Abstract
Anti-EGFR terapia é comumente usado para tratar o cancro colorectal (CRC), embora apenas um subconjunto de pacientes se beneficiam com o tratamento. Enquanto
KRAS
mutação prediz não-resposta, marcadores preditivos positivos não são na prática clínica. Nós já mostrou que imuno-histoquímica (IHQ) guiada por
EGFR
número de cópias do gene análise (GCN) podem identificar pacientes com CCR que beneficiam de um tratamento anti-EGFR. Aqui nós testamos o valor preditivo de tal análise em chemorefractory CRC metastático, elucidado
EGFR
heterogeneidade GCN dentro dos tumores, e avaliaram a associação entre
EGFR
GCN,
KRAS
, e resposta de anticorpos anti-EGFR em linhas celulares de CRC. A coorte chemorefractory paciente consistiu de 54
KRAS
do tipo selvagem (WT) pacientes com CCR metastático.
EGFR
estatuto GCN foi analisada pela prata
in situ
hibridação utilizando um valor de corte de 4,0
cópias EGFR
genes /célula.
KRAS
WT e
KRAS
mutantes linhas celulares de CRC com diferentes
EGFR
GCN foram usados em
in vitro
estudos. Os tumores CRC chemorefractory com
EGFR
aumento GCN (≥4.0) responderam melhor à terapia anti-EGFR de
EGFR
GCN ( 4,0) tumores (benefício clínico,
P
= 0,0004; PFS, HR = 0,23, 95% CI 0,12-0,46).
EGFR
GCN contadas usando a orientação EGFR IHC foi significativamente maior do que o valor das áreas seleccionadas aleatoriamente verificando intratumoral
EGFR
GCN heterogeneidade. Em linhas celulares de CRC,
EGFR
GCN correlacionada com a expressão de EGFR. Melhor resposta anti-EGFR foi visto com
KRAS
WT,
EGFR
GCN = 4 células e uma resposta mais pobre com a
KRAS
WT,
EGFR
GCN = 2 células. resposta anti-EGFR foi associada a AKT e ERK1 /2 fosforilação, que foi efetivamente inibida apenas em células com
KRAS
WT e aumento da
EGFR
GCN. Em conclusão, IHC-guiada
EGFR
GCN é um preditor promissora da eficácia do tratamento anti-EGFR no CRC chemorefractory
Citation:. Algars A, Avoranta T, Österlund P, Lintunen M, Sundström J , Jokilehto T, et al. (2014) Heterogêneos
EGFR
Gene Copiar Número aumento é comum no cancro colorectal e define resposta à terapia anti-EGFR. PLoS ONE 9 (6): e99590. doi: 10.1371 /journal.pone.0099590
editor: Anthony Federação das Índias Ocidentais Lo, da Universidade Chinesa de Hong Kong, Hong Kong
Recebido: 19 Janeiro, 2014; Aceito: 15 de maio de 2014; Publicação: 18 de junho de 2014
Direitos de autor: © 2014 Algars et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este estudo foi apoiada pela Fundação finlandesa Medical, a Fundação finlandesa do Câncer, A Escola Nacional de Pós-graduação de Investigações clínicas, Universidade Turku Hospital EVO concessão, a Academia da Finlândia, e The Cancer Society of South-Western Finland. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
Conflito de interesses:. AA, ML, JS, RR e OC são inventores de uma patente relacionada com essa trabalho: US 20110217296 A1 Método para seleccionar doentes para o tratamento com um inibidor de EGFR. Todos os demais autores declararam não haver conflitos de interesse. Isto não altera a adesão dos autores para as políticas PLoS ONE em dados e materiais de compartilhamento.
Introdução
receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR) de sinalização é normalmente ativada no câncer colorretal (CRC). De EGFR-direccionamento anticorpos monoclonais (mAb) tornaram-se uma opção de tratamento padrão, particularmente na fase chemorefractory de doença metastática [1].
KRAS,
uma molécula de sinalização a jusante de EGFR, está mutado em aproximadamente 40% de CRCs [1] e estas mutações de activação transmitir resistência ao tratamento anti-EGFR [2]. Nos tumores
KRAS
do tipo selvagem (WT), a resposta objectivo é alcançado em cada três pacientes, indicando que outros fatores contribuem para a eficácia da droga [3]. Assim, há necessidade urgente de novos marcadores preditivos.
