Abstract
cancro do pulmão de pequenas células (CPPC) é uma tumor agressivo e prognóstico permanece pobre. Portanto, é necessário o desenvolvimento de uma terapia mais eficaz. Nós anteriormente relatado que os níveis elevados de um anticorpo anti-c-kit (12A8) acumulada em xenoenxertos de SCLC. No presente estudo, foi avaliada a eficácia de dois anticorpos (12A8 e 67A2) para radioimunoterapia (RIT) de um modelo de SCLC rato por marcação com o
isótopo 90Y.
Métodos
111In- ou anticorpos
marcado com 125I foram avaliadas
in vitro
por ligação, ensaios de inibição competitiva e internalização celular em células SY c-expressando-kit celular e
in vivo
por biodistribuição em camundongos SY-rolamento. A eficácia terapêutica de
anticorpos marcados com 90Y foi avaliada em ratinhos upto dia 28 e análise histológica SY-rolamento foi realizado no dia 7.
Resultados
[
111In] 12A8 e [
111In] 67A2 ligado especificamente às células SY com elevada afinidade (8,0 e 1,9 nM, respectivamente). 67A2 foi internalizado semelhante ao 12A8. Altos níveis de [
111In] 12A8 e [
111In] 67A2 acumulados em tumores, mas não nos principais órgãos. [
111In] 67A2 captação pelo tumor foi 1,7 vezes maior do que para [
111In] 12A8. [
90Y] 12A8, mas não [
90Y] 67A2, suprimiu o crescimento do tumor de um modo dependente da dose. Os tumores tratados com 3,7 MBq de [
90Y] 12A8, e 1,85 e 3,7 MBq de [
90Y] 67A2 (doses absorvidas foram de 21,0, 18,0 e 35,9 Gy, respectivamente) desapareceram quase completamente aproximadamente 2 semanas após a injecção, e rebrota não foi observado, exceto em um rato tratado com 1,85 MBq [
90Y] 67A2. A área de necrose e fibrose aumentada, dependendo do efeito RIT. o número de células em apoptose aumentou com o aumento das doses de [
90Y] 12A8, enquanto nenhum aumento dependente da dose foi observada após [
90Y] 67A2 tratamento. O peso corporal foi temporariamente reduzido, mas todos os ratos toleraram os experimentos RIT bem.
Conclusão
O tratamento com [
90Y] 12A8 e [
90Y] 67A2 alcançado uma resposta terapêutica completa quando tumores SY recebeu uma dose absorvida maior que 18 Gy e, portanto, são promissores agentes RIT para células SCLC metastáticas em locais distantes
Citation:. Yoshida C, Tsuji AB, Sudo H, Sugyo a, Kikuchi T, Koizumi M, et ai. (2013) Therapeutic Eficácia da radioimunoterapia C-Kit segmentadas utilizando anticorpos anti-C-Kit marcado com 90Y em um rato modelo de pequenas células do câncer pulmonar. PLoS ONE 8 (3): e59248. doi: 10.1371 /journal.pone.0059248
editor: Javier S. Castresana, da Universidade de Navarra, Espanha |
Recebido: 02 de setembro de 2012; Aceito: 13 de fevereiro de 2013; Publicação: 14 de março de 2013
Direitos de autor: © 2013 Yoshida et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este estudo foi financiado pelo Instituto Nacional de Ciências radiológicas para TS. O financiador não teve nenhum papel no desenho do estudo, recolha e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
o cancro do pulmão é a principal causa de morte relacionada ao câncer em todo o mundo [1]. cancro do pulmão de pequenas células (CPPC) é uma entidade clínico-patológica distinta que responde por até 20% de todos os cancros do pulmão e é distinguido por câncer de pulmão de não pequenas células pelo seu tempo de duplicação rápida do tumor, a fração de elevado crescimento e desenvolvimento precoce de metástases generalizadas [ ,,,0],2]. Embora SCLC é muito sensível à quimioterapia e radioterapia, o prognóstico geral permanece fraca por causa da alta recorrência ou taxas metastáticos, e a fraca resposta da CPPC refractário [2], [3]. A sobrevida média para pacientes com SCLC recorrente é de aproximadamente seis meses [3].
