Abstract

O cancro do pulmão continua a ser a causa mais comum de mortalidade relacionada ao câncer. Nós aplicamos uma tecnologia proteômica altamente multiplexado (somasca) para comparar as assinaturas de câncer de pulmão não-pequenas células (NSCLC) tecidos com os tecidos adjacentes e distantes saudáveis ​​de ressecções cirúrgicas expressão da proteína. Neste primeiro relatório de somasca aplicada aos tecidos, destacam-36 proteínas que apresentam as maiores diferenças de expressão entre os tecidos tumorais e não tumorais correspondentes. As concentrações de proteínas aumentou vinte e dezesseis diminuiu em tecido tumoral, treze dos quais são novos para NSCLC. biomarcadores de tecido NSCLC aqui identificados sobrepor-se com um conjunto central identificada em um estudo NSCLC à base de soro grande com somasca. Mostramos que em larga escala de análise comparativa da expressão da proteína pode ser utilizado para desenvolver novas sondas histoquímicas. Como esperado, as diferenças relativas na expressão de proteínas são maiores do que em tecidos no soro. Os resultados combinados de tecidos e soro apresentar a visão mais ampla a data das complexas mudanças na expressão de proteínas NSCLC e fornecer implicações importantes para o diagnóstico e tratamento

Citation:. Mehan MR, Ayers D, Thirstrup D, Xiong W , Ostroff RM, Brody EN, et al. (2012) Assinatura Proteína de Lung Cancer tecidos. PLoS ONE 7 (4): e35157. doi: 10.1371 /journal.pone.0035157

editor: Rossella Rota, Ospedale Pediatrico Bambino Gesù, Itália |

Recebido: 28 de novembro de 2011; Aceito: 09 de março de 2012; Publicação: 11 de abril de 2012

Direitos de autor: © 2012 Mehan et al. . Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento: SomaLogic financiado a pesquisa com biomarcadores de proteômica. SomaLogic teve um papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar, e preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Os autores leram a política da revista e tem as seguintes conflitos: M Mehan, D Ayers , D Zichi, R Ostroff, e Brody, J Walker, L ouro, T Jarvis, N Janjic, e S Wilcox são empregados em tempo integral de SomaLogic. D Thirstrup e G Baird ter recebido financiamento para pesquisa da SomaLogic. Esses interesses não alteram a adesão dos autores para os PLoS ONE políticas de dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

A progressão de um estado saudável para a doença é acompanhada por alterações na expressão da proteína em tecidos afetados. interrogação comparativa do proteoma humano em tecidos saudáveis ​​e doentes podem oferecer insights sobre a biologia da doença e levar à descoberta de novos biomarcadores para o diagnóstico, novos alvos para intervenção terapêutica, e identificação de pacientes com maior probabilidade de se beneficiar do tratamento alvejado. Em particular, são urgentemente necessários novos diagnósticos para a detecção precoce do cancro do pulmão. Para efeitos de tratamento e prognóstico, o cancro do pulmão é classificada como patologicamente quer de pequenas células (15%) ou de células não pequenas (85%). O cancro do pulmão é a principal causa de mortes por câncer, em grande parte porque 84% dos casos são diagnosticados em estágio avançado, com uma taxa de sobrevivência de cinco anos de menos de 15% [1] – [3]. Em todo o mundo em 2008, 1,5 milhões de pessoas foram diagnosticadas e 1,3 milhões de pessoas morreram – uma taxa de sobrevivência inalterada desde 1960 [4]. No entanto, os pacientes diagnosticados com NSCLC em um estágio inicial e tratados cirurgicamente para remover seus tumores experimentar um 86% de sobrevivência [1], [2].