EGFR
número de cópias do gene aumento (GCN) tem sido associada a resposta ao tratamento anti-EGFR. A maioria dos estudos têm mostrado uma associação entre o nível de GCN e benefício clínico, a sobrevivência livre de progressão (PFS) e, em alguns casos, com a sobrevida global (OS) [4] – [6]. No entanto,
EGFR
GCN não está a utilizada no contexto clínico devido a obstáculos técnicos e variação considerável entre os sistemas de pontuação [7]. Recentemente, relatou um novo algoritmo, o que pode melhorar o valor preditivo da
EGFR
GCN. O primeiro mostrou que o
EGFR
GCN como analisado por prata
in situ
hibridação (SISH) positivamente correlacionada com a imuno-histoquímica (IHQ), quando a avaliação foi realizada a partir de áreas de tumor de maior intensidade de coloração [ ,,,0],8]. Demonstramos ainda que um aumento da
EGFR
GCN, usando valor de corte (≥4.0), foi positivamente correlacionada com a resposta à terapia anti-EGFR em todos os três parâmetros analisados: benefício clínico, PFS e OS.
EGFR
GCN era independente do
KRAS
status, e quando as duas análises foram combinados, eles previram a resposta ao tratamento melhor do que qualquer teste sozinho. A média
EGFR
GCN, tal como analisado por este método foi de 5,5, e copiar aumento número ≥4.0 foi observada em 64% dos tumores. O aumento GCN era tipicamente associado com o cromossomo 7 polissomia, ao passo que a amplificação de alto nível foi raramente visto.
A razão para a variação publicada
EGFR
resultados GCN pode ser heterogeneidade do tumor, o que não foi abordada em estudos anteriores. Há alguma evidência de que o EGFR pode ser expressa heterogeneamente no interior dos tumores colo-rectais individuais, tanto a nível do gene e proteína [5]. A heterogeneidade pode complicar a análise da expressão da proteína EGFR e copiar alterações de números e levar a uma má reprodutibilidade teste [7], [9]. Isto pode ser especialmente relevante na análise à base de peixe, onde a contagem GCN não pode ser correlacionada com a histologia [7]. Se
EGFR
heterogeneidade desempenha um papel biológico, em seguida, um algoritmo, em que a expressão da proteína (IHC) guias
EGFR
avaliação GCN, poderia melhorar o valor preditivo.
O objetivo deste estudo foi testar a novela
EGFR
método GCN em uma coorte independente paciente e para avaliar o impacto da
EGFR
estatuto GCN com o resultado em um grupo de pacientes chemorefractory combinados. Em ambos os grupos de pacientes um
aumento EGFR
(≥4.0) foi mostrado para associar com um resultado clínico melhorado, incluindo a taxa de benefício clínico, PFS e OS. Os objetivos secundários foram elucidar
EGFR
GCN heterogeneidade dentro dos tumores e para testar, se linhas celulares de CRC com vários
EGFR
GCN, respondem de forma diferente ao EGFR mAbs. De acordo com nossos resultados,
EGFR
GCN é heterogênea no CRC e os valores obtidos com a orientação IHC de áreas tumorais selecionados são maiores do que os obtidos por seleção aleatória. É importante salientar apenas o
EGFR
GCN contou com a orientação EGFR IHC foi capaz de prever a resposta ao tratamento anti-EGFR. Nosso
in vitro
estudos apoiar os nossos achados clínicos, uma vez que a melhor resposta ao tratamento anti-EGFR foi visto em
KRAS
WT,
EGFR
GCN = células 4.0 e de resposta mais pobres no
KRAS
WT,
EGFR
GCN = 2 células.
Materiais e Métodos
os pacientes
o Hospital originais Universidade Turku coorte descoberta tem sido relatada [8]. A coorte de validação consistiu de 31
KRAS
pacientes em peso tratados com EGFR mAbs na segunda-sexta linha no Hospital Universitário de Helsinki para câncer colorretal metastático entre junho de 2008 e julho de 2010. Os critérios de selecção para este estudo foram: (I ) tecido estava disponível a partir do tumor primário em diagnóstico antes do início de qualquer tratamento, (II) o tumor era
KRAS
WT, (III) os pacientes receberam tratamento de segunda a sexta-linha com cetuximab ou panitumumab com ou sem quimioterapia, e (IV) os pacientes não tinham outra doença maligna em sua história. A histologia de cada caso validação coorte foi reavaliado por um especialista em GI-patologia (AR).
