Abstract

Fundo

epidérmico inibidores da quinase do receptor tirosina-fator de crescimento (EGFR-TKI) e linfoma anaplásico quinase (ALK) inibidores mudaram drasticamente a estratégia de tratamento médico de câncer de pulmão. Os doentes devem ser pesquisados ​​quanto à presença da mutação de EGFR ou Echinoderm microtubule-associated protein-4 como

(EML4

) –

ALK

gene de fusão antes da quimioterapia para prever a resposta clínica. A cultura incorporado teste de sensibilidade às drogas inibição succinato desidrogenase (SDI) do teste e gel de colágeno gota (CD-DST) são estabelecidos

in vitro

testes de sensibilidade aos fármacos, que podem prever a sensibilidade de pacientes para citotóxica drogas anticâncer. Nós aplicamos

in vitro

testes de sensibilidade de drogas para a previsão Cyclopedic de respostas clínicas para diferentes drogas que alvejam moleculares.

Métodos

O crescimento foram confirmados efeitos inibitórios de erlotinib e crizotinib de pulmão linhas celulares de cancro usando SDI e CD-DST. A sensibilidade de 35 casos de câncer de pulmão cirurgicamente ressecado ao erlotinib foi examinada usando SDI ou CD-DST, e em comparação com o estado de mutação EGFR

Resultados

HCC827 (Exon19: E746-A750 del). e as células (

EML4-ALK) H3122 foram inibidos por concentrações mais baixas de erlotinib e crizotinib, respectivamente, que A549, células H460 e H1975 (L858R + T790M) foram. A viabilidade do cancro do pulmão cirurgicamente ressecados foi de 60,0 ± 9,8 e 86,8 ± 13,9% no EGFR mutantes versus tipos selvagens na SDI (p = 0,0003). A viabilidade celular foi de 33,5 ± 21,2 e 79,0 ± 18,6% em mutantes EGFR vs. casos do tipo selvagem (p = 0,026) em CD-DST.

Conclusões

In vitro

sensibilidade droga avaliada por qualquer SDI ou CD-DST correlacionados com o status do gene EGFR. Portanto, SDI e CD-DST podem ser preditores úteis de respostas clínicas potenciais para as drogas anticâncer moleculares, cyclopedically

Citation:. Miyazaki R, Anayama T, Hirohashi K, Okada H, Kume M, Orihashi K (2016 )

In Vitro

drogas Testes de Sensibilidade para prever respostas Molecular alvo da droga no ressecado cirurgicamente o câncer pulmonar. PLoS ONE 11 (4): e0152665. doi: 10.1371 /journal.pone.0152665

editor: Yiqun G. Shellman, University of Colorado, Faculdade de Medicina, United States |

Recebido: 03 de novembro de 2015; Aceito: 17 de março de 2016; Publicação: 12 de abril de 2016

Direitos de autor: © 2016 Miyazaki et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. Nosso apoio arquivo de informações contém o conjunto de dados mínimo anónimos necessária para replicar nossos resultados do estudo

Financiamento:. o estudo foi totalmente financiado pelo fundo oficial ilimitado fornecido por Kochi Medical School, Universidade de Kochi, Japão, http: //www.kochi -ms.ac.jp/

Conflito de interesses:.. os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o cancro do pulmão é a principal causa de câncer relacionados com o mortalidade em muitos países desenvolvidos, enquanto adenocarcinoma representa 70% dos casos de cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC). Em pacientes japoneses, aproximadamente 50 e 5% de adenocarcinomas tem uma mutação no receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR) [1] e Echinoderm quinase de linfoma anaplásico-4-proteína como associada a microtúbulos (

EML4-ALK

) gene de fusão, respectivamente. Molecular drogas alvo anticancerígenos tais como inibidores de EGFR-tirosina quinase (TKI) e inibidores da ALK mudaram drasticamente a estratégia de tratamento clínico de câncer.

