Abstract
O fluoropirimidinas 5-fluorouracil (5-FU) e FdUrd (5-fluorodesoxiuridina; floxuridina) são a espinha dorsal dos regimes de quimioterapia para o câncer de cólon e outros tumores. Apesar do uso generalizado, não se sabe como esses agentes matar as células tumorais. Aqui, analisamos o ponto de verificação e reparo de DNA vias que afetam as respostas tumorais de cólon a 5-FU e FdUrd. Estes estudos demonstram que tanto FdUrd e 5-FU activar o ponto de verificação ATR e ATM vias de sinalização, o que indica que eles causam danos genotóxico. Notavelmente, no entanto, a depleção de ATM ou ATR não sensibilizar células de cancro do cólon de 5-FU, que estas vias checkpoint promover a sobrevivência das células tratadas com FdUrd, sugerindo que FdUrd exerce citotoxicidade por ruptura da replicação do ADN e /ou induzir danos no ADN, enquanto 5-FU não. Nós também descobrimos que a desativação da via de reparação de excisão de bases (BER), esgotando XRCC1 ou APE1 sensibilizados células cancerígenas do cólon para FdUrd mas não 5-FU. Consistente com um papel para a via BER, mostramos que pequena poli molécula (ADP-ribose) polimerase 1/2 inibidores (PARP), AZD2281 e ABT-888, notavelmente sensibilizados tanto de reparo incompatível (MMR) -proficient e câncer de cólon -deficient As linhas celulares para FdUrd mas não a 5-FU. Tomados em conjunto, estes estudos demonstram que as funções de sinalização checkpoint induzido por genotoxin e reparação do ADN diferem significativamente para estes agentes e também sugerem uma nova abordagem para a terapia do cancro do cólon em que FdUrd é combinado com um inibidor de molécula pequena de PARP.
Citação: Geng L, Huehls AM, Wagner JM, Huntoon CJ, Karnitz LM (2011) Checkpoint Signaling, base Excision Repair, e PARP promover a sobrevivência de células cancerígenas do cólon tratados com 5-fluorodesoxiuridina mas não 5-fluorouracil. PLoS ONE 6 (12): e28862. doi: 10.1371 /journal.pone.0028862
editor: Abbes Belkhiri, Vanderbilt University Medical Center, Estados Unidos da América
Recebido: 02 de agosto de 2011; Aceito: 16 de novembro de 2011; Publicado: December 15, 2011 |
Direitos de autor: © 2011 Geng et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo National Institutes of Health Grants R01-CA084321 (LK), P50-CA136393 (LK), GT32-M072474 (AH), uma clínica Eagles Prêmio Projeto piloto de Mayo, e da Clínica Mayo. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
5-fluorouracil tem actividade em vários tipos de câncer e é um dos agentes anticancerígenos mais amplamente prescritos, mas seu uso mais frequente é no câncer de cólon, onde é a base para todas as terapias modernas cancro do cólon. Depois da absorção em células, o 5-FU é submetido a reacções metabólicas complexos (Figura 1A; rev em [1]..) Para produzir 3 metabolitos citotóxicos conhecidos: FUTP (trifosfato de 5-fluorouridina), FdUMP (monofosfato de 5-desoxiuridina), e FdUTP ( trifosfato de desoxiuridina-5). O FUTP afecta o metabolismo de ARN após a sua incorporação no ARN celular, onde se interrompe snRNA, ARNt, ARNr e processamento, bem como a actividade ribonucleolítica da exossomo e pseudouridylation de ARN [2] -. [8]
( A) O metabolismo do 5-FU e FdUrd. (B, C) HT29 (B) e HCT-8 células (C) foram tratadas com 5-FU (80 uM, HT29 células; 200 um HCT-8 células), FdUrd (40? M para ambas as linhas celulares), ou 10 hidroxiureia mM (HU) durante os tempos indicados. Os extractos celulares foram transferidas para fosfo-Ser317-Chk1 (P-Chk1), fosfo-Thr68-Chk2 (P-Chk2), Chk1, Chk2 ou. Ts, timidilato-sintase; TP, timidina fosforilase; UP, uridina fosforilase; Reino Unido, cinase uridina; OPRT, fosforribosil orotate; RR, ribonucleótido-redutase; PELE, 5-fluorouridina; FUMP, monofosfato de 5-fluorouridina; FUDP, difosfato de 5-fluorouridina; FUTP, trifosfato de 5-fluorouridina; FdUMP, monofosfato de 5-fluorodesoxiuridina; FdUDP, difosfato de 5-fluorodesoxiuridina; FdUTP, trifosfato de 5-fluorodesoxiuridina.