O grupo combinado de pacientes chemorefractory incluídos 54 pacientes, 25 do coorte Turku original e 29 a partir da validação Helsínquia conjunto. A coorte chemorefractory paciente incluiu pacientes tratados com mAbs anti-EGFR em terceira linha ou mais, seja como terapia única ou em combinação com irinotecan +/- uma fluoropirimidina. As principais características de todos os três grupos estão descritos na Tabela 1.
A resposta ao tratamento anti-EGFR foi avaliada por tomografia computadorizada (TC) ou ressonância magnética (MRI) de acordo com os Critérios de Avaliação de Resposta em tumores sólidos (RECIST versão 1.1) [10]. O benefício clínico foi considerada uma resposta parcial (PR) ou, pelo menos, 3 meses de doença estável (SD). sobrevivência livre de progressão (SLP) foi calculado a partir do início do tratamento com anti-EGFR até progressão da doença. A sobrevida global (OS) foi calculado a partir do início da terapia anti-EGFR até a morte de qualquer causa.
Declaração de Ética
O estudo foi conduzido de acordo com a Declaração de Helsinki. Os dados clínicos foram recuperados e amostras histológicas coletadas e analisadas com o aval da Autoridade Nacional de médico-legais Assuntos bem como o Institutional Review Board do Distrito Hospital do Sudoeste da Finlândia e Ética Conselho de Revisão no Hospital Universitário de Helsinki. consentimento informado por escrito ou oral não foi obtida devido ao fato de que uma grande parte dos pacientes incluídos neste estudo retrospectivo tinha morrido de sua doença. A necessidade de consentimento informado dos participantes foi dispensada pela Autoridade Nacional para os Assuntos Médico-Legal.
IHC e sish Procedimentos
KRAS
análise de mutação foi realizada com o DxS KRAS kit mutação (DxS Ltd, Manchester, UK). Métodos pormenorizados de EGFR IHC e
EGFR
GCN foram descritos [8]. Em resumo, três mm secções foram primeiro corados com EGFR (clone 5B7) mAb (Ventana Medical Systems /Roche Diagnostics, Tucson AZ, EUA). Foram realizadas marcações com XT BenchMark (Ventana /Roche) utilizando
ultra-
VISTA Universal DAB Detection Kit (Ventana /Roche).
gene EGFR
foi detectado a partir subsequentes de cinco mm seções com
EGFR
DNA Probe (Ventana /Roche) e
ultra-
VISTA Kit de Detecção de SISH (Ventana /Roche). Em cada tumor,
EGFR
GCN de quarenta células tumorais foi analisada utilizando uma objetiva de 40x por dois observadores (ML, JS) de áreas de maior reactividade IHC. Os investigadores foram cegados da informação clínica. Para avaliar a média
EGFR
GCN dentro de cada tumor, cinco áreas de tumor foram escolhidos arbitrariamente. De cada uma dessas áreas,
EGFR
GCN de 20 células cancerosas selecionados aleatoriamente foi contado por dois observadores (TA, JS). Os resultados foram apresentados como média e variam dentro de cada área.
linhas celulares, Western Blotting e Citotoxicidade
O C2BBe1, linhas celulares SK-CO-1 e NCI-H747 foram adquiridos da ATCC (Manassas, VA, EUA) e a linha 2 CW-célula do centro Bioresource RIKEN (Tsukuba, Japão). As células NCI-H747 e CW-2 foram cultivadas em meio RPMI-1640, as células SK-CO-1 em células EMEM e C2BBe1 em DMEM suplementado com 0,01 mg /ml de transferrina humana (Sigma, Saint Louis, MO, EUA). Todos os meios foram suplementados com FBS a 10%, glutamina 2 mM e 1% de penicilina /estreptomicina.