Recentemente, desenvolveu uma nova tecnologia proteômica baseada em afinidade de cinco anos para descoberta de biomarcadores que atualmente mede mais de 1.000 proteínas a partir de pequenos volumes de amostras de plasma ou soro (por exemplo, ~ 10 mL de plasma) com baixos limites de detecção (valor médio de 300 fM), 7 registros de faixa dinâmica geral (~ 30 fM – 1 mícron , utilizando a diluição da amostra), e 5% coeficiente de variação médio de [5]. Esta tecnologia, denominada somasca, é activado por SOMAmers (abrandamento da taxa de modificação aptâmeros), uma nova classe de reagentes de ligação de proteínas que contêm os nucleótidos modificados quimicamente, que se expandem consideravelmente a diversidade físico-química das bibliotecas de ácido nucleico. Tais modificações introduzir grupos funcionais, que são frequentemente encontrados na interacção proteína-proteína, as interacções anticorpo-antigénio, e das interacções entre os fármacos de moléculas pequenas com as suas proteínas alvo, mas estão ausentes em ácidos nucleicos naturais. Estas modificações são compatíveis com o processo utilizado para criar SOMAmers, bem como métodos de ADN standard, incluindo por PCR e hibridização de SELEX (evolução sistemática de ligandos por enriquecimento exponencial). Em geral, a utilização de tais modificações se expande a gama de possíveis alvos para SELEX, resulta em propriedades melhoradas de ligação, e facilita a selecção de SOMAmers com taxas de dissociação lentas [5].

somasca é uma plataforma altamente multiplexado para medir quantitativamente proteínas em matrizes complexas, tais como plasma ou soro, em que uma assinatura de concentrações de proteína é transformada em uma assinatura de ADN correspondente, que é então quantificada em uma plataforma de microarranjo de DNA comercial [5]. Resumidamente, a ligação entre uma mistura de proteínas e SOMAmers equilíbrio é conseguida em solução, seguido por remoção das espécies não ligadas por sucessivas etapas de imobilização baseadas em esferas acompanhados com lavagem extensa. Alta especificidade, já uma característica intrínseca da SOMAmers, é adicionalmente melhorado com a inclusão de sulfato de dextrano durante a ligação e passos de lavagem. O sulfato de dextrano, que, como ácidos nucleicos é um polianião, é eficaz porque os complexos de proteína-SOMAmer cognatos são mais estáveis ​​do que os complexos cineticamente não-específicos. No final do ensaio, complexos específicos SOMAmer-proteína a partir do qual permanecem SOMAmers pode ser eluída sob condições de desnaturação, hibridada em microarrays comercialmente disponíveis, e directamente quantificada por meio de um fluoróforo ligado de forma covalente ao SOMAmer. Em essência, o ensaio tira vantagem da natureza dual de SOMAmers como ambas as entidades ligantes dobradas com formas definidas e sequências de ácido nucleico únicas reconhecíveis por sondas de hibridação específicas. A utilidade deste ensaio foi mostrado anteriormente em medições simultâneas de um grande número de proteínas que variam de baixo picomolar a alta concentração micromolar no plasma e no soro e os estudos de biomarcadores clínicos de doença renal crónica e cancro do pulmão [5], [6].

resultados

análise proteômica das NSCLC ressecções cirúrgicas

neste relatório, foi realizada análise de expressão de proteína em larga escala de amostras de tecido de pulmão homogeneizados de ressecções cirúrgicas obtidas de oito não-pequenas células cancro do pulmão (NSCLC) pacientes. Todos os pacientes com NSCLC eram fumantes, com idade variando de 47 a 75 anos e com diagnóstico confirmado por patologia estágios NSCLC IA através IIIB (Tabela 1). Obteve-se três amostras de cada ressecção: amostra de tecido tumoral, o tecido não tumoral adjacente (a 1 cm do tumor e tecido pulmonar) não envolvida distante (mais distante borda da ressecção do tumor). Foi tomado cuidado para preservar a integridade do tecido, com todas as amostras serem congeladas dentro de 5-10 minutos de excisão. concentração de proteína total foi ajustado e normalizada em cada homogeneizado para perfilamento proteomic seguido de análise sobre a nossa gama descoberta de biomarcadores para medir as concentrações de 820 proteínas humanas como recentemente descrita [5].