A maioria dos cancros do pulmão mutação positiva do EGFR são sensíveis ao EGFR-TKI, que contribuem de aumentar a sobrevida livre de progressão (PFS) e sobrevida global (oS) de pacientes [1-4]. No entanto, EGFR casos de mutação-positivos nem sempre apresentam boas respostas clínicas para a terapia EGFR TKI. Aproximadamente 30% dos casos de mutação do EGFR são resistentes a EGFR-TKI [3, 4]. A mutação do homólogo do oncogene viral do sarcoma de Kirsten rato (K-ras) e cinase de serina /treonina-proteína B-Raf (Raf-B) ou segundas mutações tais como T790M são conhecidos correlacionar-se com a resistência ao EGFR-TKI. [5] por outro lado, cerca de 10% dos casos EGFR de tipo selvagem exibem as respostas clínicas em [4] de EGFR-TKI. Além disso, EGFR-TKI também são eficazes em casos de carcinoma de células escamosas, que normalmente não mostram a mutação do gene EGFR [6]. Portanto, há algumas populações de respondedores EGFR-TKI que não estão selecionados para mutações EGFR.

EML4-ALK

câncer de pulmão -positivo é um tumor pulmonar maligno primário constituído por células que com um configuração característica anormal do ADN onde o

gene EML4

é fundida com o linfoma anaplásico quinase (

ALK

) gene.

ALK

-inhibitors (crizotinib ou alectinib) estão atualmente disponíveis para uso clínico. É comum para confirmar a presença de

EML4-ALK

usando uma hibridação in situ fluorescente (FISH), mas a análise de alta sensibilidade da imunocoloração foi alternativamente utilizados para o rastreio de

EML4-ALK

. No entanto, FISH e imunocoloração não necessariamente se relacionam com a taxa de resposta clínica à

ALK

inibidores na prática [7-9]. O desenvolvimento de drogas-alvo moleculares para novas mutações motorista deve ser obrigada a incluir investigar da mutação do gene responsável. Não há atualmente nenhum método estabelecido para prever de forma abrangente o efeito de agentes de direccionamento moleculares que atuam em diferentes pontos das várias vias de sinalização.

Existem em testes de sensibilidade droga anticâncer in vitro, tais como a inibição succinato desidrogenase teste (SDI) , método de ensaio de resposta à droga histocultura (HDRA), e da cultura incorporado teste de sensibilidade às drogas gota de gel de colágeno (CD-DST). Curiosamente, a quimioterapia fim-empregada com fármacos anti-cancerígenos, que foram preditas tão eficaz, na verdade, exibiram respostas clínicas mais elevadas do que a quimioterapia convencional fez [10-12]. Além disso, existe um relatório que sugere que o ensaio in vitro de sensibilidade aos fármacos pode ser útil na previsão do efeito da quimioterapia adjuvante em NSCLC. [13] No entanto, não houve nenhum relatório anterior sobre a aplicação clínica de ensaios in vitro de sensibilidade aos fármacos para o predição dos efeitos potenciais de EGFR-TKI ou

ALK

inibidores em ressecado cirurgicamente amostras de tecido de câncer de pulmão frescos. O objetivo do presente estudo foi desenvolver um teste de sensibilidade às drogas in vitro cultura de base para prever a sensibilidade de câncer de pulmão cirurgicamente ressecado a múltiplas drogas-alvo moleculares.

Materiais e Métodos

A. A verificação do efeito inibidor de drogas alvo molecular na linha celular de cancro do pulmão

As doses óptimas de erlotinib e crizotinibe (Funakoshi Co. Ltd., Tóquio, Japão) usado em ambos o 3- (4,5-dimetiltiazol-2 -il) -5- (3-carboximetoxifenil) -2- (4-sulfofenil) -2H-tetrazólio (MTS) e ensaio de CD-DST foram tituladas utilizando as seguintes linhas celulares de cancro do pulmão humano imortalizadas: HCC827 (adenocarcinoma, a mutação do EGFR sobre Exon19, exclusão E746-A750), H1975 (adenocarcinoma, EGFR mutação, Exon 21 L858R + T790M), H3122 (adenocarcinoma,

EML4-ALK

gene de fusão), A549 (adenocarcinoma), e H460 carcinoma de células (grande ). A549, H460, H1975 HCC827 e foram obtidos de American Type Culture Collection (Manassas, Virginia, EUA). H3122 foi gentilmente cedido pelo Dr. Pasi A. Janne, da Harvard Medical School (Boston, MA, EUA).