Para as células análise de caminho de sinalização foram cultivadas em 6 placas de poços e deixadas a aderir durante 12 horas em meio normal. Em seguida, eles foram transformados em meio com FBS a 1% e dado 0-200 ug /ml cetuximab (Erbitux, Serono) durante 24 horas. 25 mg /ml de EGF foi dado às células durante cinco minutos antes de lise.
os níveis de proteína foram analisados por transferência de Western de células lisadas em tampão RIPA (Tris-HCl a 50, NaCl 150 mM, 1% de Nonidet P -40, 0,5% de desoxicolato, 0,1% de SDS, 1 mM de ortovanadato, e mistura de inibidor de protease, a pH 7,4). As proteínas foram resolvidas por SDS-PAGE e transferidos para membranas de nitrocelulose. Após incubação durante a noite em + 4C ° com o anticorpo primário [anti-EGFR (D38B1, Cell Signaling Technology, Danvers, MA, EUA), fosfo-EGFR (Tyr1173, 53A5, Cell Signaling Technology), ERK2 (K-23, Santa Cruz Biotechnology , Dallas, TX, EUA), fosfo- ERK1 /2 (Thr202 /Tyr204, D13.14.4E, tecnologia de sinalização celular), fosfo-AKT (Ser 473), panAKT (C67E7, Cell Signaling Technology)], as membranas foram incubadas durante 1 hora à temperatura ambiente com anticorpo secundário conjugado com peroxidase de rábano (Dako, Glostrup, Dinamarca) e os sinais foram detectados com SuperSignal West Pico substrato quimioluminescente (Thermo Scientific, Waltham, MA, EUA). Anti-tubulina α mAb (B-1-5-1-2, Sigma) ou HRP-conjugado anti-GAPDH mAb (mAbcam 9484, Abcam, Cambridge, Reino Unido) foi utilizada como um controlo de carga.
para os ensaios de viabilidade celular, 5000 células /poço foram semeadas em placas de 96 poços. Após incubação durante a noite na presença de 2% de FBS, as células foram expostas a 0-200 ug /ml cetuximab (Erbitux, Serono) ou panitumumab (Vectibix, Amgen), durante 72 horas em meio suplementado com FBS a 1%. Cada tratamento foi realizado em triplicado e a experiência foi repetida quatro vezes. A viabilidade celular foi avaliada com o CellTiter 96 Aqueous One Solution ensaio de proliferação celular (Promega, Madison, WI, EUA). A viabilidade celular é dada como percentagem das células de controlo.
Análise Estatística
As análises estatísticas foram realizadas com os programas SAS 9.2 e Empresa Guia 4.2 (SAS Institute Inc., Cary, NC). os dados da tabela de frequência foram analisados com o χ2-test ou teste exato de Fisher. A diferença de
EGFR
valores GCN obtidos por diferentes métodos de avaliação (variáveis com distribuição normal) foi calculada com o teste t de Student. testes-log rank Kaplan-Meier e, assim como Cox modelo de regressão de riscos proporcionais foram utilizados para análise de sobrevida univariada. Todos os testes estatísticos foram bilaterais.
P
-Valores 0,05 foram considerados estatisticamente significativos. A significância estatística para os ensaios de viabilidade celular foi calculada com o Microsoft Excel 2011 e StatPlus: mac LE (Versão 2009, AnalystSoft Inc.). A significância entre as diferenças nas respostas nas linhas celulares foi determinada com two-way ANOVA seguido por vários testes t.
Resultados
EGFR
GCN Validação dos testes com uma coorte
paciente Independent
Para validar nossos resultados anteriores sobre a associação entre o
EGFR
GCN e resposta ao tratamento anti-EGFR, estudamos um grupo de pacientes independente tratados no Hospital Universitário de Helsinki. Os métodos para a
EGFR
detecção GCN eo valor de corte para aumento GCN eram idênticos ao estudo descoberta [8]. Na coorte de validação, 18 dos 31 (58%) tumores tinham um
EGFR
GCN acima do valor de corte (≥4.0), em comparação com 64% no conjunto descoberta original. Quatorze (78%) do alto
EGFR
GCN (≥4.0)
KRAS-
WT pacientes mostraram benefício clínico [resposta parcial (PR) + doença estável (SD)] a partir de anti-EGFR terapia, enquanto apenas 4 (31%) de baixo
EGFR
GCN ( 4,0) beneficiaram de tratamento (teste do qui-quadrado,
P
= 0,009). Um elevado
EGFR
GCN associado significativamente com o aumento da sobrevivência. O tempo médio PFS de
EGFR
GCN≥4.0 foi de 25 semanas, em comparação com apenas 11 semanas do
EGFR
GCN 4,0 pacientes (teste log-rank,
P
= 0,002, teste de Cox,
P
= 0,003, HR = 0,28, 95% CI 0,12-0,65; Figura 1a). Além disso, o
EGFR
GCN≥4.0 associado significativamente com a melhoria da OS (mediana de 12,1 versus 8,2 meses; teste log-rank,
P
= 0,004, teste de Cox,
P
= 0,006, HR IC = 0,32, 95% 0,14-0,72;. Figura 1b)
sobrevida sem progressão (a) e sobrevida global (b) da coorte de validação de teste de acordo com a
EGFR
o número de cópias do gene. sobrevivência livre de progressão (c) e sobrevida global (d) da amostra de pacientes chemorefractory combinados.