Estas medições de concentração de proteínas, expressos como unidades de fluorescência relativas (RFU), permitir comparações em larga escala de assinaturas de proteínas entre as amostras (Fig. 1). Em primeiro lugar, em relação aos níveis de expressão de proteínas entre as amostras de tecido adjacentes e distantes para cada paciente (Fig. 1A). Em geral, os sinais gerados pela maioria dos analitos foram semelhantes no tecido adjacente e distante. Nesta comparação, apenas um analito (fibrinogénio) exibiu mais de uma diferença de duas vezes entre as duas amostras de controlo. concentração de fibrinogénio foi maior no tecido não tumoral adjacente do que o tecido não-tumoral distante. O fibrinogénio é o precursor solúvel de fibrina, o qual é convertido pela trombina durante a coagulação. o depósito de fibrina ocorrer dentro de estroma adjacente da maioria dos tumores, principalmente na matriz extracelular (ECM), onde as proteínas de fibrina e de outras ECM e promover o processo de crescimento do tumor, incluindo o suporte, a proliferação celular, a adesão, invasão, migração, angiogénese e [7].

diferenças de sinal entre tecidos adjacentes e longínquo (painel A), de tumor e tecido adjacente (painel B) e de tumor e tecido distante (painel C) são expressos como log

2 proporções medianas. A linha pontilhada representa a mudança de duas vezes (log

2 = 1).

Em contraste, a comparação de tecidos tumorais com tecido não-tumoral (ao lado ou distante) identificou 11 (1,3%) proteínas com mais do que quatro vezes diferenças e 53 (6,1%) proteínas com diferenças maiores que duas vezes (Figs. 1B e 1C). Os (93,9%) as proteínas restantes apresentaram diferenças relativamente pequenas entre tumor e tecido não tumoral. Algumas proteínas foram substancialmente suprimida enquanto outros foram elevados nos tecidos tumorais em comparação com tecidos adjacentes ou distantes. A expressão diferencial de proteínas entre o tecido adjacente e do tumor, ou entre o tecido tumoral e distal, foi em geral semelhante. Alterações em entre tumor e tecido distai foram geralmente um pouco maior em relação ao tumor e tecido adjacente (Fig. 1), o que demonstra que a maioria das alterações de proteína observadas são específicos para o ambiente local do tumor. A Figura 2 mostra um mapa de calor representação dos resultados. Houve uma tendência de mudanças de proteína refletindo estágio patológico, o que pode indicar que a expressão da proteína se correlaciona com a carga da doença. Dado o pequeno tamanho da amostra, correlações com classificação histológica não pode ser dissociado do palco.

As amostras são exibidas em colunas e separados em distante não tumor, não tumoral adjacente e tecido tumoral. Dentro de cada tipo de tecido, as amostras são separadas em adenocarcinomas (CA) ou carcinomas de células escamosas (SCC). Os números acima de cada coluna correspondem aos códigos de pacientes. As proteínas são exibidos em linhas e foram encomendados usando agrupamento hierárquico.

Biomarcador identificação

Para identificar potenciais biomarcadores de tecido NSCLC, buscamos analitos com a maior variação nos níveis de expressão de proteína entre tumor, adjacente, e amostras de tecidos distantes. Aqui destacamos trinta e seis proteínas com a maior média dobrar-alterações na expressão da proteína entre o tumor e amostras de tecidos não tumorais (Fig. 3, Tabela 2). Testamos o significado dessas mudanças com o teste de Mann Whitney e exigiu um p-valor de 0,05 após correcção para múltiplos testes (falsa de corte taxa de descoberta de q 0,05). Embora o número de amostras, foi utilizado para este estudo foi relativamente pequeno, o estudo consistiu em amostras de tumores e de tecido não-tumoral emparelhados de cada indivíduo. Isso proporciona mais potência para identificar alterações dentro de um indivíduo e elimina a variância da população associado com desenhos de estudos transversais. A disponibilidade de amostras de referência apropriadamente escolhido é cada vez mais reconhecido como uma componente crucial importância na investigação de descoberta biomarcador [8] – [10]. Finalmente, avaliou a reprodutibilidade deste novo método de análise de amostras em triplicado de tumorais e não tumorais ressecções de tecido por dois sujeitos deste estudo e encontrou um CV médio de 4,5% entre as medidas em triplicado para as 820 proteínas medidos (Fig. 4) e Spearman de correlação coeficientes 0,99 (parcialmente inflado pela grande variedade RFU medido). medições em triplicado para as 36 proteínas com maiores diferenças média vezes entre tumor e tecido não tumoral são plotados na Fig. 5.