Em contraste, FdUMP e FdUTP perturbar o metabolismo DNA. Estes metabolitos são produzidos seguindo a conversão de 5-FU para FdUrd (5-fluorodesoxiuridina; floxuridina), que também é um agente de quimioterapia aprovado pela FDA para o tratamento de cancro do cólon [9] e é muitas vezes considerado como tendo um mecanismo de acção semelhante como 5-FU. FdUrd é então fosforilado para FdUMP e ainda fosforilado para FdUTP [1]. O FdUMP inibe a timidilato sintase (TS), que impede a conversão de despejo para dtmp, em última análise, causando a depleção de dTTP, a acumulação de dUTP, e a perturbação dos rácios de dNTP. Em contraste, FdUTP, bem como o dUTP acumulada, são incorporados no ADN
De acordo com a sua capacidade para perturbar os níveis de dNTP, tanto FdUrd e 5-FU activar a via de sinalização do ponto de verificação ATR [10] -. [17 ], um caminho que é acionado quando a replicação do DNA é inibida e que também desempenha um papel crítico na promoção da sobrevivência das células sofrem de stress replicação produzida pela ruptura dNTP e /ou lesões do ADN [18]. Uma vez activada, a ATR fosforila vários substratos, incluindo Chk1. As atividades quinase coletivos de ATR e Chk1 orquestrar a barreira da fase S e regular a reparação do ADN para promover a viabilidade das células e recuperação [19]. Além disso, 5-FU e FdUrd também causar quebras duplas de DNA vertente [20], [21], que por sua vez ativam o checkpoint ATM via de sinalização. A via de ATM também regula a sobrevivência de células por qualquer indução de apoptose ou prevenção da progressão do ciclo celular e activação de reparação do ADN, ambos os quais promovem a sobrevivência [22]. Notavelmente, no entanto, não fica claro se os caminhos de checkpoint ATR e /ou ATM desempenham papéis importantes na determinação da sobrevivência de células de cancro do cólon humano, as células que são alvo de 5-FU e FdUrd em pacientes, quando são tratados com esses agentes .
o uracilo e 5-FU, que são incorporados no genoma também são reconhecidos por vias de reparação do ADN que 2 podem desempenhar papéis na sobrevivência das células tratadas com 5-FU e FdUrd. Uma via é a via de reparação de excisão de bases (BER) [1], [23]. Nesta via, genomicamente incorporada uracilo e 5-FU são primeiramente reconhecido por glicosilase de uracilo, que excisam a lesão, deixando um sitio não básico. O sitio não básico é ainda processado por uma endonuclease (por exemplo, APE1), criando um intervalo de cadeia simples de DNA que é reconhecida por poli (ADP-ribose) polimerase, que poli (ADPribosyl) atos em si, bem como outras proteínas de reparação, XRCC1 recrutamento e outras proteínas que completa reparação [24]. As investigações sobre o papel de ber em células tratadas com 5-FU ou FdUrd chegaram a conclusões diferentes que utilizam uma ampla variedade de sistemas modelo. Uma vez que estes estudos têm mostrado que a desactivação BER protege, sensibiliza, ou não tem efeito sobre a citotoxicidade induzida por 5-FU e FdUrd nestes sistemas variados, incluindo rato [17], [23], [25] – [35], ainda não está claro o que, eventualmente, o papel BER desempenha na sobrevivência das células cancerígenas do cólon expostos a 5-FU ou FdUrd.
a outra via de reparo implicado é o sistema de reparo incompatível (MMR).
In vitro
estudos descobriram que a via de MMR pode remover 5-FU a partir de substratos artificiais contendo 5-FU: G mispairs. Notavelmente, no entanto, os estudos em células sugerem que a MMR desempenha apenas um papel menor na excisão de 5-FU lesões no genoma [35]. A análise dos efeitos da via da MMR sobre a viabilidade das células após o tratamento com 5-FU e FdUrd têm geralmente indicado que as células com MMR defeituoso são mais resistentes a 5-FU e FdUrd [10], [36] – [38], um resultado consistente com a descoberta de que os pacientes com cancro do cólon MMR-defeituosos não beneficiam da terapia 5-FU [39].
