Sumário

Os retinóides, os derivados naturais ou sintéticos da vitamina A (retinol), são essenciais para o desenvolvimento normal da próstata e tem sido mostrado para modular a progressão do cancro da próstata in vivo, bem como para modular o crescimento de várias linhas de células de cancro da próstata. -9-cis-retinóico e ácido todo-trans-retinóico, ácido são os dois mais importantes metabolitos de retinol. junções comunicantes, formadas por proteínas chamadas conexinas, são conjuntos de canais intercelulares que permitem a troca de moléculas reguladoras pequeno crescimento entre células adjacentes. Gap comunicação por junções é instrumental no controlo do crescimento celular. Foi examinado o efeito do ácido 9-cis-retinóico e ácido all-trans retinóico sobre a formação e degradação das junções de hiato, bem como na comunicação por junções de uma linha celular de cancro da próstata andrógeno-responsivo, LNCaP, que expressou retroviral introduzido connexin32, uma conexina expressa pelas células luminais e células bem diferenciadas de tumores da próstata. Nossos resultados mostraram que o ácido 9-cis-retinóico e ácido trans-retinóico reforçada a montagem de connexin32 em junções comunicantes. Os nossos resultados mostraram adicionalmente que o ácido o ácido 9-cis-retinóico e todo-trans-retinóico impedido degradação reguladas-androgénio das junções de hiato, pós-tradução, independente da sinalização mediada por receptor de androgénio. Por fim, os nossos resultados mostraram que a formação de junções de hiato sensibilizados células LNCaP que expressam connexin32 para os efeitos de crescimento modificação de ácido 9-cis-retinóico, todo-trans-retinóico e androgénios. Assim, os efeitos de retinóides e andrógenos sobre o crescimento e a formação e degradação de junções comunicantes e sua função pode estar relacionado com a sua capacidade de modular o crescimento da próstata e cancro

Citation:. Kelsey L, Katoch P, Johnson KE , Batra SK, Mehta PP (2012) retinóides regulam a formação e degradação de Gap junções em andrógeno-Responsive células cancerosas da próstata humana. PLoS ONE 7 (4): e32846. doi: 10.1371 /journal.pone.0032846

Edição: Natasha Kyprianou, da Universidade de Kentucky College of Medicine, Estados Unidos da América

Recebido: 19 Outubro, 2011; Aceite: 31 de janeiro de 2012; Publicação: 13 de abril de 2012

Direitos de autor: © 2012 Kelsey et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Esta pesquisa foi apoiado pelo NIH CA113903, DOD PCRP (Department of Defense Research Program do cancro da próstata) 081.198 e Nebraska State Grant LB506 (PPM). Agradecemos o apoio do Centro de Nebraska para Sinalização Celular e NCI comunhão treinamento para Kristen Johnson. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

retinóides, os derivados naturais ou sintéticos da vitamina a, regular não só o desenvolvimento embrionário, mas também em tecidos adultos organogénese [1]. Um requisito para a vitamina A para a proliferação, diferenciação tem sido demonstrada em vários estudos em que uma deficiência de vitamina presente resultaram em múltiplos defeitos de desenvolvimento [1] – [3]. Todos ácido trans-retinóico (ATRA) e ácido 9-cis-retinóico (9-PCR) são os dois mais importantes metabolitos de vitamina A (retinol) com diversas funções fisiológicas [1]. Os retinóides são membros da superfamília dos receptores nucleares de factores de transcrição e exercem os seus efeitos pleiotrópicos através da regulação da expressão de vários genes alvo [3] – [5]. Existem seis receptores retinóides, nomeadamente α RAR, p, y, que se ligam ao ATRA e 9-PCR, e α RXR, P, γ, que se ligam apenas ao 9-CRA. Retinóide sinalização iniciada regula vários mecanismos de controle homeostáticos durante o desenvolvimento embrionário e em tecidos adultos e um tal mecanismo de controlo susceptível de ser regulada, é a comunicação célula-célula directa mediada por uma classe especial de junções celulares denominadas junções de hiato (GJS) [6] – [ ,,,0],8]. junções comunicantes são conjuntos de canais intercelulares que sinalizam ao permitir a troca directa de pequenas moléculas (≤1500 DA) entre células contíguas. As proteínas constituintes de GJS, chamados conexinas (CXS), sejam codificados por 21 genes, que foram designados de acordo com a sua massa molecular [9]. canais de célula-célula são estruturas bicelulares formados pelo esforço colaborativo de duas células. Para formar um canal célula-célula GJ, Cxs primeira oligomerizar como hexâmeros, chamados conexons, que doca com as conexons exibidos em células contíguas [10]. Várias linhas de evidência dá credibilidade à noção de que a comunicação por junções de hiato é um mecanismo de controle homeostático importante para a regulação do crescimento e diferenciação celular. Por exemplo, a expressão de Cx prejudicada, ou perda de função, tem sido implicado na patogénese de vários tipos de cancros, e mutações em vários genes Cx foram detectados em doenças genéticas caracterizadas por uma proliferação celular aberrante e diferenciação [8], [10] – [12]