Correlação entre
EGFR
GCN e resposta ao tratamento em pacientes Chemorefractory
Nós combinamos o chemorefractory
pacientes KRAS
WT de ambas as coortes (
n
= 54) para mais análises estatísticas. Oitenta por cento (28 de 35) dos pacientes com alto
EGFR
GCN (≥4.0) obteve benefício clínico. Em contraste, a taxa de benefício clínico foi de apenas 32% (6 de 19) para os pacientes com uma baixa
EGFR
GCN ( 4,0) (teste do qui-quadrado,
P
= 0,0004).
Foram analisados separadamente os 31 pacientes chemorefractory tratados com cetuximab (57%) e 21 com panitumumab (39%). Dois pacientes foram tratados com ambos os anticorpos anti-EGFR sequencialmente e, por conseguinte excluídos da análise. A taxa de benefício clínico em doentes tratados com cetuximab +/- terapia citotóxica com um elevado
EGFR
GCN nos seus tumores primários foi de 86% (18/21), em comparação com 20% (2/10) no grupo de pacientes com um
EGFR
GCN 4.0 (teste exato pescadores,
P
= 0,0007). No grupo de pacientes tratados com panitumumab +/- terapia citotóxica benefício clínico foi de 67% (8/12) nos pacientes com alto
EGFR
GCN e 44% (4/9) em pessoas com um baixo
EGFR
GCN. Os resultados são apresentados mais detalhadamente na Tabela S1.
O aumento da
EGFR
GCN Associates com a melhoria da PFS e OS na Doença Chemorefractory
A PFS mediana da coorte chemorefractory paciente estava significativamente maior no
EGFR
pacientes GCN≥4.0 do que no
EGFR
GCN 4,0 pacientes; . 29.5
vs
10,8 semanas (teste log-rank,
P Art 0,0001; teste de Cox,
P Art CI 0,0001, HR = 0,23, 95% 0,12 -0,46). O tempo de sobrevida média para pacientes com
EGFR
tumores GCN≥4.0 foi de 12,5 meses, em comparação com 7,2 meses para aqueles com
EGFR
GCN abaixo do valor de corte (Log-Rank teste,
P
= 0,0002; teste de Cox,
P
= 0,0003, HR = 0,32, 95% CI 0,17-0,59). As curvas de sobrevivência de Kaplan-Meier são mostrados na Figura 1 c-d.
PFS manteve-se por mais tempo nos pacientes com um elevado
EGFR
GCN independentemente de qual anti-EGFR mAb foi utilizado. Nos pacientes tratados com cetuximab +/- terapia citotóxica o tempo de sobrevida média foi estatisticamente significativamente maior no grupo de pacientes com um
EGFR
GCN≥4.0, em comparação com aqueles com um
EGFR
GCN abaixo de 4,0 (12,5
vs
4,6 meses;. log-rank test
P
= 0,0006; teste de Cox
P
= 0,001, HR 0,25, 95% CI 0,10-0,58 ), enquanto que não houve diferença estatisticamente significativa SO foi observada nos pacientes tratados com panitumumab. Os resultados são mostrados na Tabela S1.
Os dados de sobrevivência do discovery- original, o validação- independente, e combinados coortes chemorefractory paciente são comparados na Figura 2.
As razões de risco e confiança intervalos da descoberta original, validação e coortes de pacientes chemorefractory combinadas são mostrados. A alta
EGFR
GCN (IHC SISH guiada) está associada a uma doença resultado melhorada em todos os três
KRAS tipo selvagem
câncer colorretal metastático coortes de pacientes tratados com terapia anti-EGFR (duas coortes independentes e uma coorte combinada de pacientes chemorefractory).