Dadas as múltiplas mecanismos de acção da 5-FU e FdUrd e a grande variedade de sistemas experimentais utilizados em estes estudos (incluindo estudos em linhas de células de rato e em linhas de células humanas derivadas de tumores que não são normalmente tratados com 5-FU ou FdUrd), iniciamos estudos para abordar as funções de sinalização de ponto de verificação individual e vias de reparação de DNA em células humanas derivadas a partir de tumores humanos. Em nossa primeira análise, verificou-se que 5-FU e FdUrd têm muito diferentes mecanismos de ação em células de cancro do ovário [17]. Desactivar ATR ou BER sensibilizados para estas células FdUrd, mas não 5-FU, indicando que FdUrd mata as células, causando danos no ADN e que o 5-FU exerce a sua citotoxicidade por um outro mecanismo, possivelmente por perturbar o metabolismo do ARN. Notavelmente, também descobrimos que os inibidores de PARP, que demonstraram atividade sem precedentes contra tumores do ovário e outros tumores que se transformaram
BRCA1
e
BRCA2
[40] – cancro do ovário [43], notavelmente sensibilizados células de FdUrd mas não 5-FU [17]. Dado que FdUrd está ativo no câncer de ovário [44], [45], que os defeitos no
BRCA1
e
BRCA2
(ou outros genes na via de reparo homóloga) são comuns no cancro do ovário [ ,,,0],46], e que os inibidores de PARP têm provavelmente um papel no tratamento de cancros do ovário [24], estas descobertas sugerem uma nova estratégia terapêutica no cancro do ovário. Notavelmente, no entanto, a biologia do cancro do ovário é muito diferente da biologia do cancro do cólon. Os oncogenes e genes supressores de tumor comumente mutado em cancros do cólon (
APC, p53, PI3K, KRAS
) diferem dos genes comumente mutado em cancros do ovário (
NF1, RB1, CDK12, CCNE1, NOTCH
) [46], [47]. Além disso, as vias de reparo de DNA que estão interrompidas em células de câncer de cólon são muito diferentes daqueles interrompido em cancros do ovário. Por exemplo, os genes necessários para via de reparo mismatch (por exemplo,
MLH1
e
MSH2
) são frequentemente mutado ou epigenetically silenciado em cancros do cólon [39], [48], ao passo que defeitos em homóloga recombinação (por exemplo,
BRCA1
e
BRCA2
mutações) ocorrem em cancros do ovário [46], [47]. Finalmente, tumores do ovário e do cólon têm respostas muito diferentes a 5-FU. Considerando que 5-FU tem uma actividade muito limitada em cancro do ovário [49], [50], o 5-FU é a pedra angular de todos os regimes de quimioterapia utilizados no tratamento de cancros do cólon, devido à sua elevada actividade nesta doença [1]. Portanto, tendo em conta estas diferenças biológicas entre cânceres de ovário e cólon, eo fato de que 5-FU é universalmente usado em regimes de quimioterapia do cancro do cólon, temos agora determinado como 5-FU e FdUrd matar células cancerígenas do cólon para obter insights importantes subjacentes à biologia do estes agentes e a melhorar a sua utilização na prática clínica para o tratamento desta doença. Para esse fim, iniciamos uma análise sistemática dos papéis de sinalização ativadas por genotoxin checkpoint, a via BER, e da via MMR, esgotando intermediários de sinalização chave nessas vias usando siRNAs altamente eficazes. Estes resultados iluminar não só ainda mais a nossa compreensão dos percursos de sinalização e de reparação de ADN que são importantes nestas células, também revelam que o tumor do cólon células são sensibilizados para FdUrd por inibidores de PARP de moléculas pequenas que estão actualmente em ensaios clínicos, sugerindo, assim, um romance terapêutico abordagem que combina FdUrd, uma droga aprovada para o tratamento de cancro do cólon, com um inibidor de PARP, uma classe emergente de agentes com actividade anti-cancro excitante.
Materiais e Métodos
linhas de cultura de células e
HT29, HCT-8 e as células HCT-116 foram obtidas de American Type Culture Collection. HCT-116.ch2 e HCT-116.ch3 [51] células eram de Scott Kaufmann (Mayo Clinic). As células foram cultivadas em meio RPMI-1640 (Mediatech) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (Atlanta Biologicals) a 37 ° C em 5% de CO
2. Para os ensaios clonogénicos, o meio foi suplementado com 100 U /mL de penicilina e 100 ug /mL de estreptomicina (Mediatech)
Materiais
reagentes foram a partir dos seguintes fornecedores:. 5-fluorouracilo (APP Pharmaceuticals ), FdUrd (Bedford Laboratories), ABT-888 (Selleck produtos químicos e ChemieTek), AZD2281 (ChemieTek), KU-55933 (Tocris Bioscience), gemcitabina (Eli Lilly), SuperSignal Pico Oeste (Thermo Scientific). Todos os outros materiais eram de Sigma-Aldrich
os anticorpos foram como se segue:. Fosfo-Ser317-Chk1 (R D Systems); fosfo-Thr68-Chk2, ATR, IgG de coelho ligados a peroxidase de rábano silvestre, e a peroxidase de rábano ligada a IgG de murganho (Cell Signaling); Chk1 (Santa Cruz Biotechnology); Chk2 e ATM (Epitomics); APE1 (Abcam); XRCC1 (Bethyl Laboratories); beta-actina (Sigma-Aldrich); e HSP90, D. Toft (Mayo Clinic, Rochester, MN).