Proteínas com aumentado (Painel A) ou diminuída (painel B), os níveis no tecido do tumor em comparação com o tecido adjacente ou distai (painel A) a partir de oito amostras NSCLC utilizados neste estudo. Cada indivíduo é indicado com um símbolo diferente. As linhas horizontais de cada caixa corresponde ao primeiro, segundo quartil, e terceiros (25% /50% /75%) e os bigodes correspondem aos valores máximos e mínimos.

O tumor, adjacente não-tumoral e tecidos distantes ressecções não tumorais foram amostrados, extraiu-se e analisaram-se com o ensaio em triplicado proteomic somasca para dois indivíduos no estudo. O CV médio para todos os 6 triplicados foi de 4,5% (linha preta).

O tumor, adjacente não-tumoral e distantes ressecções de tecidos não tumorais foram amostrados, extraídos e analisados ​​com o proteômica somasca ensaio em triplicado para duas pessoas (pacientes 56 e 61) no estudo. As amostras são coloridos por indivíduo e as amostras de tumor são destacados como triângulos. O eixo y está em uma escala logarítmica.

análise proteômica de alta conteúdo de amostras biológicas habilitados pelo nosso ensaio multiplexado permite descoberta imparcial de proteínas relacionadas à doença. Até à data, temos realizado vários estudos de biomarcadores clínica baseada em sangue de doenças humanas, incluindo câncer de pulmão [6] e doença renal crônica [5]. Estes estudos identificaram novos biomarcadores potencial doença, bem como biomarcadores que tenham sido relatados anteriormente. O presente estudo segue essa tendência. Cerca de um terço (13/36) dos potenciais biomarcadores de tecido NSCLC identificados aqui são novos, com o melhor de nosso conhecimento. Os restantes dois terços (23/36) foram relatados anteriormente como proteínas expressas diferencialmente ou genes em tecido de tumor de NSCLC (Tabela 2). Novidade foi determinada através da realização de pesquisas de literatura no PubMed e na internet usando nomes de genes dos potenciais biomarcadores e aliases proteínas identificadas pelos UniProt.

Os biomarcadores potenciais podem ser classificados genericamente em quatro processos biológicos associados com características importantes de tumor biologia [11], como mostrado na Tabela 3: 1) a angiogénese, 2) crescimento e metabolismo, 3) inflamação e apoptose, e 4) invasão e metástase. É certo que estes são classificações convenientes, mas inexatas que se aproximam de um sistema altamente complexo e dinâmico em que essas moléculas, muitas vezes desempenham funções múltiplas e matizadas. Portanto, o estado específico de um dado sistema, em última instância afectam a expressão e função de qualquer molécula particular. Nossa compreensão das bases biológicas desses sistemas está longe de terminar. Com a plataforma somasca, que começam a explorar a expressão quantitativa de grandes números de proteínas em vários tecidos e os processos de doença. Estes dados fornecem novas coordenadas para ajudar a mapear a dinâmica destes sistemas, que por sua vez irá proporcionar uma compreensão mais completa da biologia da doença. Os resultados do estudo fornecem uma nova perspectiva sobre a biologia do tumor NSCLC, com ambos os elementos familiares e novos.