EGFR
GCN heterogeneidade nos tumores
EGFR
GCN foi avaliada de forma aleatória, sem orientação IHC, a partir de todos os tumores de coorte de validação 31. A média
EGFR
valores GCN das áreas seleccionadas aleatoriamente foram significativamente menores quando comparado com o método em que o
EGFR
GCN foi avaliada selectiva de áreas com maior expressão da proteína EGFR (
P
0,0001). A mediana
EGFR
GCN destes 31 tumores primários CRC foi de 4,3 quando se utilizou orientação IHC e 3,3, quando a análise foi realizada de forma aleatória. A heterogeneidade dos
EGFR
GCN dentro de uma amostra de tumor CRC é demonstrado na Figura 3.
EGFR IHC mostra a coloração heterogênea com reactividade membranoso intensivo no meio (a).
EGFR
SISH dos agrupamentos de genes intensamente coradas área mostrando (b).
EGFR
SISH das zonas circundantes com coloração EGFR IHC fraco ou negativo mostra marginalmente número de cópias do gene elevadas ou normais (c-d).
Quando o escolhido aleatoriamente
EGFR
valores GCN foram utilizados para a análise de sobrevivência (
EGFR
GCN≥4.0
vs EGFR
GCN 4.0.) foi observada nenhuma diferença estatisticamente significativa entre os dois grupos (PFS:
P
= 0,07, HR 0,40; IC 95% 0,15-1,08; OS:
P
= 0,22, HR = 0,58, 95% CI 0,25-1,38). Não houve diferença significativa na eficácia do tratamento anti-EGFR (benefício clínico
vs doença progressiva.
) Foram anotado (teste Exato pescadores,
P
= 0,19).
EGFR
GCN e resposta ao Anti-EGFR Abs in vitro
Nós procurou o banco de dados linha de células de câncer de Sanger Center (https://www.sanger.ac.uk/cgi-bin/genetics/CGP /cghviewer/CghHome.cgi) para
EGFR
alterações GCN. Um baixo nível de
EGFR
aumento GCN (4-15 cópias /célula), tipicamente devido ao cromossomo 7 polissomia, foi observado em 18 dos 39 (46%) linhas celulares. Correlacionar a
EGFR
GCN e
KRAS
estatuto com a resposta anti-EGFR mAb, escolhemos quatro linhas para análise. As linhas celulares C2BBe1 CW-2 e são
KRAS
WT e têm dois e quatro cópias de
EGFR,
respectivamente. NCI-H747 e SK-CO-1 são ambos
KRAS
mutantes e tenham mais de quatro cópias (6-7) do
EGFR
. O
EGFR
GCN foi confirmada por SISH (Figura 4a). O
EGFR
GCN se refletiu diretamente na expressão da proteína EGFR como indicado por análise de Western blot (Figura 4b). Em ensaios de viabilidade celular, a
KRAS
linha de células WT com
EGFR
GCN 4 (C2BBe1) foi o mais sensível tanto cetuximab e tratamento panitumumab (Figura 4c). A diferença foi altamente significativa quando comparado com qualquer uma das outras linhas de células (teste t de Student,
P
0,001). Curiosamente, o
EGFR
disomic, WT
KRAS
linha de células (CW-2) foi mais resistente ao tratamento mAb. As linhas celulares com mutante
KRAS Comprar e
EGFR
GCN 4 mostrou sensibilidade intermediária, especialmente para o tratamento com panitumumab. Os resultados são, portanto, de acordo com os nossos dados clínicos que indicam que ambos
EGFR
GCN e
KRAS
status de definir a resposta das células do tumor para anti-EGFR mAbs.
(a)
EGFR
análise GCN SISH das diferentes linhas celulares. (B) Uma imagem de Western blot que mostra os níveis de proteína de EGFR nas diferentes linhas celulares. α-tubulina foi utilizada como controlo para o carregamento igual. A viabilidade celular das diferentes linhas de células a várias concentrações de (c), cetuximab e (d) panitumumab. Os resultados são apresentados como percentagem de células viáveis em comparação com as células não tratadas (média ± DP de cinco experiências). (E) transferências de Western mostrando EGFR via moléculas nas diferentes linhas celulares de sinalização. As células foram pré-tratados com as quantidades indicadas de cetuximab durante 24 horas em meio contendo 1% de FBS e dada EGF (25 ng /ml) durante 5 minutos antes da lise. As moléculas de sinalização indicados foram analisados com western blotting. GAPDH foi usada como um controlo para o carregamento igual.