Recentemente, muitos medicamentos direcionados moleculares têm sido desenvolvidos que contribuem para a melhora da sobrevida de pacientes com vários tipos de câncer [4]. Quimioterapia altamente expressar várias moléculas, tais como c-Kit, c-Met e o factor de crescimento endotelial vascular [4]. O c-kit de proto-oncogene codifica um receptor transmembranar da tirosina quinase de 145 kDa constituído por uma porção extracelular com cinco domínios semelhantes a imunoglobulina: os três primeiros conter um local de ligação ao ligando e os quarto e quinto domínios estão associados com a dimerização do receptor, a transmembranar porção, e a porção intracelular possuindo a actividade enzimática da cinase [5], [6], [7]. factor de células estaminais é um ligando para o c-kit e seus terminais de ligação para activação do receptor e desencadeia a activação de vias de sinalização a jusante envolvidos no crescimento celular, diferenciação e desenvolvimento. C-kit está implicado no crescimento celular rápida observada em SCLC e, portanto, é considerada uma molécula alvo candidato para diagnóstico e terapêutica de SCLC [8]. Imatinib, um inibidor da actividade de c-kit-tirosina quinase, é altamente eficaz contra tumores estromais gastrointestinais quimioterapia-resistente (GIST) [9], [10]. Apesar de vários estudos pré-clínicos relatou que a supressão da sinalização de c-kit inibe o crescimento de células SCLC [4], [11], a fase II de testes imatinib em doentes com recidiva c-kit positivo SCLC não relataram respostas objetivas ou estabilização da doença sustentado [12], [13], [14]. Isto sugere que a progressão pode não depender de c-kit, devido à falta de activação de mutações ao contrário de GIST, apesar da elevada expressão de c-kit em CPPC [15], [16]. Embora o bloqueio da via c-kit pode não ter um efeito terapêutico em CPPC, c-kit pode ser um alvo promissor para o fornecimento selectivo de agentes terapêuticos, tais como toxinas e radioisótopos a células tumorais SCLC positivos de c-kit por meio de transportadores tais como anticorpos.
Nós relatado anteriormente que altos níveis de
anticorpo anti-c-kit 111In-rotulados, 12A8, acumulado no c-kit-expressando xenotransplantes SCLC, enquanto que a sua acumulação foi baixa em órgãos normais [ ,,,0],17], [18]. Portanto, 12A8 tem o potencial de ser utilizados para radioimunoterapia (RIT) substituindo pelo γ emissores
111In com β- ou radionuclídeos emissores alfa com propriedades nucleares adequadas. O conceito de RIT foi realizado em clínicas para o tratamento de linfoma não Hodgkin de células B, utilizando o anticorpo anti-CD20 marcado com
90Y ou
131I [19].
90Y é um β-emissor puro com alta energia (energia máxima, 2,3 MeV), gama de comprimento de partículas (gama máxima em água, 11,3 mm), uma meia-vida apropriada (64.1 h) para RIT com IgG e adequado para RIT com um anticorpo de internalização [19], [20]. No presente estudo, foi avaliada e comparada a
in vitro
e
in vivo
propriedades de dois anticorpos radiomarcados anti-c-kit monoclonais, 12A8 e 67A2, e seu uso na RIT experimental de SCLC usando
anticorpos marcados com 90Y.
Materiais e Métodos
células
A linha de células SCLC humana SY (Immuno-Biological Laboratories (IBL), Takasaki, Japão ) que tem alta expressão de c-kit foi mantida em RPMI1640 (Sigma, St. Louis, MO, EUA) contendo soro fetal bovino a 5% (Sigma, St. Louis, MO, EUA) numa incubadora humidificada mantida a 37 ° C com 5% de CO
2.
Os anticorpos
Dois anticorpos monoclonais de rato anti-c-kit (12A8 [17] e 67A2) foram adquiridas da IBL. Cada anticorpo se liga a um epitopo diferente sobre a porção extracelular de c-kit: 12A8 liga-se ao quinto domínio mais próximo do domínio transmembranar e 67A2 liga-se ao segundo domínio. A constante de equilíbrio de dissociação (Kd) de 12A8 e 67A2 é de 1,06 e 0,26 nM, respectivamente, tal como medido por um ensaio de ressonância de plasmon de superfície. 12A8 tem actividades anti-tumorais e de neutralização fortes moderados, mas não induz citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) ou citotoxicidade dependente do complemento (CDC). O 67A2 não possuem qualquer uma das atividades acima mencionadas (informação fornecida pelo fabricante).