os nossos estudos anteriores mostraram que as células luminais próstata expressa Cx32 e sua expressão coincidiu com a aquisição do estado diferenciado destas células [13], [14]. Mostrámos que a progressão do cancro da próstata (APC) a partir de um estado dependente de androgénios para um estado invasiva, independente de androgénios foi caracterizada pela falha de Cx32 para montar em GJS [14], [15]. Nós mostramos ainda que a reintrodução de Cx32 em linha de células andrógeno-sensível humana PCA, LNCaP, retarda o crescimento de células

in vivo

e

in vitro

[14], [16]. Subsequentemente, foi demonstrado que os andrógenos regulada a formação e degradação de GJS, alterando o nível de expressão de Cx32, pós-traducionalmente. Na ausência de androgénios, uma grande fracção do Cx32 foi degradada pelo retículo endoplasmático degradação associada (ERAD), enquanto que na sua presença desta fracção foi resgatado a partir de degradação [17]. O significado destes resultados é sublinhada pelo facto de que os andrógenos desempenham um papel principal na sobrevivência e manutenção da função secretora (relacionadas com a diferenciação) de células epiteliais luminais de próstata normal, bem como de células tumorais como androgénio ablação induz a apoptose ou de desdiferenciação destas células [18], [19]

Tal como androgénios, os retinóides são também essenciais para o desenvolvimento normal da próstata e modular a progressão do APC em certos modelos de ratinho, bem como suprimir o crescimento de dependente de androgénio e – linhas de células independentes humanos APC. Observou-se metaplasia escamosa da próstata entre os descendentes de vitamina A deficiente [20] e RARy nocautear ratos [21]. Além disso, a inactivação específica para tecidos dos RARa na próstata resultou em hiperplasia intraepitelial multi-focal [22]. Estudos epidemiológicos mostraram que a diminuição da vitamina A níveis séricos aumentar APC incidência e progressão, e que a restauração de níveis de retinóides pode ter um papel na reversão do fenótipo maligno [23], [24]. Vários estudos, incluindo o nosso, têm mostrado que a capacidade de retinóides para suprimir o crescimento de células tumorais e induzir a diferenciação depende a sua capacidade para melhorar a comunicação por junções de hiato [25] – [28]. Porque Cx32 é expresso pelas células epiteliais luminais da próstata normal, em que ele é montado em GJS e por células epiteliais de tumores da próstata em que se forma ineficiente reunidos em GJS [13] – [15] e porque a formação de GJS tem sido implicado na manutenção da estado polarizado e diferenciado das células epiteliais [29], que concluiu que os efeitos quimiopreventivo, inibidor do crescimento e pró-diferenciação de 9-CRA e ATRA pode resultar da sua capacidade de controlar a formação e degradação de GJS. Por isso, investigamos se a formação e degradação de GJS compostas de Cx32 foram regulados por 9-CRA e ATRA em células PCA humanos. Uma vez que os retinóides têm sido mostrados para aumentar a expressão do receptor de androgénio (AR) em linhas responsivos aos andrógenos humanos APC de células [30], que racionalizado que pode modular a formação regulada de androgénios e a degradação de GJS e afectar o crescimento de células de PCA responsivos aos andrógenos que expressam Cx32. Usando células LNCaP andrógeno-sensível, que expressam retrovirally introduzidas Cx32 cuja degradação é andrógeno-regulamentado [17], que mostram que 9-CRA e ATRA, como andrógenos, aumentar a expressão de Cx32 e sua posterior montagem em GJS. Além disso, mostram ainda aqui que, neste modelo de cultura de células, o ATRA e 9-CRA evitar a degradação de androgénio-regulada de GJS, independente da sinalização mediada por AR. Finalmente, os nossos resultados mostram que a expressão de Cx32 e formação de GJS sensibiliza essas células para efeitos de crescimento modificação de 9-CRA, ATRA e andrógenos.