ainda analisaram o efeito de anti-EGFR tratamento com mAb na sinalização intracelular nestas linhas celulares. Em
KRAS
linhas celulares mutantes com mais do que quatro
EGFR
cópias de genes, a fosforilação do EGFR era evidente e eficientemente bloqueada por mAb anti-EGFR (Figura 4E). inibição anti-EGFR reduzida parcialmente 2 níveis de pErk1 /, enquanto que o nível de pAKT não foi afectada. Em
KRAS
linhas celulares em peso com 2-4
EGFR
fosforilação cópias do gene EGFR foi abaixo do limite de detecção (não mostrado). No entanto, a via era aparentemente operacional, tal como indicado por respostas sobre a sinalização a jusante. Na
EGFR
linha disomic CW-2, o tratamento anti-EGFR mAb redução do nível pErk1 /2, mas não afetou AKT fosforilação (Figura 4e). Apenas em
EGFR
do tipo selvagem polysomic e
KRAS
células C2BBe1, um bloqueio eficaz de sinalização de ERK1 /2 e AKT, foi detectado (Figura 4e). Estes resultados, assim, sugerem que tanto
EGFR
GCN e
KRAS
estado de mutação determinar o efeito do EGFR anti-mAb em EGFR sinalização a jusante e sobrevivência das células do câncer colorretal.
Discussão
neste estudo, demonstramos que heterogêneo
EGFR
aumento GCN é um forte preditor do benefício do tratamento anti-EGFR em câncer colorretal metastático. Os resultados estender nossas descobertas anteriores de um grupo de pacientes único instituto a uma coorte de validação independente. Além disso, eles demonstram o valor preditivo da
EGFR
GCN para a eficácia da terapia anti-EGFR em pacientes CRC chemorefractory, o grupo de pacientes mais importante elegíveis para este tratamento. Os resultados mostram ainda que intra-tumoral
EGFR
GCN heterogeneidade é comum no CRC. Nossa hipótese é que este previamente desaparecidos
EGFR
heterogeneidade é uma razão para a fraca correlação entre relatou
EGFR
análise GCN e eficácia da terapia anti-EGFR, e sugerir um método melhorado para preditivo
EGFR
testes GCN.
O material paciente em nosso estudo incluiu pacientes tratados com a terapia anti-EGFR tanto em uma fase inicial e chemorefractory da terapia de câncer colorretal metastático. Para controlar os efeitos de confusão de sensibilidade quimioterapia, quando combinado com mAbs anti-EGFR em nossos resultados, o valor preditivo da
EGFR
GCN na resposta ao tratamento anti-EGFR foi avaliado separadamente no subgrupo de pacientes tratados em um chemorefractory fase (terceira linha ou mais). Os resultados obtidos no subgrupo chemorefractory foram semelhantes aos resultados de todo o grupo de pacientes, o que apoia a nossa interpretação de que um elevado
EGFR
GCN é de facto um indicador da resposta ao tratamento anti-EGFR favorável.
Ambos cetuximab e panitumumab no subgrupo chemorefractory paciente demonstrou PFS melhoradas em
EGFR
pacientes GCN≥4.0. A sobrevida global ea taxa de controle da doença foi estatisticamente melhorada para a coorte cetuximab, e numericamente, mas não estatisticamente na pequena coorte panitumumab. Os dois Abs terapêuticos são de tipo diferente, panitumumab sendo um mAb totalmente humano, enquanto o cetuximab é uma quimera ratinho-humano.