A marcação radioactiva de anticorpos
Os anticorpos (12A8 e 67A2) foram conjugados com
p
-SCN-Bz-CHX-a ” – de DTPA (DTPA; Macrocyclics, Dallas, TX, EUA) como descrito anteriormente [17], [18], e, em seguida, anticorpos DTPA-conjugados foram purificados utilizando uma coluna de Sephadex G-50 (GE Healthcare, Little Chalfont, UK) coluna. Estes anticorpos DTPA-conjugada (20 ug) foram misturados com 1,2 MBq de [
111In] Cl
3 ou 9,25 MBq de [
90Y] Cl
3 em tampão de acetato 0,5 M (pH 6,0) , e a mistura foi incubada durante 30 min à temperatura ambiente. anticorpos radiomarcados foram separados de livre 90Y
111In ou
utilizando uma coluna de Sephadex G-50. A proporção da conjugação de DTPA para ambos os anticorpos foi calculada em 1,1, tal como determinado por electroforese em acetato de celulose, e as actividades específicas de [
111In] 12A8, [
111In] 67A2, [
90Y] 12A8 e [
90Y] 67A2 foram de aproximadamente 50, 50, 300 e 450 kBq /ug, respectivamente. O rendimento da marcação foi de aproximadamente 80% para a rotulagem
111In e 65% a 97% de
90Y rotulagem, e a pureza radioquímica excedeu 96%. 67A2 também foi marcado com
125I utilizando cloramina-T para o ensaio de interiorização como previamente descrito [17]. A actividade específica de [
125I] 67A2 foi de aproximadamente 500 kBq /ug.
In vitro
ensaio
celular de ligação, ensaios de inibição e internalização competitivos foram conduzidos como previamente descrito [17]. Resumidamente, num ensaio de ligação celular, as células-SY serialmente diluídas em PBS foram incubados com o anticorpo
111In-marcado em gelo durante 60 min. Após lavagem, a radioactividade ligada às células foi medida. A imunorreatividade dos
anticorpos 111In-rotulados foi estimada de acordo com o método de Lindmo
et al
[21]. Num ensaio de inibição competitiva, o anticorpo marcado com 111In-
foi incubado com células SY na presença de concentrações variáveis do anticorpo não marcado em gelo durante 60 min. Após lavagem, a radioactividade ligada às células foi contada. Os dados foram analisados e o Kd foi estimado utilizando o software GraphPad Prism (GraphPad Software, La Jolla, CA, EUA). Em um ensaio de internalização, as células SY foram pré-incubadas em meio de cultura com
125I- ou
anticorpo no gelo 111In marcado para 60 min. Após lavagem, as células foram recolhidas a cultura prosseguiu a 37 ° C ou sobre gelo em meio fresco sem anticorpos radiomarcados. Em vários pontos de tempo, o sobrenadante e as células foram separadas por centrifugação. ácido tricloroacético foi adicionado ao sobrenadante em gelo e, em seguida, separado por centrifugação para determinar a fracção não ligada a proteína (sobrenadante) e fracção ligada à proteína (sedimento). As células foram lavadas com tampão acidico e, em seguida, separado por centrifugação para determinar tanto a ligada à membrana (sobrenadante) e internalizado fracção (sedimento).
Biodistribuição de
111In-rotulados
de anticorpo
ratinhos BALB /c-nu /nu (5 semanas de idade, CLEA Japan, Tóquio, Japão) foram inoculados subcutaneamente com 2 × 10
6 células SY na coxa esquerda. Ratos (19 a 23 g de peso corporal) tumores SY rolamento foram injectados intravenosamente com 37 kBq de
anticorpo 111In-rotulados. A dose de proteína injectada foi ajustada a 20 ug por ratinho. A 1, 2, 4, 7 e 10 dias após a injecção de
111In anticorpo marcado, cinco ratinhos em cada ponto de tempo foram sacrificados, e colheu-se sangue a partir do coração. O tumor e os órgãos principais foram removidos e pesados, e as contagens de radioactividade foi medida usando um contador gama. Os dados foram expressos como a percentagem de dose injectada por grama de tecido (% ID /g) decaimento-corrigido e normalizadas para a 20 g de peso corporal do rato.