Angiogenesis

Angiogenesis impulsiona o crescimento de novos vasos sanguíneos para suportar o crescimento do tumor e metabolismo. A regulação da angiogénese é um fenómeno biológico complexo controlada por ambos os sinais positivos e negativos [11]. Entre os biomarcadores potenciais tecido NSCLC identificados neste estudo (Fig. 3) eram bem conhecidos reguladores da angiogénese, positivos e negativos os quais têm sido anteriormente observadas no tecido do tumor de NSCLC [12] – [16]. Estes incluem a angiogénese prototípico indutor de VEGF e inibidores da endostatina e trombospondina-1 (TSP-1). O VEGF é um factor de crescimento potente que promove o crescimento de novos vasos sanguíneos; VEGF foi fortemente sobre-regulada no tecido do tumor de NSCLC, consistente com observações anteriores [12], incluindo o nosso estudo de amostras de soro de doentes com NSCLC [6]. Vale a pena notar que o VEGF foi originalmente descoberta como secretado de células de tumor factor de permeabilidade vascular (VPF) que aumentou a leakiness de vasos sanguíneos associados a tumores para grandes moléculas, tais como fibrinogénio, que são normalmente confinada ao plasma [17]. Esta actividade pode ter efeitos profundos sobre a composição de proteínas associadas com o tecido do tumor. A endostatina um fragmento proteolítico do colágeno XVIII e um forte inibidor de proliferação de células endoteliais e angiogénese [13]. TSP-1 e a TSP-2 relacionada foram substancialmente sobre-regulada no tecido do tumor de NSCLC. TSP-1 e TSP-2 são proteínas da matriz extracelular com efeitos complexos, dependentes do contexto modulados através de uma variedade de interacções com receptores da superfície celular, factores de crescimento, citocinas, metaloproteinases de matriz, e outras moléculas. Archetypically em sistemas modelo, TSP-1 e TSP-2 inibem a angiogénese por inibição da proliferação de células endoteliais através do receptor CD47 (não medidos neste estudo) e indução de apoptose de células endoteliais através do receptor CD36. Também há evidência para influências pró-angiogénico para TSP-1 e TSP-2 [18]. Finalmente, relataram TSP-1 e TSP-2 níveis de expressão relativa e absoluta em tecido NSCLC variar [16], [19] – [21] provavelmente devido às suas funções complexas. Em nosso estudo, verificamos também que CD36 foi regulada para baixo no tecido tumoral NSCLC, o que poderia indicar uma adaptação de células tumorais reduzir a sensibilidade de TSP-1 e apoptose TSP-2-mediada.

Crescimento e Metabolismo

Dez dos potenciais biomarcadores NSCLC foram identificados estão associados a funções de crescimento e metabolismo. Metade destes biomarcadores estão envolvidos na regulação hormonal complexo de crescimento celular e o metabolismo energético. Três proteínas de ligação de insulina-like growth factor (IGFBPs), que modulam a actividade de factores de crescimento semelhantes à insulina (IGFs), foram regulados positivamente em tumores NSCLC (IGFBP-2, -5, e -7). Vários relatórios têm qualitativamente avaliada IGFBP-2, -5, -7 e em NSCLC (Tabela 2) e sugerem a expressão mais elevada no tecido NSCLC do que no tecido normal. A insulina e IGF actuam como hormonas que influenciam fortemente o crescimento celular, metabolismo, e sobrevivência. As células cancerosas são muitas vezes dependente destas moléculas para o crescimento e proliferação [11]. A IGFBP-2, também tem sido associado a um efeito anti-apoptótico através da caspase-3 [22]. Estas hormonas são, por sua vez degradado por insulysin [23], cuja concentração era mais elevada no tecido do tumor de NSCLC. A adiponectina hormônio controla o metabolismo lipídico e sensibilidade à insulina, e encontramos adiponectina regulada em tumores NSCLC. Os restantes cinco biomarcadores, anidrase carbônica III, NAGK, TrATPase, triptase β-2 e MAPK13, são todas as enzimas com papéis conhecidos no metabolismo celular (Tabela 3).

A inflamação e apoptose

inflamação e apoptose são características da biologia do câncer, e nós encontrar um número de potenciais biomarcadores associados a estes processos que têm sido associados anteriormente com NSCLC (Tabela 2). Encontramos caspase 3 concentrações superiores no tecido tumoral NSCLC. A caspase-3 tem sido associado com a metástase [24]. Outro exemplo notável é receptor solúvel de glicação avançada produtos finais sRAGE, o que tem sido relatado para ser dramaticamente regulado negativamente no tecido NSCLC [21], [25]. Este resultado é consistente com a nossa medição, em que sRAGE teve a maior mudança observada para as proteínas que são mais baixos no tumor do que em tecido não-malignas. Uma hipótese é que RAGE desempenha um papel na organização epitelial, e diminuição dos níveis de RAGE em tumores de pulmão pode contribuir para a perda de estrutura do tecido epitelial, potencialmente levando à transformação maligna [25]. Vários quimiocinas, tais como BCA-1, CXCL16, IL-8, e NAP-2, são alteradas no nosso estudo, consistente com a hipótese de que a invasão de tumores com células dos braços inata e adaptativa do sistema imune fornecer moléculas bioactivas que afetam os sinais de proliferação e angiogênicos [11].