Materiais e Métodos

Cultura de Células

células LNCaP andrógeno-sensíveis foram um presente do Dr. Lin [31]. Um dos vários clones de células LNCaP que expressam rato retrovirally transduzidas Cx32, doravante referida como LNCaP-32 células, e um dos vários clones de controle selecionados no G418 após a infecção com retrovírus controle, doravante referida como células LNCaP-N, foram isolados como descrito [17] e foram usadas no presente estudo, juntamente com as células LNCaP parentais, daqui em diante referidas como células LNCaP-P. células LNCaP-P foram cultivadas em meio RPMI contendo soro fetal de bovino a 5% numa atmosfera de 5% /95% de ar e de culturas estoque de CO2 foram mantidas semanalmente como anteriormente descrito. células LNCaP-N e LNCaP-32 foram mantidas em meio RPMI contendo 5% de soro fetal de bovino e G418 a 200 ug /ml como descrito [17]. Durante o decurso destes estudos, foram utilizados dois lotes separados de soro fetal de bovino obtidos a partir de Sigma e Hyclone Laboratories, com efeito quase semelhante sobre o crescimento de células LNCaP. soro empobrecido-esteróide (stripped-carvão) foi obtido a partir de Hyclone Laboratories (Salt Lake City, UT). Também fenol utilizado sem vermelho RPMI para experimentos em que foi utilizado soro despojado carvão [17].

Os anticorpos e imunocoloração

Hibridoma M12.13 (um presente do Dr. Dan Goodenough, Harvard Universidade) tem sido descrito anteriormente [14], [16], [17], [32], [33]. De ratinho anti-ocludina (OC-clone 3F10) foi de Zymed Laboratories Inc. (South San Francisco, CA). De coelho anti-α-catenina, de coelho anti-β-catenina, de coelho anti-Cx32, e de ratinho anti-β-actina (clone C-15) foram de Sigma (St. Louis, MO). De ratinho anti-E-caderina, de ratinho anti-α-catenina, anticorpos anti-β-catenina de ratinho foram generosamente fornecido pelos Drs. Johnson e Wheelock (Eppley Institute) e têm sido descritos [17], [32], [33]. Um anticorpo anti-receptor de AR policlonal de coelho era de Santa Cruz Biotech (SC-13062, San Diego, CA). As células foram imunocoradas após a fixação com 2% de paraf ormaldeido durante 15 minutos, tal como descrito anteriormente [17], [32], [33]. Resumidamente, as células (1,5 x 10

5), semeadas em placas de seis poços contendo aglomerados lamelas de vidro e deixou-se crescer até cerca de 50-70% de confluência, foram imunocoradas à temperatura ambiente com vários anticorpos a diluições devidamente calibrados. anticorpos secundários (coelho ou ratinho) conjugadas com Alexa 488 e Alexa 594 foram utilizados como apropriado. Imagens de células imunomarcadas foram adquiridos com Leica DMRIE microscópio (Leica Microsystems, Wetzler, Alemanha) equipado com Hamamatsu câmera CCD ORCA-ER (Hamamatsu-City, Japão). Para estudos de co-localização, z-cortes seriados (0,5 mm) foram recolhidos e analisados ​​utilizando software de processamento de imagem (Volocity; Improvisação, Inc; Perkin Elmer).

Soluções de Stock

As soluções de reserva vários reagentes foram preparados como se segue: 9-PCR e o ATRA (BIOMOL, Plymouth, PA) foram preparadas em etanol a 3 mM de cada um e armazenado em alíquotas a -80 ° C ao abrigo da luz. Todas as experiências relativas a 9-PCR e o ATRA foram realizadas em luz amarela como descrito [26], [27]. As soluções de reserva de um androgénio sintético, mibolerona (MB), (BIOMOL), e de um androgénio natural, di-hidro-testosterona (DHT), prepararam-se a 1 mM em etanol e armazenado a -20 ° C em pequenas aliquotas protegidas da luz. Eles foram apropriadamente diluídas com o meio no momento do tratamento.