A dose absorvida de tumor para
90Y- anticorpos marcados foi estimada a partir dos dados de biodistribuição de
anticorpos 111In-rotulados.
90Y emite um β-partícula com uma média energia emitida de 0,9331 MeV, assim, a energia emitida por transição média foi calculada como 1.495 × 10
-13 Gy kg (Bq s)
-1 baseado em 1 eV é igual to1.60218 × 10
-19 J [22]. absorção de tumor em vários pontos de tempo foi representada graficamente contra o tempo, a partir da qual foi calculada a área sob a curva (AUC). A dose absorvida pelo tumor até 10 dias após a injecção foi estimada utilizando a AUC média e a energia emitida por transição como segue: AUC × 1,495 × 10
-13 × actividade injectada. A dose absorvida pelo medula vermelha em um homem de referência de 70 kg foi estimada a partir de nossos dados de biodistribuição usando software OLINDA /EXM versão 1.0 (Universidade Vanderbilt, em Nashville, TN, EUA) como descrito anteriormente [23].
Radioimunoterapia
Duas semanas após a inoculação de células SY, os ratinhos receberam uma injecção intravenosa de 0,74, 1,85 ou 3,7 MBq de
anticorpo marcado com 90Y (n = 5 para cada grupo). O tamanho do tumor foi de 4,4 ± 3,2 milímetros
3 no momento da administração. A dose de proteína foi ajustada a 20 ug de cada preparação por adição de anticorpo não marcado. Como controlos negativos, os ratinhos foram injectados intravenosamente com o anticorpo não marcado (20 ug de proteína /ratinho) ou PBS sozinho (definido como sem tratamento), respectivamente. O peso corporal e o crescimento do tumor foi determinado duas vezes por semana. O volume do tumor (mm
3) foi calculado como a altura x largura x profundidade (mm) /2. Os ratos foram sacrificados quando o volume do tumor xenoenxerto chegou a mais de 200 mm
3. Este protocolo experimental foi aprovado pelo Comitê de Cuidado e Uso Institucional Animal do Instituto Nacional de Ciências Radiológicas, e todas as experiências com animais foram conduzidos de acordo com as diretrizes institucionais sobre cuidados com os animais e manipulação.
A análise histológica
amostras tumorais foram removidas uma semana após a injecção e fixadas em 10% (v /v) de formalina tamponada neutra e embebidos em parafina para seccionamento (n = 5 para cada grupo). Seções (3 mm de espessura) foram coradas com hematoxilina e eosina (H E). As células apoptóticas no tumor foram detectadas pelo terminal de desoxinucleotidil-transferase mediada desoxiuridina trifosfato de rotulagem nick-fim (TUNEL) coloração utilizando um ApopTag Além disso peroxidase
In Situ
kit de detecção da apoptose (Chemicon International, Temecula, CA) como previamente descrito [24]. Foram quantificados células TUNEL-coradas em pelo menos cinco campos selecionados aleatoriamente em 400 × ampliação.
A análise estatística
Os dados de crescimento do tumor foram analisados por duas vias para medidas repetidas ANOVA com o Student-Newman -Keuls método de múltipla teste de comparação. dados de celular por apoptose foram analisados por estudante do
t
-teste. Um valor de
P
. 0,05 foi considerado estatisticamente significativo
Resultados
In vitro
caracterização de
anticorpos 111In-rotulados
a partir do ensaio de ligação de células, a ligação de [
111In] 12A8 e [
111In] 67A2 utilizando 1 × 10
7 células SY foi de 50 e 76%, respectivamente (Fig. 1A). A ligação de [
111In] 67A2 para células SY foi mais elevada em comparação com a de [
111In] 12A8, especialmente em concentrações celulares baixas. A fracção imunorreactiva de [
111In] 12A8 e [
111In] 67A2 foi de 83 e 88%, respectivamente. A partir do ensaio de inibição competitiva, o Kd de [
111In] 12A8 e [
111In] 67A2 foi estimada como sendo 8,0 e 1,9 nM, respectivamente (Fig. 1B). Foi examinada a variação temporal da radioactividade de [
111In] 67A2 e [
125I] 67A2 na fracção subcelular (Fig. 1C e D). Radioactividade na fracção ligada à membrana celular de [
111In] 67A2 e [
125I] 67A2 rapidamente diminuiu com o tempo. No caso de [
111In] 67A2, a radioactividade da fracção internalizado aumentou com o tempo, atingindo aproximadamente 55% após 20 horas de incubação a 37 ° C (Fig. 1C). Em contraste, internalizada radioactividade de [
125I] 67A2 temporariamente aumentado até 3 h, mas depois diminuiu gradualmente. A radioactividade da fracção não ligada a proteínas no meio de cultura aumentou com o tempo, o que reflecte a desalogenação do anticorpo
marcado com 125I em células (Fig. 1D). Quando as células foram incubadas em gelo, a fracção ligada à membrana não se alterou e interiorização não foi observada durante pelo menos 3 h (dados não mostrados). Estes resultados do ensaio de internalização foram semelhantes àquelas com 12A8 em nosso estudo anterior [18].