transfecções de células e pequenos interferentes (Si) RNAs
siRNAs foram transfectadas por electroporação, como descrito [17]. As células transfectadas foram cultivadas durante 48 h antes da utilização. Sequências de ARNsi foram: MTA-1, 5′-GCACCAGUCCAGUAUUGGC-3 ‘[52]; ATR-2, 5’-CCUCCGUGAUGUUGCUUGA-3 ‘[53]; XRCC1-2, 5’-CUCGACUCACUGUGCAGAA-3 ‘[54]; APE1, 5’-GGACAGAGCCAGAGGCCAA-3 ‘; MLH1, 5’-GGAAGAUUCUGAUGUGGAA-3 ‘; MSH2, 5’-GAUCCUAAUCUCAGUGAAU-3 ‘; e luciferase, 5’-CUUACGCUGAGUACUUCGA-3 ‘[55].
foram realizados
ensaios clonogénicos, lise celular, e irradiação de células
análises do ciclo celular, ensaios clonog�icas, lise celular, immunoblotting e imunocoloração como descrito [56], [57]. Para os ensaios de clonog�icas usando células não transfectadas, por cento sobrevivências de todos os tratamentos individuais e combinadas foram normalizados para células tratadas com apenas veículo. Para os ensaios clonogénicos com células transfectadas com ARNsi, por cento sobreviventes em cada concentração da droga foram normalizados para o controlo tratado com o veículo para o dado de siRNA. As células foram irradiadas com um 4-6 h RS-2000 irradiador Biológica, Rad Fonte (Suwanee, GA) após o plaqueamento.
Resultados
5-FU e FdUrd ativar a sinalização de checkpoint ATR e ATM percursos em células cancerígenas do cólon
para avaliar os efeitos de 5-FU e FdUrd sobre as vias de sinalização ATM e ATR checkpoint, foram comparadas as capacidades desses agentes para ativar checkpoint sinalização em linhas celulares de cancro do cólon dois: HT29, que tem um sistema funcional de MMR, e HCT-8, que tem uma mutação em
MSH6
e são MMR deficiente [58]. As células foram tratadas com concentrações de cada um dos agentes que inibem a clonogenicidade em 90% (IC
90) e, como um controlo positivo, o inibidor de replicação de hidroxiureia. A activação das vias de ATM e ATR foi então avaliada por imunotransf erência para fosforilada Chk1 e Chk2, duas cinases de proteínas que são fosforiladas e activadas pela ATR e ATM [59]. Estes estudos revelaram que o 5-FU e FdUrd fortemente activado Chk1 e Chk2 em células HT29 (Fig. 1B), com 5-FU causando ainda maiores níveis de fosforilação de Chk1 que fez FdUrd. Do mesmo modo, em células HCT-8, ambos os agentes de fosforilação induzida de Chk1 (Fig. 1C); No entanto, nestas células 5-FU induziu menos de Chk1 do que FdUrd. As análises de Chk2 fosforilação não foram possíveis devido aos níveis muito baixos de Chk2 nas células HCT-8 (dados não apresentados). Tomados em conjunto, estes resultados demonstram que ambos os agentes causar danos genotóxico que ativa vias de sinalização de ponto de verificação em células de câncer de cólon.