andrógeno Exaustão e outros tratamentos

As células foram semeadas em placas de seis poços contendo aglomerados lamelas de vidro (1,5 x 10

5 células por cavidade) e em 6 cm (2 × 10

5 células por prato) ou pratos in10-cm (3,5 × 10

5 células por prato) em 2, 4 e 10 ml de meio de cultura completo, respectivamente. As células foram tratadas quando aproximadamente 50% confluentes, repondo com meio fresco contendo diferentes reagentes na concentração desejada adicionados a partir de soluções estoque de modo a que a concentração final do solvente não exceder 0,3%. Para crescer células em meio depletado de androgénio, meio de cultura de células normal foi substituído por meio de cultura de células com depleção de androgénio (fenol RPMI isento de soro contendo vermelho despojado-carvão a 5%). Os controlos receberam meio fresco contendo soro normal.

Western Blot e análise de detergente Solubilidade Connexin32

a lise celular, o ensaio de solubilidade detergente com 1% de Triton X-100 (TX-100) e a expressão nível de Cx32 foram analisados ​​por análise de Western blot, conforme descrito [17], [32], [33]. Resumidamente, 5 x 10

5 LNCaP-P, LNCaP-N e células LNCaP-32 foram semeadas por placa de 10 cm em 10 ml de meio completo e cultivadas até à confluência, após o que as células foram lisadas em SSK tampão (10 mM de Tris , EGTA 1 mM, PMSF 1 mM, NaF 10 mM, NEM a 10 mM, na a 10 mM

2VO

4, 10 mM de iodoacetamida, 0,5% de TX-100, pH 7,4) suplementado com o cocktail de inibidores de protease (Sigma , St. Louis, MO). extractos -insoluble total, detergente solúvel e foram separadas por ultracentrifugação a 100.000 × g durante 60 min (35.000 rpm, em Beckman ultracentrífuga analítica; Modelo 17-65 utilizando um rotor SW50.1). As pastilhas detergentes insolúveis foram dissolvidos em tampão C (70 mM Tris /HCl, pH 6,8, ureia 8 M, 10 mM NEM, 10 mM de iodoacetamida, 2,5% de SDS, e 0,1 M de DTT). Após normalização baseada no número de células, o total, fracções de TX-100-solúveis e -insoluble foram misturadas com 4 x tampão de carga de SDS-a uma concentração final de 1 × e incubou-se à temperatura ambiente durante 1 h (para Cx32) antes de SDS- PAGE

Ensaios de comunicação

Gap comunicação juncional foi ensaiada por microinjecting os seguintes marcadores fluorescentes:. Lucifer Yellow (MW 443 Da; sal de lítio); Alexa Fluor 488 (MW 570 Da; A-10436) e Alexa Fluor 594 (MW 760 Da; A-10438). As soluções de reserva de corantes Alexa, obtidas como sais de sódio de hidrazida a partir de Molecular Probes (Carlsbad, CA), foram preparadas em água a 10 mM. amarelo Lúcifer foi microinjeção como solução de aquosa de 2,5%. sistemas de microinjecção Eppendorf InjectMan e FemtoJet (modelos de 5271 e 5242, Brinkmann Instrument, Inc., Westbury, NY), montado no microscópio Leica DMIRE2 como descrito anteriormente, foram usadas para microinject traçadores fluorescentes. As imagens de células micro-injectadas foram capturados com o auxílio da câmara CCD (Retiga 2000R, RÁPIDO 1394) usando QCapture (British Columbia, Canadá) e armazenadas como ficheiros TIFF. transferência juncional de traçador fluorescente foi quantificada por conseguir o número de células fluorescentes (excluindo a uma injectado) a partir das imagens TIFF captada em 1 min (Lucifer Yellow), 3 min (Alexa 488) e 15 min (Alexa 594) após microinjecção célula de teste como descrito [14], [17], [32], [34].

colony formação e crescimento celular Ensaios

O crescimento celular foi avaliada quer por formação de colónia de ensaio ou pela contagem células tal como descrito [14], [34]. Para o ensaio de formação de colónias, 2 × 10