(A) ensaio de ligação celular para [
111In] 12A8 (círculos fechados) e [
111In ] 67A2 (círculos abertos). (B) ensaio de inibição competitiva para [
111In] 12A8 (círculos a cheio) e [
111In] 67A2 (círculos abertos). ensaio de internalização de [
111In] 67A2 (C) e [
125I] 67A2 (D). Alterações em% da radioactividade total para cada fracção são registadas em função do tempo de incubação a 37 ° C (círculos fechados, fracção internalizados; círculos abertos, fracção ligada à membrana; triângulos fechados, fracção ligada à proteína no meio de cultura; marcas de cruz, não- fração no meio de cultura ligado às proteínas).
biodistribuição de [
111In] 12A8 e [
111In] 67A2
experimentos de biodistribuição de longo prazo de [
111In] 12A8 e [
111In] 67A2 foram realizados em ratinhos nus portadores de tumores de SY dias 1 a 10 após a injecção (Tabelas 1 e 2). [
111In] 12A8 acumulado em células tumorais em 7,3 ± 1,3% ID /g no dia um, e um valor de pico de 18,9 ± 2,9% ID /g foi obtido no dia 4 (Tabela 1). A captação tumoral de [
111In] 67A2 foi de 15,7 ± 0,9% ID /g no dia um, e um valor de pico de 31,5 ± 7,7% ID /g foi obtido no dia 4 (Tabela 2). A AUC de [
111In] 67A2 foi 1,7 vezes mais elevada do que a de [
111In] 12A8. A absorção de anticorpos radiomarcados nos principais órgãos foi baixa e diminuiu gradualmente com o tempo, semelhante à relatada em estudos anteriores para IgGs radiomarcados específicos para outros antigénios de [25], [26]. A razão tumor-para-sangue de [
111In] 12A8 e [
111In] 67A2, no Dia 1 foi de 0,6 e 0,9, respectivamente, e atingiu valores de pico de 3,6 e 4,0, respectivamente, por dia 10.
a dose absorvida por tumores foi estimado com base na AUC de cada
anticorpo 111In marcado a partir dos dados de biodistribuição. A dose absorvida por tumores tratados com 0,74, 1,85 e 3,7 MBq de [
90Y] 12A8 foi estimada como sendo de 4,2, 10,5 e 21,0 Gy, respectivamente, e a de [
90Y] 67A2 foi de 7,2, 18,0 e 35,9 Gy, respectivamente. A dose absorvida medula vermelha foi estimada a partir de nossos dados de biodistribuição em 0,5 mGy /MBq em um homem de referência de 70 kg para ambos os anticorpos marcados com 90Y
.