ATR e ATM promover a sobrevivência de células cancerígenas do cólon tratados com FdUrd mas não 5-FU
ATM e ATR são os dois reguladores quinase apicais de sinalização de checkpoint induzido por genotoxin. Para determinar se qualquer uma ATM ou ATR activar caminhos que afectam a sobrevivência das células tratadas com FdUrd ou 5-FU, que transitoriamente empobrecido ATM e ATR utilizando ARNsi, e, em seguida, avaliada a capacidade das células tratadas com concentrações crescentes de FdUrd ou 5-FU proliferar utilizando ensaios clonogénicos. Surpreendentemente, a depleção de ATM ou ATR não sensibilizam ambos linha celular de 5-FU (Fig. 2A e 2B), apesar de este agente activado estas vias (ver Fig. 1B e 1C). Uma imagem muito diferente emergiu quando as células foram tratadas com FdUrd. Depleção de ATR sensibilizados dramaticamente células HT29 para FdUrd (Fig. 2B) e a gemcitabina (Fig. S1A), um análogo de nucleósido que inibe a ribonucleótido redutase e interrompe a replicação do ADN quando incorporado no ADN [60]. Em contraste, a depleção de ATM (Fig. 2A) e o inibidor da ATM KU-55933 [61] (Fig. S1C), ambos os quais sensibilizados a radiação ionizante (Fig. S1B e Fig S1D), teve efeitos mínimos sobre a citotoxicidade FdUrd. Resultados semelhantes foram também observadas no HCT-8 e as células HCT-116, em que a depleção ATR sensibilizados ambas as linhas celulares para FdUrd mas não 5-FU (Fig. 3).
(B, A) As células HT29, transfectada com controlo (Luc), ATM (a), ou ATR (B) siRNAs, foram plaqueadas como células individuais, expostas às concentrações indicadas de 5-FU ou FdUrd durante 24 h, lavadas, cultivadas durante 10 d, e coradas com azul de Coomassie. As células transfectadas foram coradas imunologicamente também sequencialmente (inserções) para detectar ATM, ATR, e HSP90 (como um controlo de carga). *, Banda não específica.
(A, B) de HCT-8 (A) ou culas transfectadas com controlo de HCT-116 (b) (Luc) ou ATR siRNAs foram plaqueadas como células individuais, exposto às concentrações indicadas de 5-FU ou FdUrd durante 24 h, lavadas, cultivadas durante 10 d, e corado com azul de Coomassie. As células transfectadas foram também imunologicamente sequencialmente para ATR e HSP90 (um controle de carga). *, Faixa não-específica.
O rompimento da BER, esgotando XRCC1 sensibiliza para FdUrd mas não 5-FU
5-FU e FdUrd causar o acúmulo de uracilo e 5-fluorouracil no ADN genómico [23], [62]. Estudos utilizando glicosilase de uracilo purificados mostraram que os substratos sintéticos tendo uracilo e 5-fluorouracilo substituintes são substratos para as máquinas BER [35], [63] – [70]. Além disso, um estudo recente demonstrou que em células intactas, glicosilase de uracilo remover o 5-FU a partir dos genomas de células de cancro do cólon expostos a FdUrd [35]; Notavelmente, no entanto, nestes estudos, o esgotamento das glicosilases não afectou a sensibilidade a FdUrd. Portanto, para examinar se a desativação BER afetou a sensibilidade das células HT29 a FdUrd, usamos siRNAs para esgotar XRCC1 e APE1, dois participantes-chave a jusante da via BER, e examinou a sua sensibilidade à FdUrd. Significativamente, a depleção de XRCC1 (Fig. 4) e APE1 (Fig. S2) células sensibilizadas para FdUrd. Em contraste, a depleção XRCC1 não sensibilizar estas células a 5-FU (Fig. 4), indicando assim que a BER não desempenha um papel na promoção da sobrevivência das células tratadas com 5-FU e após o que sugere que o 5-FU exerce a sua citotóxica efeitos de forma independente de replicação do ADN ou danos.
HT29 células transfectadas com o controlo (Luc) ou XRCC1 siRNA foram plaqueadas como células individuais, exposto às concentrações indicadas de 5-FU ou FdUrd durante 24 h, lavadas, cultivadas durante 10 d, e corado com azul de Coomassie. As células transfectadas foram também imunologicamente sequencialmente para XRCC1 e beta-actina (um controle de carga).