invasão e metástase

O maior grupo de potenciais biomarcadores contém proteínas que funcionam em interações célula-célula e célula-matriz e estão envolvidos na invasão e metástase . Muitos têm sido previamente relatado para ser associado com NSCLC. Mais notáveis ​​são duas das metaloproteases da matriz, MMP-7 e MMP-12, que contribuem para a degradação proteolítica de componentes da matriz extracelular e o processamento de substratos, tais como factores de crescimento. Por exemplo, o substrato importante para a MMP-12 é a elastina. Tais processos são bem conhecidos para desempenhar um papel na criação de microambiente do tumor. Observou-se MMP-7 e MMP-12 sobre-regulada no tecido NSCLC, o que é consistente com o estudo similar que utilizada medições baseadas em anticorpos [26]. A sobre-expressão da MMP-7 e MMP-12 tem sido associado com prognóstico pobre em NSCLC [26]. MMP-12 níveis foram correlacionados com a recorrência local e metástases [26]. É interessante notar que dois dos oito indivíduos estudados tinham níveis normais de MMP-12, enquanto que os outros seis tinham elevação 15-50 vezes de MMP-12 em tecido de tumor em comparação com o tecido não tumoral.

SOMAmers como sondas histoquímica para biomarcadores NSCLC

Compreender as diferenças na expressão de proteínas entre os tecidos tumorais e não tumorais pode identificar novos alvos histoquímica. Esta abordagem foi anteriormente utilizada com MMP-12 e outros [27]. Tais sondas podem permitir a caracterização molecular mais precisas dos tumores e os seus efeitos no estroma circundante. Foi anteriormente demonstrado que SOMAmers marcado com fluoróforo conferem coloração histoquímica rápida e selectiva em secções de tecido congelado [28]. Aqui nós examinamos coloração do tecido por vários dos SOMAmers que foram identificados como biomarcadores na nossa análise dos homogeneizados de tecidos. secções de tecidos congelados foram cortadas a partir dos mesmos ressecções tumorais utilizadas para a descoberta de biomarcador. Por exemplo, TSP-2 coloração com um SOMAmer marcado com fluoróforo em tecido de tumor foi surpreendente e localizada predominantemente nas áreas de cicatrização de estroma fibroso (Fig. 6A), mas tal coloração estava praticamente ausente no tecido normal (Fig. 6B). Isto é consistente com o papel relatado de TSP-2 em modulação matriz [18], [29]. Em contraste, no tecido pulmonar normal, o receptor de manose de macrófagos (MRC1) SOMAmer coloração localizada na superfície de macrófagos alveolares (Fig. 6D) tal como esperado para este objectivo [30]. amostras de tecido de tumor, que carecem de alvéolos, mostrou pouca MRC1 coloração (Fig. 6C). A Figura 6E demonstra a coloração MRC1 SOMAmer realizada simultaneamente com a imunofluorescência com anticorpos para citoqueratinas outros alvos (e CD31), indicando a possibilidade de SOMAmer e reagentes de anticorpos de multiplexagem em estudos histológicos. a coloração do tecido com SOMAmers foi, portanto, consistentes com os perfis de homogenato, em que TSP-2 era elevado e MRC1 foi diminuída em tumores contra o tecido saudável. Nós confirmamos os padrões de coloração SOMAmer de TSP-2 e MRC1 com anticorpos Figura 7. A congruência entre os resultados de coloração histoquímica com a direção da mudança na expressão da proteína entre tumor e homogeneizados de tecidos saudáveis ​​fornece evidência adicional de que os biomarcadores identificados estão associados à doença. comparação proteómica em larga escala entre os tecidos aqui descritos também é um poderoso método para a identificação de novas sondas histoquímica.

(A) trombospondina-2 SOMAmer (vermelho) coloração da matriz fibrocollagenous em torno de um ninho de tumor. (B) correspondente espécime normais do pulmão corado com trombospondina-2 SOMAmer (vermelho). SOMAmer (C) Macrófago manose receptor (vermelho) coloração de macrófagos espalhados em um adenocarcinoma de pulmão. (D) Macrófago manose receptor SOMAmer (vermelho) coloração numerosos macrófagos alveolares em uma secção de parênquima de pulmão normal. imagem (E) Multicolor destacando a distribuição citomorfológicas de macrófagos manose coloração SOMAmer receptor: Verde = Cytokeratin (anticorpo /AE3 AE1), Red = CD31 (EP3095 Antibody) e Laranja = SOMAmer. Todos os núcleos nesta figura são contrastadas com DAPI.