radioimunoterapia
Na sequência [ ,,,0],
90Y] 12A8 tratamento, o volume de tumor em todos os grupos aumentaram até ao dia 3 após a injecção, mas depois diminuíram no grupo de tratamento de 3,7 MBq e desapareceu completamente em torno de 2 semanas após a injecção (Fig. 2A). A administração de 1,85 MBq de [
90Y] 12A8 também suprimiu o crescimento do tumor até cerca de 2 semanas após a injeção, mas, posteriormente, os volumes dos tumores começaram a aumentar novamente (Fig. 2A). Nos grupos tratados com IgG não marcado sozinho e 0.74 MBq de [
90Y] 12A8, observou-se retardamento do crescimento tumoral em comparação com o grupo não tratado (PBS) (
P
0,05) (Fig. 2A). [
90Y] 67A2 tratamento mostrou um efeito terapêutico superior em comparação com [
90Y] 12A8 em meados de níveis de altas doses. A administração de 1,85 e 3,7 MBq de [
90Y] 67A2 crescimento do tumor marcadamente suprimida e tumores desapareceram completamente cerca de 2 semanas após a injeção, exceto para um único rato tratado com 1,85 MBq de [
90Y] 67A2. Embora tenhamos observado atraso do crescimento do tumor no grupo de tratamento com 0,74 MBq de [
90Y] 67A2 em comparação com o grupo não tratado (PBS) (
P
0,05), não houve diferença significativa no crescimento tumoral em comparação com o grupo de tratamento de IgG não marcado (Fig. 2C). O peso corporal de ratinhos tratados com [
90Y] 12A8 e [
90Y] 67A2 diminuiu temporariamente por cerca de 15%, mas começou a aumentar durante a primeira semana após o tratamento (Fig. 2B e D), e todos os murganhos tolerada a experiência RIT até ao dia 28 (o último dia observado).
curva de crescimento tumoral (a) e do peso corporal (B) para os ratos tratados com [
90Y] 12A8. curva de crescimento do tumor (C) e o peso corporal (D) para animais tratados com [
90Y] 67A2 (círculos fechados, não tratadas (PBS); círculos abertos, sem rótulo IgG isoladamente; fechado triângulos, 0,74 MBq; losangos em branco, 1,85 MBq ; quadrados pretos, 3,7 MBq)
a análise histológica
foram observados os números elevados de células mitóticas em H . seções e-manchadas de SY tumores do grupo não tratado (PBS), reflectindo uma elevada actividade de proliferação (Fig. 3A). secções tumorais obtidas no dia 7 após a injecção de [
90Y] 12A8 áreas reveladas de necrose e fibrose que aumentaram de um modo dependente da dose (Fig. 3A). Necrose e fibrose também foram observados em tumores tratados com 1,85 e 3,7 MBq de [
90Y] 67A2, mas não apenas com não marcado IgG e 0,74 MBq de [
90Y] 67A2 (Fig. 3A). Em secções de TUNEL-coradas, as células apoptóticas foram raramente observados sob condições de não tratados (Fig. 3A e B). Em tumores tratados com [
90Y] 12A8, a percentagem de células apoptóticas tendiam a aumentar com um aumento na dose de radioactividade (Fig. 3A e B). Em contraste, em tumores tratados com [
90Y] 67A2, foi observado o mesmo nível de células apoptóticas de 0,74 a 3,7 MBq sem um aumento dependente da dose (Fig. 3A e B).
(A ) H e e TUNEL coradas secções de tumor uma semana após a injeção de [
90Y] 12A8 e [
90Y] 67A2. (B) A quantificação de células apoptóticas em tumores tratados com [
90Y] 12A8 (barras pretas) e [
90Y] 67A2 (barras brancas). *
P Art 0,01 (Student
t
-teste)
Discussão
SCLC é um tumor agressivo eo ano 2. taxa de sobrevivência de pacientes com doenças em fase limitada e extensiva em fase situa-se entre 20 a 40% e 2 a 5%, respectivamente [27], [28], [29]. Portanto, a terapia anti-cancro eficaz adicional é necessário, especialmente para pacientes com doença extensa-fase. CPPC expressa elevados níveis de c-kit que permite um crescimento celular rápido e, portanto, é uma molécula candidata chave para o diagnóstico e terapêutica em CPPC [30], [31], [32]. Nós anteriormente demonstrado que níveis elevados de anticorpo anti-c-kit [
111In] 12A8 acumulados em tumores que expressam c-kit, mas não em órgãos normais [17], [18]. Desde SCLC é sensível à radiação, RIT usando 12A8 marcados com radionuclídeos citotóxicos tais como
90Y ou
131I tem o potencial para ser um tratamento mais eficaz para a SCLC do que os tratamentos correntes. No presente estudo, utilizamos um anticorpo adicional 67A2 que tem uma maior afinidade para c-kit em comparação com 12A8, e avaliou a eficácia terapêutica do
12A8 e 67A2 em um modelo SCLC rato marcado com 90Y.