inibidores de PARP de moléculas pequenas sensibilizar células de câncer de cólon para FdUrd mas não 5-FU
Tendo em conta que XRCC1 e APE1 exaustão sensibilizados células cancerígenas do cólon para FdUrd, e que PARP desempenha um papel fundamental na RIC, que argumentou que os inibidores da PARP pode sensibilizar células cancerígenas do cólon para FdUrd. Por conseguinte, exposta células HCT-8 e HT29 a concentrações graduais de FdUrd ou 5-FU, juntamente com 3 uM de ABT-888 (veliparib [71]), uma concentração que foi relatado anteriormente para sensibilizar várias linhas de células de tumor a uma variedade de agentes de quimioterapia [17], [72]. Como mostrado na Fig. 5, ABT-888 robustamente sensibilizados células HCT-8 e HT29 para FdUrd, enquanto que ABT-888 não alterou os efeitos antiproliferativos de 5-FU. Para demonstrar ainda que os inibidores de PARP sensibilizar estas células para FdUrd, nós também testado o inibidor de PARP AZD2281 (olaparibe [73]), que demonstrou actividade sem precedentes em pacientes pré-tratados intensivamente com BRCA1- e BRCA2 tumores deficientes em [40] – [43] . De forma semelhante aos resultados observados com o ABT-888, AZD2281 robustamente sensibilizados ambas as linhas celulares para FdUrd (Fig. 5), apoiando ainda mais a ideia de que a inibição de PARP sensibiliza as células de tumor do cólon de FdUrd.
Células HCT-8 ou HT29 foram plaqueadas como células individuais, expostas às concentrações indicadas de 5-FU ou FdUrd juntamente com 3 uM de ABT-888, 300 nM de AZD2281 ou veículo durante 24 h. A seguir à lavagem, 3 uM foram re-adicionado ABT-888 ou 300 nM de AZD2281, e as células foram cultivadas durante 10 d, e corado com azul de Coomassie.
pequeno sensibilização molécula de inibidor de PARP de FdUrd é independente de estatuto MMR
relatórios anteriores demonstraram que as células com defeitos de MMR são mais resistentes a FdUrd [10], [36] – [38]. Da mesma forma, os pacientes tratados com 5-FU não beneficiam de 5 baseados em-FU quimioterapias [39], o que sugere que uma via de MMR intactos promove matando pelo 5-FU. Por causa da combinação FdUrd com um inibidor da PARP pode ser uma estratégia terapêutica potencial, nós concluímos que seria importante para determinar se as células de tumores com defeitos na MMR, que ocorrem em 15-20% dos cancros do cólon [39], foram sensibilizados para FdUrd pela um inibidor de PARP. Para avaliar como o estado de MMR afeta a sensibilidade das células de cancro do cólon para FdUrd sozinho e à combinação de FdUrd mais AZD2281 foram utilizados dois sistemas modelo. Para o primeiro sistema modelo, usamos siRNAs para esgotar MSH2 e MLH1. Ambos os siRNAs foram altamente eficazes, provocando a perda quase completa de MLH1 e MSH2 (Fig. 6A) e interrompendo MNNG (N-metil-N’-nitro-N-nitrosoguanidina) induzida G2 /M prisão (Fig. S3), que requer uma via MMR funcional [51]. Notavelmente, HT29 células desprovidas de MLH1 ou MSH2 foram severamente sensibilizados para FdUrd por AZD2281, e foram modestamente resistente a sós FdUrd.
(A) células HT29 transfectadas com o controle (Luc), sRNAs MSH2, MLH1 ou foram semeadas como células individuais, expostas às concentrações indicadas de 5-FU ou FdUrd durante 24 h, lavadas, cultivadas durante 10 d, e corado com azul Coomassie. As células transfectadas foram coradas imunologicamente também sequencialmente para MSH2 ou MLH1 e beta-actina (um controlo de carga). células HCT116.ch2 HCT116.ch3 e (B) foram expostas às concentrações indicadas de FdUrd juntamente com o veículo ou 300 nM de AZD2281 durante 24 h. Após a lavagem, foi adicionado novamente AZD2281 e as células foram cultivadas por 8 d para permitir a formação de colónias.
Para o segundo sistema modelo, foi utilizado o emparelhados células do cólon linhas, HCT-116.ch2 e HCT-116.ch3 [51]. Estas linhas celulares foram derivadas de células parentais HCT-116, que têm de inactivação bialélico
MLH1
mutações que os tornam-MMR deficiente [74]. As células HCT-116.ch3 contêm um cromossoma 3 adicional, o qual codifica um MLH1 funcional que restaura MMR. As células HCT-116.ch2, que são utilizados como um controlo, contêm um cromossoma adicional 2 e como as células parentais são MMR-deficiente. Consistente com os resultados previamente publicados, as células HCT-116.ch2 deficiência de MMR foram modestamente mais resistentes a FdUrd que eram as células HCT-116.ch3 (Fig. 6B), que são proficientes MMR [75]. Notavelmente, no entanto, AZD2281 robustamente sensibilizados ambas as linhas celulares para FdUrd. Tomados em conjunto, estes resultados demonstram que células cancerígenas do cólon com defeitos na via MMR também pode ser sensibilizado a FdUrd por uma pequena molécula inibidora de PARP.