TSP-2 é identificada em cortes congelados de série de um carcinoma de pulmão único espécime pelo anticorpo policlonal (A) um home-made policlonal de coelho TSP-2, (B) o soro pré-imune dos coelhos usado para fazer o anticorpo policlonal feito em casa, (C) um (Novus) anticorpo policlonal de coelho comercial TSP-2, e (D) o SOMAmer TSP-2. O SOMAmer TSP-2 foi utilizado para corar as secções congeladas de tecido pulmonar normal e maligno, com o desenvolvimento de cor padrão de Avidina-Biotina-Peroxidase, para demonstrar diferentes distribuições morfológicas: (e) coloração forte do estroma fibrótico circundante ninhos tumorais, com citosólica mínimo coloração de células de carcinoma, (F) forte coloração do estroma fibrótico circundante ninhos tumorais num adenocarcinoma mucinoso, sem coloração significativa das células de carcinoma, (L) do tecido pulmonar normal, mostrando forte coloração citosólica do epitélio brônquico e espalhados macrófagos alveolares, e (H) forte coloração citosólica de um adenocarcinoma, sem coloração significativa da não-fibrótica, estroma predominantemente inflamatória.

Algumas advertências gerais relacionadas com a descoberta de biomarcadores potenciais NSCLC são dignos de nota. Em primeiro lugar, o facto de que uma proteína está associada com tecido do tumor não é necessário dizer que é específico para o tecido do tumor. Por exemplo, inflamação, remodelação da matriz extracelular, a hipoxia e necrose do tecido acompanha a progressão do tumor, mas também muitas outras condições não-malignas, como lesão, cura ou infecção da ferida. Em segundo lugar, foram identificados biomarcadores poderia reflectir uma diferença na relação de tipos de células que constituem uma amostra de tumor em comparação com a do tecido pulmonar normal. Por exemplo, se o tecido do tumor consiste em crescimento excessivo de células de cancro, alguns dos biomarcadores são esperados para ser específico para o tipo de célula (neste caso, as células epiteliais), transformada ou não. De igual modo, se uma amostra de tecido do tumor é mais ou menos vascularizadas que o tecido normal circundante, uma mudança na expressão de proteínas específicas de células endoteliais podem ser observados. Com efeito, observou-se concentrações significativamente mais baixas de ESAM, uma proteína específica para células endoteliais, em comparação com tecido compatível, não-tumorais. Confirmámos esta histoquimicamente, como mostrado na Figura 8, onde medimos 35 vezes mais células endoteliais ESAM-positiva no tecido não tumoral distante em relação ao tecido tumoral. Finalmente, SOMAmers, como todos os reagentes de afinidade, se ligam e reconhecem epitopos específicos de proteínas alvo geralmente de uma maneira dependente da conformação, e qualquer medição particular reflecte a disponibilidade desse epitopo.

coloração ESAM é mostrado no tumor do pulmão ( a, C) e de pulmão normal (B, D) a distância do tumor. As células endoteliais são visivelmente mais abundante na secção de pulmão normal, consistente com o elevado vascularização de pulmão normal. imagens cruas são mostrados em A e C, com células ESAM-positivos identificados pelo algoritmo CellProfiler marcado com um “1” em imagens B e D.

Comparação das NSCLC de tecidos e soro biomarcadores

temos concluiu recentemente um estudo NSCLC [6], no qual foram analisados ​​1.326 amostras de soro de quatro centros de estudos clínicos independentes usando a mesma plataforma proteômica e um menu de proteínas quase idêntico ao que é utilizado para tecido (813/820 proteínas). O estudo incluiu pacientes com diagnóstico de estágio patológico ou clínica I-III NSCLC e uma população de controle com uma história de tabagismo a longo prazo, incluindo os fumantes ativos e ex-fumantes com pelo menos 10 anos-maço de cigarro. Tomando precauções extensivas para conta para as variáveis ​​pré-analíticas, foram identificados 44 candidatos a biomarcadores, e desenvolveu um painel de 12 proteínas que distinguiu NSCLC de controles com sensibilidade de 91% e 84% de especificidade em um conjunto de treinamento, e 89% de sensibilidade e 83% de especificidade em um cego, conjunto de verificação independente. A disponibilidade desta base de dados permite-nos comparar as alterações na expressão da proteína no tecido e soro de pacientes com NSCLC.