In vitro
caracterização de
111In marcado 12A8 e 67A2 demonstrou que [
111In] 67A2 tinha quatro vezes maior afinidade de ligação de [
111In] 12A8, como esperado. Embora o epítopo reconhecido por 67A2 é diferente da de 12A8, o ensaio mostrou que a internalização 67A2 foi internalizados rapidamente após a ligação a c-kit semelhante ao observado para 12A8 [17]. Conforme relatado por 12A8, após c-kit de ligação e internalização, radiomarcado 67A2 foi metabolizado e
atividade 125I foi liberado a partir das células, enquanto
atividade 111In permaneceu, indicando radionuclídeos metálicos são adequados para geração de imagens (
111In) e terapia (
90Y) usando 67A2 para alvejar as células tumorais.
para determinar se os anticorpos podem ser usados para RIT de tumores que expressam c-kit, avaliou-se a biodistribuição de longo prazo de
anticorpos, a partir do qual a dose absorvida de tumor foi estimado para
correspondentes anticorpos marcados com 111In 90Y marcado. [
111In] 67A2, tendo quatro vezes maior afinidade de ligação de [
111In] 12A8, mostrou uma captação tumoral mais elevada em cada ponto de tempo estudado. AUC da curva de atividade de tempo tumor foi 1,7 vezes maior para [
111In] 67A2 do que para [
111In] 12A8, demonstrando um tumor maior dose absorvida usando [
90Y] 67A2.
A seguir , nós marcados ambos os anticorpos com
90Y e conduzido RIT experimental em camundongos com tumores SY. A administração de 3,7 MBq de [
90Y] 12A8 ou 1,85 e 3,7 MBq de [
90Y] 67A2 crescimento tumoral quase completamente suprimida. Comparação de cálculo da dose absorvida indicou que os tumores que receberam uma dose absorvida superior a 18 Gy atingiram uma resposta completa em tumores SY. RIT foi tolerada em ratos, que só desenvolveram perda de peso corporal transitória. Estes resultados sugerem que as
anticorpos marcados com 90Y têm o potencial para fornecer uma dose letal de radioterapia-c-kit expressar SCLC. O órgão de limitação da dose para RIT com IgG é normalmente a medula vermelha, e consideração da dose absorvida para a medula vermelha é importante para determinar a dose de radiação terapêutica em pacientes [33]. No presente estudo, a dose absorvida calculada a partir de dados a biodistribuição foi de 0,5 mGy /MBq num homem de 70 kg de referência para ambos os
anticorpos marcados com 90Y; ≤2 Gy é geralmente considerada como sendo uma dose de radiação segura [33] , indicando que a dose terapêutica máxima estimada é 4 GBq. No entanto, Tolvanen
et al
. relatou que havia discrepâncias entre as doses absorvidas estimados com dados de ratings e de origem humana [23]. Além disso, os anticorpos anti-c-kit 12A8 e 67A2 ligam-se a c-kit humano, mas não de murino c-kit. Portanto, precisamos de um estudo clínico futuro com
111In marcado 12A8 e 67A2 em pacientes para estimar a dosimetria exata. 38% a 78% dos espécimes SCLC e 42% a 52% das linhas de células SCLC tem alta expressão de c-kit de [30], [34]; portanto, mais do que aproximadamente 40% dos pacientes com SCLC poderia beneficiar de c-kit alvo radioimunoterapia. Isto deve ser ainda validado em estudos clínicos futuros.