Discussão
5-FU é um dos mais amplamente agentes anticancerígenos quimioterápicos usados, e (ou a pró-droga capecitabina 5-FU) é a espinha dorsal de todos os regimes de quimioterapia utilizados para tratar o cancro do cólon [1], a terceira principal causa de morte relacionada ao câncer nos Estados Unidos [76]. Apesar de seu uso generalizado no tratamento de câncer de cólon, não se sabe como este agente mata as células tumorais de cólon. Da mesma forma, FdUrd, que é muitas vezes considerado como tendo um mecanismo de acção semelhante ao 5-FU, é também utilizado para tratar tumores do cólon que têm metástase para o fígado. Para obter insights sobre como esses agentes afetar células cancerígenas do cólon, primeiro realizadas análises completas dos papéis do checkpoint ATM e ATR percursos em células cancerígenas do cólon expostos a 5-FU e FdUrd sinalização, e depois analisaram o papel da via BER, uma via de reparação do que remove uracilo e uracilo análogos que são incorporados no genoma. Nós comparadas anteriormente os mecanismos pelos quais a 5-FU e FdUrd matar células de cancro do ovário. actividade Notavelmente, no entanto, o 5-FU tem muito limitado clínicos contra o cancro do ovário [49], [50], e as vias de reparação de ADN que são interrompidos no cancro do ovário diferem daqueles interrompido no cancro do cólon. Especificamente, cânceres de ovário apresentam frequentemente “BRCAness” devido a defeitos de
BRCA1
ou
BRCA2
, ou outras alterações mal definidas que interrompem a via de reparação do ADN de recombinação homóloga [46]. Em contraste, nos cancros do cólon da via de reparação de emparelhamentos incorrectos é frequentemente mutado ou silenciados [39], [48], e da via de MMR tem sido relatada a afectar a morte celular por 5-FU e FdUrd [36] – [38], [77 ], [78]. Portanto, no presente relatório, realizamos comparação head-to-head destes agentes em células cancerígenas do cólon MMR-proficientes e -deficient que foram esgotados de intermediários chave de sinalização ponto de verificação e da via BER. É importante ressaltar que esses estudos mecanicistas ter descoberto novos insights sobre como esses agentes matar células cancerígenas do cólon e identificou uma estratégia terapêutica potencial contra o cancro do cólon.
Em primeiro lugar, nossos estudos demonstraram a ATR-mas de sinalização e não o ATM-checkpoint execuções via um papel crítico facilitar a sobrevivência das células tratadas com FdUrd. Embora estudos anteriores documentaram que FdUrd ativa os ATM- e ATR-dependentes checkpoints [10], [13], [79], esses estudos não compararam os efeitos da ATM e ATR depletions na sobrevivência das células tumorais expostas aos dois agentes. Aqui abordamos essa questão. Surpreendentemente, descobrimos que, apesar de FdUrd tem sido relatada a causar quebras de cadeia dupla de ADN [20], [21], ATM tem apenas um papel menor na morte induzida FdUrd. Em contraste, a depleção de ATR severamente sensibilizados para FdUrd, demonstrando que a ATR desempenha um papel crítico na estabilização de garfos de replicação paralisadas e impedindo o seu colapso, promovendo, assim, a sobrevivência das células quando as células são tratadas com inibidores de replicação tais como a gemcitabina nucleósido análogo [60]. Portanto, os presentes estudos sugerem que a interrupção da replicação do DNA que ocorre quando TS é inibida e consequentes perturbações dos níveis de dNTP é provável um mecanismo importante pelo qual FdUrd causa citotoxicidade.
