foi atribuído ao conjunto de genes upregulated chamado de “preditor conjunto de genes” em pacientes com CCR, que consiste em

Cyr61

,

EGR1

,

FOSB

,

FOS

,

VIP

,

UCHL1

, e

KRT24

. Nós inspecionou as associações entre os genes listados na Tabela 1 e o gene preditor definidos com a ferramenta de texto de mineração, PubGene [4] (www.pubgene.org) (Figura S7). A entrada na ferramenta composta do conjunto preditor gene, de adesão focal (FAK, ITGB5), e a citotoxicidade mediada por células NK (GINF, FAS, FASLG). A Figura 5 mostra uma rede de associação para os genes de entrada no CRC. Nós já mencionado que β-catenina (via CTNNB1, Wnt na Figura 5) foi regulado por FAK na adesão focal. O conjunto preditor de genes, de adesão focal, e citotoxicidade mediada por células NK foram altamente associados uns com os outros no CRC.

As três caixas verdes representam o conjunto de genes (Cyr61, FOS, FOSB, UCHL1, VIP, EGR1, KRT24), NK celular citotoxicidade mediada (IFNG, FAS, FASLG), e adesão focal (pTK2) da esquerda para a direita. As opções usadas na rede são descritos na Figura S7. As caixas azuis-cheia pálidos representam Mesh (www.nlm.nih.gov/mesh/~~number=plural) Doenças termos para os genes. Note-se que ITGB5 associações não aparecem no resultado PubGene.

Comparação de nosso método com Gene Set Análise de Enriquecimento (GSEA) do Hong et al. dataset

Foram comparados os caminhos KEGG contendo subpathways bem definidos significativos identificados pelo nosso método com esses caminhos KEGG obtidos a partir do programa de arranque web GSEA JAVA (opções padrão com 5.000 permutações). Em nosso método, o nível de significância (

p

-valor) foi de 0,05 para o corte das subpathways bem definidas. O mesmo

P

-valor de 0,05 foi usado para o método de GSEA. Nosso método relatado 1.966 significativas subpathways bem definidas que correspondiam a 78 vias KEGG. O programa GSEA relataram 2 grandes tipos de listas de vias significativas: 10 vias ativadas e 30 vias reprimidas nos pacientes com CCR. O número de vias de sobreposição entre os métodos 2 foi de 6, o que não é surpreendente quando se considera as diferenças entre 2 métodos. No entanto, é interessante notar que os 2 métodos identificados 6 vias comuns associados ao câncer.

Para comparar as 78 vias identificadas pelo nosso método com as 40 vias identificadas por GSEA, foram utilizadas as vias relacionadas ao câncer relatados por Vogelstein et ai. [13] como padrão-ouro. Isto é, nós inspecionados qual método forneceu mais caminhos consistentes com as vias relacionadas ao câncer identificados por Vogelstein et al. As vias relacionadas com o cancro da Vogelstein et al. estudo foram mapeados manualmente para suas vias KEGG correspondentes porque KEGG identificadores via correspondentes às vias relacionadas ao câncer não foram mencionados explicitamente no estudo. Em seguida, inspecionou as vias sobrepostas entre as vias KEGG relacionadas ao câncer Vogelstein e aqueles identificados pelos 2 métodos. Como mostrado na Tabela S3, o nosso método proporcionado resultados mais consistentes com as vias relacionadas ao câncer identificados no Vogelstein et al. do que o método GSEA. Mais detalhes sobre esta secção são descritos no Apêndice S1.

Comparação entre a subestrutura via da Hong et al. conjunto de dados e que do outro conjunto de dados

Para determinar o quão perto a subestrutura caminho do conjunto de dados Hong sobrepõe-se com a de um conjunto de dados colorectal adicional, temos procurado por um conjunto de dados colorectal adicional de Gene Expression Omnibus (GEO). Embora existam vários conjuntos de dados CRC, parece não há dados estão disponíveis, relativa a um comparador de pacientes com cancro colorectal de início precoce com controlos saudáveis, como é levada a cabo em Hong et ai. estude. Felizmente, encontramos o conjunto de dados GSE4183 [21], o que compara várias doenças colorretais (carcinoma colorretal, adenoma colorretal, doenças inflamatórias do intestino) com controles normais em um ambiente mais geral (www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi? acc = GSE4183). A partir do conjunto de dados GSE4183, obtivemos, controles saudáveis ​​normais (

n

= 8) e carcinomas colo-rectal (

n

= 15). O conjunto de dados GSE4183 foi analisada com o nosso método, que revelou 3,669 subpathways bem definidos (identificados a partir ~130 milhões subpathways) ao determinar o seu significado com base em 100.000 testes amostra de permutação. Além disso, a comparação entre o conjunto de dados GSE4183 e o conjunto de dados de Hong et al. (GSE4107) mostrou que 250 subpathways bem definidas sobreposto entre os 2 conjuntos de dados. Para determinar o quão bem estes 2 resultados coincidiram com os outros, nós também realizado o teste exato de Fisher com base no modelo de randomização. O

p -valor

a partir da distribuição hipergeométrico era inferior a 2.2e-16, implicando que os 2 resultados coincidiram bem uns com os outros. Assim, concluímos que a nossa conclusão relevante para a subestrutura via de Hong é bem suportado por nossa descoberta do outro conjunto de dados independente. Mais detalhes sobre esta secção são descritos no Apêndice S1