3 células foram semeadas em placas de 6 cm, em triplicado, em pratos de meio de cultura de 3 ml. Depois de 24 h, um ml de meio contendo MB, 9-PCR e o ATRA foi adicionado aos pratos para dar a concentração final desejada. As células foram cultivadas durante 3-4 semanas (com uma mudança de meio cada 4-5 dias contendo a concentração apropriada de MB, DHT, 9-PCR e o ATRA) quando eles formaram colónias visíveis. Colónias nas placas foram fixadas com formaldeído a 3,7% tamponada, coradas com uma solução de 0,025% de violeta de cristal em PBS, e fotografados. Para medir o crescimento celular, 5 × 10

4 células foram semeadas em placas de 6 cm em pratos replicados e tratou-se com MB, 9-PCR e o ATRA isoladamente ou em combinação tal como descrito acima. As células foram deixadas crescer durante 9-11 dias com uma alteração do meio no dia 5. As células foram tratadas com tripsina e contadas num hemocitómetro.

Resultados

Retinóides Enhance Cx32 Nível de expressão

Foi utilizado LNCaP-32 as células que expressam Cx32 retroviralmente transduzidas de ratos [17], porque as células LNCaP parentais e LNCaP-P-N são desprovidos de níveis detectáveis ​​de Cxs conhecido e não formar GJS funcionais (ver Materiais e Métodos). Estudos anteriores mostraram que, em LNCaP-32 células andrógeno regulada a formação e degradação de GJS por controlar o nível de expressão de Cx32 pós-traducionalmente, por resgatar a sua degradação mediada por ERAD [17]. Com base na lógica descrita acima (ver introdução) e na nossa experiência com outras linhas de células [26], [27], as células LNCaP-32 foram tratadas com 9-PCR e o ATRA durante 48 h, para se examinar se afectam nível de expressão de Cx32. Verificou-se que 9-PCR e o ATRA aumento do nível de expressão de Cx32 de um modo dependente da dose (Figura 1, A). melhoria significativa, no entanto, foi observada apenas na concentração de 1 uM ou superior. Tal como avaliado pelo ensaio de formação de colónia, concentrações superiores a 1 uM foram tóxicos a estas células (dados não mostrados) e, portanto, nós escolhemos uma uM de 9-PCR e o ATRA para estudos subsequentes. Estudos curso de tempo mostraram que realce com ambos os retinóides ocorreu tão cedo quanto 24 h pós-tratamento e atingiu um patamar em 72 h (Figura 1, b). O efeito do 9-PCR e o ATRA no nível de expressão de Cx32 foi comparável à observada com um androgénio sintético, mibolerona (MB), e não foi observado com os ligandos específicos de RAR, 13-PCR e ácido tetrahydrotetramethyl-nepthalenylpropanylbenzoic (TTNPB), ou com 4-hidroxi-phenretinamide (4-HPR) (Figura 1 C). Nós também examinou se 9-CRA e ATRA aumentou o nível de outras proteínas associadas junção celular expressão. Descobrimos que tanto a 9-PCR e o ATRA não teve efeito significativo sobre o nível de proteínas aderentes junção de E-caderina e α- e p-cateninas, proteína no entanto, o nível de expressão associado de junção estanque, ocludina expressão, foi melhorado, em certa medida (Figura 1D). Além disso, 9-PCR e o ATRA não induziu a expressão de Cx32 endógeno em células LNCaP parentais nem alterou o nível de ARNm de Cx32 retroviralmente transcrito expressão em LNCaP-32 células, conforme medido por análise semi-quantitativa por RT-PCR (dados não mostrados).

Cx32-expressam LNCaP-32 as células foram tratadas com o 9-CRA, ATRA, MB e outros retinóides, como indicado. A. Aumento dependente da dose do nível de expressão de Cx32 após 9-PCR e tratamento com ATRA durante 48 h. Note-se que realce significativo é observado apenas em concentrações acima de 0,5 mM. B. Cinética de melhoria do nível de expressão de Cx32 após tratamento com 9-PCR e o ATRA (1 uM) durante os tempos indicados. Note-se que aumento é observado tão cedo quanto 24 h. C. Apenas 9-CRA e ATRA e MB aumentar o nível de expressão de Cx32. Note-se que os retinóides específicos de RAR, TTNPB (ácido tetrahydrotetramethyl-nepthalenylpropanylbenzoic), e 13-PCR (ácido 13-cis-retinóico) e o outro retinóide não relacionado, 4-HPR, são ineficazes. Note-se que MB (2,5 nM) é, pelo menos, 300-500 vezes mais potente do que o 9-PCR e o ATRA na base equimolar. D. Efeito da 9-PCR e o ATRA em aderentes e proteínas de junção associado apertados. Expressão de proteínas associadas adherens junção de E-caderina e a- e p-cateninas, e junção apertado proteína associada, ocludina, foi analisada por análise de transferência de Western de lisado celular total (5 ug). Note-se que apenas a expressão de ocludina parece mudar sensivelmente.