Curiosamente, [
90Y] 12A8 crescimento de tumores suprimidos de uma forma dependente da dose, enquanto que [
90Y] 67A2 comportou como se fosse necessário um limiar dose a ser eficaz. Não houve diferença significativa no crescimento tumoral entre não marcado IgG sozinho e 0,74 MBq [
90Y] 67A2 grupos de tratamento, embora 0,74 MBq [
90Y] 67A2 deu uma dose absorvida tumor de 7,2 Gy, que foi de 1,7 vezes maior do que em 0,74 MBq [
90Y] 12A8. A análise histológica demonstrou que a área de fibrose e necrose reflectiu o efeito RIT. Em contraste, o padrão de indução de apoptose foi diferente entre os dois
anticorpos marcados com 90Y. Embora não seja claro se a diferença na indução de apoptose está relacionado com o padrão diferente do efeito RIT, as diferenças nas características biológicas dos anticorpos pode ter causado esta discrepância. De acordo com informações do fabricante, 12A8 tem uma actividade de neutralização forte e actividade anti-tumoral leve, enquanto 67A2 tem nem, e ambos os anticorpos não possuem atividades ADCC e CDC. Embora não haja evidência directa de que c-kit está envolvida na via de apoptose, c-kit de knockdown utilizando ARN curto hairpin apoptose induzida em células de cancro da mama [35] e a depleção de c-kit por anticorpo neutralizante resultou em muito maior apoptose na diferenciação espermatogônia em ratos [36]. Estes resultados levantam a possibilidade de que combinada esgotamento c-kit com radioterapia poderia induzir efeitos sinérgicos, resultando na supressão do crescimento do tumor usando uma dose baixa de [
90Y] 12A8 apesar de sua dose absorvida inferior em comparação com [
90Y] 67A2 . Como os pacientes geralmente recebem doses elevadas em RIT radical, os nossos resultados sugerem que a alta afinidade é uma característica muito importante para anticorpo utilizado na RIT em um ambiente clínico, embora não podemos excluir a possibilidade de que outras propriedades pode afectar a eficácia RIT. Seria interessante para avaliar a possibilidade de que os efeitos terapêuticos pode ser aumentada por outro carácter biológico (s) do anticorpo em estudos futuros.
Embora RIT tem o potencial para aumentar o efeito de terapia de anticorpos em muitos tipos de tumores, em radioimunoterapia uso clínico até à data tem sido eficaz somente para doenças hematológicas, mas não para doenças malignas não hematológicas [19], [37], [38]. Uma vez que é difícil para detecção de anticorpos para penetrar em tumores sólidos inteiros, anticorpos radiomarcados não é possível fornecer uma dose letal de todas as células tumorais dentro de um tumor sólido. No entanto, uma vez que os anticorpos marcados radioactivamente pode sistemicamente radionuclídeos citotóxicos para locais de tumor, RIT para tumores sólidos é geralmente considerado adequado para o tratamento de tumores metastáticos de pequena dimensão (inferior a vários centímetros de diâmetro), mas os tumores primários não volumosos (mais do que alguns centímetros de diâmetro) . A este respeito, SCLC, que tem um elevado risco de metástases generalizadas, mas que é relativamente radiossensíveis, pode ser um bom candidato para RIT. Embora os pacientes com SCLC extensa fase tradicionalmente não receberam radioterapia, SLotman
et al
. relataram que a irradiação craniana profilática em pacientes com SCLC extensa fases resultou numa redução significativa da incidência de metástases do cérebro e a melhoria da sobrevivência [39]. Portanto, [
90Y] 12A8 e [
90Y] 67A2 pode ser eficaz para o tratamento de células de cancro metastáticas em locais distantes e podem ter o potencial para reduzir a incidência de metástases além do cérebro em CPPC, especialmente durante a extensa estágio da doença.
Conclusão
Foram avaliados dois anticorpos anti-c-kit radiomarcados 12A8 e 67A2 para a sua eventual pedido de RIT de SCLC. A afinidade de [
111In] 67A2 foi quatro vezes maior do que a de [
111In] 12A8, e tumor de captação de [
111In] 67A2 foi 1,7 vezes mais elevada do que a de [
111In] 12A8 . No meio de doses elevadas de
anticorpos marcados com 90Y, o controlo do tumor simplesmente reflectida a dose absorvida tumoral, onde um tumor absorvida dose superior a 18 Gy poderia induzir a regressão quase completa do xenoenxerto SCLC. Isto sugere que o SCLC pode ser um bom alvo de RIT com
anticorpos anti-c-kit marcado com 90Y. [
90Y] 12A8 e [
90Y] 67A2 são promissores agentes RIT para SCLC extensa palco.
Reconhecimentos
Agradecemos Maki Okada para aconselhamento técnico e sugestões úteis sobre a dosimetria .