Discussão

A nossa análise romance sugere os seguintes resultados:. 1) Os subconjuntos de adesão focal, caminhos em câncer, e NK celular mediada citotoxicidade são altamente envolvido em pacientes com CCR esporádicos de início precoce; e 2) Surpreendentemente, a análise de texto-mineração sugerido que a função molecular do gene preditor para definir esporádica de aparecimento precoce CRCs está associada a adesão focal e a citotoxicidade mediada pelas células NK. No texto a seguir, discutiremos os mecanismos moleculares potenciais desta associação em termos de imunossupressão e EMT.

Imunossupressão

A literatura recente [6], [11], [18], [ ,,,0],19], [22], [23], [24] criou um quadro conceptual em que as interações entre tumor e imunidade são pensados ​​para ajudar um número de células cancerosas escapar imune-invadir por sofrer as seguintes 3 fases em um linear ou forma mista: eliminação (vigilância imunológica), equilíbrio (dormência tumor), e escapar (imunossupressão). Em particular, a fuga de células de cancro por imunossupressão [6], [8], [11], [19], [25], [26] tem sido extensivamente estudada, e 2 tipos de células imunossupressoras são pensadas para regular negativamente anti-tumoral resposta imunitária: as células T reguladoras (T

REG) e células supressoras derivadas de mielóides (MDSCs) [8], [11], [27], [28]. Discute-se a seguir os papéis de IFN-γ, outras citoquinas, e o conjunto de genes preditor em termos destes 2 tipos de células de imunossupressores em doentes CRC início precoce.

Foi demonstrado anteriormente que o IFN-γ pode induzir a ativação e ampliação de MDSCs no câncer de cólon [28], e que MDSCs ativados não apenas inibir efetoras T atividade /proliferação de células, mas também induzir imunossupressora CD4

+ CD25

+ Foxp3

+ T

Reg células de CD4

+ CD25

– células T [6], [11], [28]. T

Reg células, que também expressam CTLA-4, DP-1 e DP-L1 nas suas superfícies celulares, regular positivamente citocinas imunossupressoras interleucina (IL) -10 e crescimento tumoral-beta (TGF-β), que também pode induzir a diferenciação t

Reg [6], [11], [29]. Uma vez que o t

Reg células são encontradas em linfócitos infiltrantes de tumor (TILs) em vários cancros [6], [11], [29], a mucosa aparentemente normal nos pacientes de CRC podem ter TILs presentes com actividade imunossupressora. ARG1 é também uma enzima metabólica chave para MDSCs para regular negativamente as funções de linfócitos ou através do consumo de sequestrar o aminoácido arginina que é crítico para a função das células T. Assim, nós inspeccionados os níveis de expressão do gene dos genes examinados (CD4, CD25, FOXP3, TGF-p, IFN-y, IL-10, CTLA-4, DP-1, DP-L1, Arg1) nos pacientes de CRC e confirmados todos foram upregulated nos pacientes com câncer (Tabela 3).

Para fornecer gene provas de nível de expressão da presença de MDSCs em pacientes de CRC, nós inspecionados (direta ou indiretamente) vários marcadores de superfície MDSC : CD11c (ITGAX), CD11b (ITGAM), CD33, CD34, CD15 e [6]. De nota, examinámos FUT4 e FUT9 em vez de CD15 CD15 porque não é uma proteína de um antigénio mas sintetizado por FUT4 FUT9 e [30]. Verificou-se que todos os marcadores excepto FUT4 foram regulados positivamente nos doentes com cancro (Tabela 3).

Tem sido demonstrado anteriormente que as células cancerosas expressam PD-L1 na sua superfície secretam citocinas imunossupressoras galectina-1, IL- 6, IL-10 e TGF-β, que pode inibir citotóxico CD8

+ células T [11]. Além disso, as células cancerosas que produzem níveis mais elevados de indoleamina 2,3-dioxigenase (IDO) pode evitar a invasão de células NK e células T efectoras, esgotando triptofano essencial para a função das células T [6], [11]. No presente estudo, nós confirmou um nível de expressão mais elevados dos genes analisados ​​(por PD-L1, galectina-1, IL-6, IL-10, ido, e TGF-β) nos pacientes com cancro (Tabela 3).