Retinóides Melhorar Gap Assembleia Junction e juncional comunicação

A seguir, examinou o efeito de 9-CRA e ATRA na montagem de Cx32 em GJS e à comunicação juncional. Concomitante com um aumento no nível de Cx32, 9-PCR e o ATRA expressão aumentada de montagem GJ como avaliado imunocitoquimicamente (Figura 2 A) e bioquimicamente por análise de Western blot de total e Triton X (TX) -100 extractos insolúveis em [16], [17], [35] preparado em vários momentos após o tratamento (Figura 2 B). Além disso, como mostrado na Tabela 1, o aumento da montagem GJ foi acompanhada por um aumento paralelo na comunicação por junções tal como medido pela transferência de junção de três GJ traçadores fluorescentes permeável, Amarelo Lúcifer (MW 443), Alexa 488 (PM 570), e Alexa 594 (PM 760). Por exemplo, 9-PCR e o ATRA aumento da transferência de juncional de Alexa 594 (PM 760) 2-3 dobras comparado com os controlos (Tabela 1). Porque a E-caderina foi mostrado para facilitar a montagem de Cxs em GJS [32], [33], e expressão Cx foi mostrado para facilitar a montagem de junções apertadas [29], nós também examinou se 9-CRA e ATRA aumentou o nível de expressão de Cx32 e sua montagem em GJS indiretamente, facilitando a montagem de outras junções celulares avaliada pelo detergente insolubilidade do seu constituinte e proteínas associadas. Descobrimos que tanto 9-CRA e ATRA não teve efeito significativo sobre o nível de adherens junção proteína E-caderina expressão, no entanto, o conjunto de apertados proteína de junção, ocludina, mas não a sua proteína associada ZO-1, parece ter sido reforçada (Figura 2 B). Tomados em conjunto, estes dados sugerem que a 9-PCR e o ATRA, como androgénios, aumentar o nível de Cx32, e a sua subsequente montagem em GJS expressão, sem alterar significativamente a expressão de E-caderina, o que foi mostrado para modular a montagem de GJS , [33] [36] [37] [32],,. Como foi observado em nossos estudos anteriores com andrógenos, a montagem de Cx32 e ocludina em junções celulares, ou vice-versa, parece ser regulada de forma coordenada [17], [29], [38], [39].

A. LNCaP-32 células, cultivadas quer em seis grupos bem ou pratos de 10 cm, foram tratadas com 9-CRA e ATRA por várias vezes. Assembleia da Cx32 (verde) em GJS foi avaliada imunocitoquimicamente. E-caderina é mostrado em vermelho. Note-se que a formação de GJ foi reforçada com 9-CRA e tratamento ATRA e MB. B. Montagem de Cx32 em GJS, de junção associado proteína apertado, ocludina e ZO-1, e a proteína de junção aderente, E-caderina, foi avaliada por ensaio de insolubilidade bioquimicamente TX100 como descrito em Materiais e Métodos. Note-se também que tanto o nível total e a fracção insolúvel em detergente-de Cx32 aumentou significativamente. Note também que o detergente solubilidade de proteínas associadas adherens junção, E-caderina, não é significativamente afetado enquanto que a junção apertado associados proteínas, ocludina, é marginalmente reforçada. Em (A), os núcleos (azul) estão manchadas com DAPI.