Em segundo lugar, os presentes resultados ajudar a esclarecer o papel de ber em células cancerígenas do cólon exposto a 5-FU e FdUrd. Estudos anteriores examinaram o papel da via BER encontraram resultados díspares, com aumentada, diminuída, ou sensibilidade inalterado em 5-FU ou FdUrd em uma variedade de sistemas experimentais [17], [23], [25] – [35]. Em contraste, os presentes resultados demonstram que a depleção XRCC1 sensibiliza a FdUrd mas não 5-FU. Esta descoberta, juntamente com os nossos estudos publicados mostrando que uma via BER intacta protege as células cancerosas do ovário, tratadas com FdUrd [17], indica que FdUrd inflige lesões que são citotóxicos para algumas células cancerosas humanas. Consistente com estes resultados, dois inibidores de pequenas moléculas potentes e altamente específicas de PARP também sensibilizados para FdUrd. Estes resultados são semelhantes ao que foi observado em células de cancro do ovário [17]. No entanto, dado que as células de câncer de ovário apresentam frequentemente BRCAness (devido a defeito na recombinação homóloga) [46], [80], um fenótipo que torna as células sensíveis a inibidores de PARP [81], manteve-se uma pergunta não respondida se os inibidores de PARP seria também sensibilizar para FdUrd em células de cancro do cólon, que não têm defeitos de recombinação homóloga. Deve notar-se, no entanto, que embora as nossas descobertas apoiam fortemente XRCC1 um papel protector para BER, os efeitos dos inibidores da PARP podem ser mais complicadas. PARP não só desempenha um papel importante em RIC, mas também participa em outras vias de reparação do ADN e vias de sinalização de células, aumentando a possibilidade de que a tremenda sensibilização visto com os inibidores de PARP pode resultar de efeitos sobre a BER, bem como outras vias celulares.
em terceiro lugar, os presentes estudos mostram que esgotar os reguladores apicais da sinalização de ponto de verificação (ATR e ATM) ou desativação membros da via BER-chave (com XRCC1 e APE1 siRNAs ou inibidores de PARP) não sensibilizaram a 5-FU. Tais resultados sugerem fortemente que o 5-FU está a exercer os seus efeitos citotóxicos de forma independente dos seus efeitos na replicação de ADN ou a sua integridade. Notavelmente, este resultado é consistente com um número de estudos que mostram que a 5-FU medeia a morte celular por incorporação no ARN e interferir com o metabolismo do ARN [82] – [89]. Em contraste, a constatação de que a desactivação das vias ATR e BER sensibiliza fortemente a FdUrd, indica que este agente mata as células de tumor do cólon principalmente afectando o metabolismo do ADN, demonstrando, assim, que o 5-FU e FdUrd têm diferentes mecanismos de acção.
Finalmente, e mais importante ainda, esses estudos, que foram iniciadas para identificar o ponto de verificação e reparo de DNA vias que regulam as respostas de tumor do cólon para FdUrd e 5-FU, demonstrou que RIC era uma via de reparo crítico quando essas células foram expostas a FdUrd ( mas não 5-FU). Com base nestas descobertas, eo fato de que os inibidores de PARP perturbar BER, que, em seguida, descobriu que os inibidores de PARP molécula pequenas robustamente sensibilizados células cancerígenas do cólon MMR-deficientes e -proficient para FdUrd (mas não 5-FU). Estes resultados podem ser de particular importância em tumores com defeitos na MMR, que respondem por 15-20% de todos os cancros do cólon [39]. Estudos anteriores verificou que as linhas celulares deficientes em MMR são menos sensíveis ao 5-FU e FdUrd. Consistente com este resultado, os estudos clínicos mostraram que 5-FU tem uma actividade limitada contra os cancros do cólon MMR deficientes em comparação com tumores MMR-proficientes [39]. Dado que um) FdUrd é aprovado para o tratamento de cancro do cólon; e 2) não se limitam as opções terapêuticas para esses tumores porque os tumores com defeitos de MMR são geralmente considerados como não responder às terapias à base de 5-FU, a nossa descoberta de que os inibidores de PARP robustamente sensibilizar células MMR deficientes para FdUrd levanta a possibilidade de que as terapias que combinar FdUrd com um inibidor da PARP pode possuir actividade contra estes tumores. Do mesmo modo, porque os inibidores da PARP também sensibilizar tumores proficientes desadaptação se FdUrd, esta combinação de drogas podem também ser úteis no tratamento desses tumores. Além disso desenvolvimento pré-clínico e clínico desta combinação é garantido.
Informações de Apoio
Figura S1.
Efeitos de perturbações ATR e ATM na sensibilidade à gemcitabina e radiação ionizante. (A) a depleção ATR sensibiliza a gemcitabina. células HT29 transfectadas com controlo (Luc) ou ATR siRNAs de experiência mostrada na fig. 2B foram plaqueadas como células individuais, exposto às concentrações indicadas de gemcitabina durante 24 h, lavadas e cultivadas durante 10 d para permitir a formação de colónias. depletions (B) ATM sensibilizar a radiação ionizante (IR). células HT29 transfectadas com controlo (Luc) ou ATM siRNAs de experiência mostrada na fig. 2A foram plaqueadas como células individuais, expostas às doses indicadas de radiação ionizante, e cultivou-se durante 10 d para permitir a formação de colónias.