Embora a metodologia utilizada para analisar os perfis de proteínas em amostras destes dois estudos NSCLC é o mesmo, algumas diferenças significativas são dignos de nota. Primeiro, foi observada variação pré-analítica sérica entre centros de estudo, talvez mascarando alguns biomarcadores de câncer [6]. Em segundo lugar, no estudo do tecido NSCLC aqui relatado, cada amostra de tumor tem o seu próprio tecido de controlo (não tumoral adjacente e distante), ao passo que o estudo soro NSCLC maior por necessidade é composto por caso e controle amostras de diferentes indivíduos. No entanto, a expressão diferencial de proteínas em soros de doentes com NSCLC relativos aos controlos isentos de cancro, em comparação com a de amostras de tecido com NSCLC dá informações úteis (Fig. 9, Tabela 4). A observação mais surpreendente é que a mudança relativa na expressão de proteínas são maiores do que em tecidos no soro. Este resultado pode ser esperado uma vez que o tecido tumoral é a fonte das alterações na expressão de proteína que é, em seguida, mesmo se totalmente libertado para a circulação, diluiu-se muitas vezes em volume total de sangue. Esta tendência é evidente na distribuição alongada de pontos de dados ao longo do eixo-X na Figura 9, em que os eixos são desenhadas na mesma escala para ilustrar este ponto. Onze dos analitos mostrados na Figura 3 como alteradas no tecido do tumor também foram expressas diferencialmente no soro de doentes com NSCLC vs controlos (círculos a cheio vermelhas na Fig. 9). É interessante notar que nosso estudo soro NSCLC publicado [6] não medir MMP-12, que este estudo identificou como um biomarcador tecido superior. Em estudos subsequentes soro NSCLC, MMP-12 foi medida e verificou-se que também era um biomarcador de soro de topo com um KS-distância de 0,42 (Quadro 2). Isto sugere que a elevação dos níveis séricos de MMP-12 reflete diretamente NSCLC biologia do tumor. A maioria dos outros biomarcadores comuns ao tecido e no soro também mudam na mesma direcção, mas alguns não. concentrações locais de proteínas em um tecido homogeneizado claramente não precisa se correlacionam com níveis das proteínas circulantes e correlação inversa pode fornecer pistas sobre a redistribuição de determinados biomarcadores em doentes contra tecidos normais.

Os dois painéis superiores mostram a relação log2 (LR) derivada a partir de amostras de soro contra os rácios de log derivadas de tecido adjacente e distante do tecido, respectivamente. Os últimos quatro painéis apresentam porções de parcelas ampliada acima, indicado pela cor da trama (verde para diminuição e vermelho para a expressão aumentada em comparação com o tecido não-tumoral). Analitos mostrados na Figura 2 foram rotulados e analitos mencionados na publicação sobre as amostras de soro são mostrados em símbolos vermelhos cheios vermelho.

Discussão

A descoberta de novos biomarcadores com utilitário de diagnóstico ou clínica demonstráveis ​​tem sido um desafio considerável nos últimos anos [8]. As razões para isso incluem: a onipresença de artefatos pré-analítica e analítica, a indisponibilidade de controles de estado saudável adequados, questões relacionadas com a estudar projetos, e à dificuldade de detectar pequenas mudanças nos níveis de proteína em concentrações muito baixas. Este desafio é especialmente pronunciado com biomarcadores de câncer em que o objectivo é muitas vezes para encontrar biomarcadores de um pequeno tumor maligno no sangue de uma relativamente grande corpo humano em um estágio inicial.

O recém-concluído National Lung Screening Trial (NLST) relatou um benefício significativo de triagem para NSCLC com baixa dose de CT e detectar doença em estágio inicial em uma população de alto risco [31] mortalidade.