Formação Modular Retinóides andrógeno-regulamentado e Degradação da Gap Junções

Nossos estudos anteriores mostraram que Cx32 foi degradada após depleção androgénica por ERAD, e que os andrógenos aumento da formação GJ por re-encaminhamento da piscina ERAD-alvo de Cx32 para a superfície da célula [17]. Solicitado pelos dados apresentados nas Figuras 1 e 2, o próximo examinou o nível de Cx32 e ao seu destino juncional e não-juncional expressão após depleção androgénica na presença e ausência de 9-PCR e ATRA. Para estes estudos, as células foram cultivadas em, meio de cultura celular livre de vermelho de fenol com depleção de androgénio (carvão despojado-). Consistente com estudos anteriores [17], verificou-se que a depleção de androgénio diminuição do nível de expressão de Cx32, o qual foi impedida por adição de MB e DHT (Figura 3 A). No entanto, verificou-se que a diminuição no nível de expressão de Cx32 também foi impedido quando o meio esgotado de androgénios foi reabastecido com 9-PCR e o ATRA (Figura 3 A). Além disso, o tratamento combinado com MB e 9-PCR ou ATRA foi nem nem aditivo sinérgico no que diz respeito ao nível de expressão de Cx32 (Figura 3 A). Para comprovar os dados acima, avaliamos a formação de GJS imunocitoquimicamente (Figura 3 B), bioquimicamente por ensaio insolubilidade detergente (Figura 3 C), e funcionalmente medindo a transferência juncional de Lucifer Yellow (MW 443 Da), Alexa 488 (MW 570 Da), e Alexa 594 (PM 760 Da) (Tabela 2). Tal como mostrado na Figura 3B, a depleção de androgénio reduziu o número de GJS drasticamente como específicas de Cx32 imunocoloração foi raramente observada em áreas de contacto célula-célula, enquanto GJS foram facilmente detectadas nas células quando o meio esgotado de androgénios foi suplementado com 9-PCR e o ATRA e com MB e DHT (Figura 3 B). Consistente com os dados de imunocitoquímica, juncional transferência de Amarelo Lúcifer diminuiu significativamente após a depleção de androgénio, que foi impedida mediante reposição meio depletado de androgénio com MB, ATRA e 9-PCR (Tabela 2). O ensaio de detergente insolubilidade corroborada ainda mais a transferência de dados de imunocitoquímica e juncionais (Figura 3 C). Tal como foi observado nos estudos anteriores, a depleção de androgénios não teve nenhum efeito significativo sobre a solubilidade do detergente de E-caderina e β-catenina e apertado junção proteína associada, ZO-1 (Figura 3 C). Como um controlo, a depleção ou adição de androgénios, 9-PCR e o ATRA para LNCaP parentais-P e células LNCaP-N-resistentes a G418 nem montagem nem GJ induzida teve qualquer efeito sobre a transferência de junção (dados não mostrados). Colectivamente, estes dados sugerem que a 9-PCR e o ATRA evitar a degradação reguladas-androgénio de Cx32 e aumentar a formação de GJ em LNCaP-32 células. Como o tratamento combinado com andrógenos e retinóides não era nem sinérgico nem aditivo, os dados sugerem ainda que a formação de GJ é reforçada por resgatar o mesmo pool de Cx32 que é mirado para ERAD sobre depleção androgénica.

LNCaP-32 células, cultivada a 70% de confluência, quer em seis grupos bem ou pratos de 10 cm, foram mudadas para meio despojado carvão, depleção de androgênio (Strip). O nível de expressão de Cx32 e formação de GJS foram analisados ​​por Western blot (A) e análise imunocitoquímica (B) após 48 h, na presença e ausência de 9-PCR e o ATRA (1 uM) e MB (2,5 nM) e DHT (10 nM). C. Formação de GJS foi também analisada por análise de transferência de Western do total, solúvel em detergente e fracções -insoluble como descrito em Materiais e Métodos. Note-se que Cx32 e GJS são degradados em meio depleção de androgênio e degradação é bloqueado após a reconstituição com 9-CRA, ATRA, MB e DHT. Note também que apenas o nível de Cx32 e sua solubilidade detergente expressão mudou significativamente enquanto a de E-cadhiern (E-cad), β-catenina (β-gato) e ZO-1 não foi significativamente afetada. Em (B), os núcleos (verde) foram corados com DAPI. Em A, 10 mg de proteína total foi analisada.