A análise da expressão do gene mostrado na Tabela 3 sugere que a actividade imunossupressora é observada na mucosa altamente aparentemente normal. Esta descoberta pode fornecer informações adicionais sobre uma “mudança de campo” [31], que refere-se a proliferação e atividade anti-apoptótica na mucosa aparentemente normal adjacente ao tumor. Em outras palavras, anti-apoptose da mudança de campo pode também beneficiar de imunossupressão por escapar do imune-raid.

Para olhar mais para o refinamento funcional do gene preditor definido em termos de imunossupressão, que alimentou o gene preditor colocado em PubGene [4] com o MeSH (www.nlm.nih.gov/mesh) termo “imunossupressão” (descritor ID: D007165). O resultado (dados não mostrados) obtido no momento da preparação do manuscrito indicaram que 4 genes (

EGR1

,

FOS

,

UCHL1

, e

VIP

) têm uma associação com imunossupressão de acordo com a literatura. Com base em uma revisão por Ganea et al., Que foi sugerido por PubGene, VIP (a imunorregulatório neuropeptídeo conhecido) inibe a secreção de citocinas pró-inflamatórias e induz T

células Reg [32]. Outros estudos recentes também suportam os papéis imunossupressores da VIP [33], [34] porque VIP alivia artrite induzida por colágeno e sarcoidose, induzindo

+ CD25

+ Foxp3

+

células CD4 T Reg partir CD4

+ CD25

– células T. VIP está também envolvida na privilégios imunes no olho através da inibição da activação de linfócitos T e a proliferação [35]. Assim, a expressão alta VIP em pacientes com CCR pode identificar outro importante citocina imuno-reguladora em nossa análise.

EMT

Nós também inspecionou o nível de expressão de genes relacionados com a EMT [9], [36], incluindo proteases de matriz, as moléculas de invasão, epiteliais mesenquimais /marcadores, e repressores de e-caderina. Descobrimos que a maioria deles foram upregulated nos pacientes com câncer (Tabela 4). Portanto, o EMT [9] processo pode ocorrer em pacientes com cancro, pelo menos em termos de expressão do gene. Esta descoberta é inesperada em que as células atípicas ou pré-cancerosas poderiam existir mesmo na mucosa aparentemente normal por alterações da morfologia celular (por exemplo, EMT).

Para explorar os potenciais papéis do conjunto de genes preditor, nós de entrada o gene preditor definido em PubGene [4] com o termo mesh “epitelial-mesenquimal transição” (descritor ID: D058750). No momento da preparação do manuscrito, 3 genes (

EGR1

,

FOS

,

Cyr61

) para fora do gene preditor definir foram encontrados na literatura para ter uma associação com EMT.

Em particular, nós pagamos a atenção para o gene

Cyr61

porque Cyr61 é um ligante que pode desencadear uma via de adesão focal. Monnier et al. [37] demonstraram que a metástase induzida por integrina Cyr61-avp5 foi envolvido no efeito leito do tumor após a radioterapia sobre células HCT116 utilizando derivados de CRC em condições de hipóxia. estudos recentes adicionais sobre o desenvolvimento de motilidade celular Cyr61-impulsionada no adenocarcinoma ductal pancreático e nas células epiteliais gástricas [38], [39] indicam que Cyr61 é uma das moléculas-chave para EMT que pode conferir a capacidade metastática e motilidade das células de um tumor primário . Assim, Cyr61 pode ser uma das moléculas de condução para melhorar vias relacionadas-EMT (sinais /AKT Wnt e PI3K) [9], [40] em pacientes com CCR precoces através do eixo Cyr61-FAK (Figura 3).

Outro achado interessante que fizemos ao examinar a relação entre EMT e o conjunto gene preditor foi VIP, que foi recentemente relatado para induzir EMT com a estimulação da matriz de proteases metaloproteinases da matriz (MMP) -2 e MMP-9 na tumorigênese de próstata [41]. Descobrimos que a expressão do gene destes 2 proteases foi efectivamente regulada nos pacientes com câncer (Tabela 4).

As citocinas comumente envolvidos em ambas EMT e imunossupressão

Uma vez que encontramos VIP é uma citocina envolvida no tanto EMT e imunossupressão, a nossa descoberta implica sinalização parácrina entre as células do sistema imunológico e várias células alvo está envolvido em ambos os processos. Encontramos também uma citocina adicional envolvido nos 2 processos, na medida em que imunossupressora de TGF-β (TGFB1; Tabela S5) [22], [29], [36], [42] é um indutor EMT bem conhecida [9], [43]. De fato, descobrimos que a maioria dos TGF-ps e seus receptores foram upregulated nos pacientes com CCR.

Conclusão

A nossa análise de dados de expressão de genes sugere que, pelo menos, 2 entradas (

VIP

,

Cyr61

) do conjunto gene preditor são funcionalmente envolvidas na indução de EMT fenotípica por adesão focal downstream (Wnt, PI3K /AKT, MAPK) e imunossupressão (Figura 6).