In vitro
ensaio demonstrou citotoxicidade idêntico para as linhas CRC testados, mas
in vivo
, outros mecanismos, incluindo a citotoxicidade dependente de anticorpos (ADCC) podem ser operacionais. A este respeito, cetuximab e panitumumab pode ser diferente e, por conseguinte, aumentado
EGFR
GCN poderia indicar melhor sensibilidade ao tratamento com cetuximab [11]. De acordo com terapias citotóxicas pré-clínicos e clínicos dados determinados +/- agentes imunomoduladores, por exemplo, incluindo Gilf (gemcitabina, irinotecano, levofolinic, e 5-fluorouracilo), GILFI (gemcitabina, irinotecano, ácido levofolinic, fluorouracilo, aldesleucina), e GOLFIG (gemcitabina, oxaliplatina, levofolinato, 5-fluorouracilo, GM-CSF, aldesleucina) esquemas, têm a capacidade para eficazmente sobre-regular a expressão de EGFR em células de cancro do cólon, aumentando assim a sensibilidade das células de cancro do cólon de ADCC mediada por cetuximab [12] – [14]. Em nosso estudo, panitumumab foi usada como terapia única mais frequentemente do que cetuximab, 42,9
vs
6,5% respectivamente, o que, pelo menos em parte pode explicar a diferença observada nos resultados de eficácia entre os dois anticorpos. Ambos os anticorpos, quando não administrado como tratamento único, foram combinados com regimes de quimioterapia à base de irinotecano. No nosso estudo, oxaliplatina ou capecitabina único não foram combinadas para a terapia anti-EGFR na fase chemorefractory da doença. Duas pacientes receberam cetuximab e panitumumab sequencialmente e, por conseguinte excluídos deste estudo. Portanto, nem a combinação de fármacos citotóxicos ou da administração de ambos os anticorpos sequencialmente, explica a diferença entre os resultados obtidos com os diferentes anticorpos anti-EGFR. Alternativamente, o nosso resultado pode refletir uma diferença entre os pacientes tratados. Cetuximab foi mais comumente utilizados na coorte descoberta, que definiu o valor de corte de teste e panitumumab no coorte de validação com apenas pacientes chemorefractory. Como ambos os grupos eram retrospectivos, não podemos excluir diferenças nas populações de pacientes, o que poderia explicar as diferenças nos resultados do tratamento.
Tumor heterogeneidade tem sido sugerido para contribuir para as dificuldades encontradas na validação de biomarcadores oncológicos [15] . No presente trabalho, a média
EGFR
GCN valores foram significativamente menores quando analisadas de uma forma aleatória, em comparação com os valores obtidos escolhendo as células com a maior GCN. Só o último método era capaz de distinguir doentes de acordo com a sua resposta ao tratamento anti-EGFR. Isto apoia a ideia de que a tomada de decisão terapêutica baseada em marcar o fenótipo dominante pode ser enganosa [15]. Mesmo uma porcentagem menor de alelos mutantes e perfis de expressão gênica pode ser crucial para a resposta ao tratamento [16].
EGFR
GCN heterogeneidade é um fenômeno bem estabelecido na gliomas [17]. Embora
EGFR
GCN heterogeneidade na CRC podem ter sido identificados anteriormente, este achado tem sido geralmente ignoradas, e não utilizada como parâmetro na análise de diagnóstico. Em alguns aspectos, a associação entre o
EGFR
GCN e resposta ao tratamento assemelha-se os achados de outro membro da família EGFR,
Her2,
no câncer gástrico.
Her2
é amplificado ou sobre-expressos em 7-34% dos cancros gástricos [18]. Ao contrário do câncer de mama, expressão Her2 em shows de câncer gástrico marcada heterogeneidade intra-tumoral, e, portanto, a interpretação do teste de diagnóstico difere do cancro da mama [19]. Os atuais diagnósticos preditivos para o tratamento trastuzumab no câncer gástrico é baseado em uma combinação de Her2 IHC e
Her2
análise GCN de áreas com maior coloração IHC. Em biópsias, tais áreas podem cobrir apenas 5% do tumor [19]. Embora haja paralelos, o algoritmo de câncer de Her2-gástrica difere do
EGFR
GCN no CRC. No câncer gástrico, o valor de corte é baseada em gene à relação do cromossomo ≥2.0, embora a maioria das recomendações recentes sugerem que
Her2
GCN 6.0 pode ser considerado como positivo. No CRC, o
EGFR
aumento GCN é tipicamente um resultado do cromossomo 7 polissomia e, portanto, o gene a proporção de cromossomos não é informativo. Por outro lado cromossomo 17 é raramente polyploid no câncer gástrico, o que indica um mecanismo biológico diferente para
EGFR
e
aumento Her2
.
Tumor heterogeneidade tem sido sugerido para subjacentes resistência a terapias direcionados cancro [15]. A este respeito, a constatação de que uma população pequena de
EGFR
de células de alta GCN define a resposta ao tratamento é inesperado.