Retinóides Enhance Gap junção Formação Independente do receptor andrógeno Função

O tratamento de células LNCaP com 9-CRA foi mostrado para melhorar nível de expressão AR [30]. Para testar se 9-PCR e o ATRA expressão aumentada de AR em meio normal e depleção de androgénio, que cresceu LNCaP-32 células em controlo, androgénio-empobrecido, e empobrecido de androgénios e a 9-CRA, ATRA e MB contendo meio durante 48 h. Tal como avaliado por análise de transferência de Western, verificou-se que a depleção de androgénio reduziu tanto a nível de AR e Cx32, o qual foi prevenida mediante reabastecimento com MB, DHT, 9-PCR e o ATRA (Figura 4 A) expressão. Estes dados aumentou a possibilidade de que 9-PCR e o ATRA reforçada montagem GJ em uma maneira dependente da AR – e não independentemente. Para testar esta noção, nós tratamos LNCaP-32 células com Casodex (bicalutamida), que bloqueia a acção dos androgénios por competir com androgénios para a ligação ao AR e função de [40] inibir, [41], e analisou o nível de Cx32 e GJ expressão formação, após tratamento com 9-CRA, ATRA e MB na presença e ausência de bicalutamida em meio normal e empobrecido de androgénios. Consistente com os estudos anteriores, verificou-se que o tratamento com Casodex causou degradação da RA (Figura 4 B), bem como aboliu o efeito de MB e DHT na expressão de Cx32 como foi observado nos nossos estudos anteriores [17]. No entanto, a degradação de AR foi também observada com Casodex na presença de 9-PCR e o ATRA tanto em meio depletado de androgénio e normal. Apesar robustamente diminuindo nível de expressão AR, descobrimos que Casodex não teve efeito sobre 9-CRA- e valorização ATRA mediada por nível de expressão Cx32. Para substanciar que diminuição e aumento da expressão de Cx32 foi acompanhado por alterações paralelas em formação GJ, examinámos a formação de GJS imunocitoquimicamente em células tratadas com Casodx na presença e ausência de MB, 9-PCR e ATRA. GJS não foram formadas quando as células foram tratadas com Casodex em soro normal ou em meio depletado de androgénio contendo MB ou DHT (Figura 5). Por outro lado, verificou-se que eram abundantes GJS quando as células foram tratadas com Casodex juntamente com 9-PCR ou ATRA (Figura 5). Estes dados sugerem que o mecanismo pelo qual 9-PCR e o ATRA evitam a degradação de Cx32 e aumentar a formação de GJ sobre depleção androgénica é independente do nível de expressão do AR e /ou função de, ou ambos.

. LNCaP-32 As células foram cultivadas até 70-80% de confluência em pratos de 6 cm. As células foram transferidos para tirar-carvão, meio empobrecido-androgénio (ST) contendo 9-PCR e o ATRA (1 uM) e MB (2,5 nM) e DHT (10 nM) durante 24 h. As células em meio contendo androgénio (NE) ou meio empobrecido-androgénio (ST) foram utilizados como controlos. O nível de expressão de Cx32 e AR foi analisada por Western blotting. Note-se que tanto o nível de Cx32 e AR expressão diminui após depleção androgénica e a diminuição é bloqueada por tratamento com 9-CRA, ATRA, MB e DHT. B. LNCaP-32, as células semeadas como acima, foram tratados com de 9-PCR e o ATRA (1 uM) e MB (2,5 nM) e DHT (10 nM) na presença e ausência de Casodex (10 fiM) em condições normais e -androgénio empobrecido forma. O nível de expressão de Cx32 e AR foi examinado após a transferência de Western. Note-se que em Casodex contendo meio, o nível de expressão de Cx32 não diminui na presença de 9-PCR e o ATRA (1 uM) em meio despojado com carvão apesar do baixo nível de expressão do AR. Esta não é observado com MB e DHT.

LNCaP-32 células, semeadas em seis grupos poços contendo lamelas de vidro, foram autorizados a crescer até 70% de confluência. As células foram então cultivadas durante mais 24 h em meio normal (NS), em despojado com carvão, meio empobrecido-andrógeno sozinho (ST), em soro normal contendo Casodex (NS + CDX), e em meio depletado de androgénio suplementado com MB ( ST + MB), com MB e Casodex (ST + MB + CDX), com 9-CRA (ST + CRA), 9-CRA e CDX (ST + CRA + CDX), com ATRA (ST + ATRA), e com ATRA e CDX (ST + ATRA + CDX). Degradação e localização subcelular de Cx32 foram analisados ​​imunocitoquimicamente como descrito em Materiais e Métodos. Note-se que GJS (verde) não são degradados em células tratadas com 9-PCR e o ATRA ambos na presença e ausência de Casodex Considerando que eles são degradados em condições normais e soro mas suplementado MB meio contendo Casodex empobrecido-androgénio.

10.