A- (1) ensaio MTS em linhas celulares de cancro de pulmão humano.

A as células cancerosas foram transferidas para placas de 96 poços de cultura de fundo plano a uma densidade de 4,0 x 10

4-6,0 x 10

4 células /cavidade com concentrações crescentes de erlotinib (0,002, 0,02, 0,2, 2,0, e 20 uM) e crizotinibe (0,006, 0,06, 0,6, e 3 | iM), e incubou-se a 37 ° C durante 72 h expostos a 5% de CO

2. Após a adição de 20 ul de Cell Titer (Promega Corporation, Madison, WI, EUA) para o meio de cultura, as células cancerosas foram incubadas durante 90 min e a absorvância foi medida a 490 nm.

A- (2) a análise de imunotransferência.

a análise de imunotransferência foi realizada como previamente descrito [14, 15] As células foram lavadas com PBS, colhidas e lisadas em tampão RIPA (Nacalai Tesque Inc., Quioto, Japão) com fosfatase Inhibitor Cocktail (Nacalai inc Tesque., Kyoto, Japão). Para a análise de Western blot, 30 ug de extractos totais foram suspensos em 20 ul de tampão de amostra de solução com 2-ME para SDS-PAGE (Nacalai Tesque Inc., Quioto, Japão), foram resolvidas por electroforese em géis desnaturantes de poliacrilamida, transferd para nitrocelulose. As membranas foram bloqueadas com Bloqueio Um ou Bloqueio Um-P (Nacalai Tesque Inc., Quioto, Japão), e sondadas com anticorpos monoclonais de coelho para ALK fosforilada humana (Y1604), a ALK, o receptor de EGF fosforilado (Y1068), e a o receptor de EGF (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, EUA). Em seguida, as membranas foram incubadas em anticorpo secundário anti-coelho (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, Texas, EUA). Cada banda foi verificada pelo LAS -4000.mini (FUJIFILM, Tóquio, Japão).

A- (3) CD-DST em linhas celulares de cancro de pulmão humano.

O CD-DST foi realizada de acordo com um método previamente relatada [16]. Resumidamente, as linhas celulares de cancro foram tratadas com uma solução de enzima dispersão celular (EZ, Nitta Gelatin Inc., Osaka, Japão) durante 2 h. Então, apenas as células viáveis ​​que aderiram ao gel de colagénio foram recolhidas e suspensas em solução reconstruída do tipo I de colagénio (Tipo Cellmatrix CD, Nitta Gelatin Inc., Osaka, Japão) a uma densidade final de 1 × 10

5 células /mL. Três gotas da mistura de células-colagénio (30 uL /​​gota) foram colocadas em cada poço de uma multiplaca de 6 poços numa placa de 60 mm, e deixou-se em gel a 37 ° C numa incubadora de CO2 durante 1 h. A concentração final foi de cerca de 3 × 10 gota de gel

3 células /colágeno. O meio de cultura foi revestida em cada poço e a placa foi incubada num CO

2 incubadora a 37 ° C durante a noite. Três gotas de colagénio foram colocados no fundo de placas de 6 poços para permitir a cultura em um ambiente tridimensional (3-D), e foram incubadas durante 7 dias em meio isento de soro na presença das mesmas gamas de concentração de erlotinib e crizotinibe usado no ensaio de MTS. Em seguida, as células foram fixadas com 10% de formalina tamponada com (Nacalai Tesque Inc., Quioto, Japão), e coradas com vermelho neutro (Kurabo, Osaka, Japão). Imagens das células fixas foram capturados usando a fotografia microscópio. As imagens, incluindo tanto as células cancerosas (profundamente manchada) e fibroblastos (ligeiramente manchada) coradas com vermelho neutro foram adquiridas, os fibroblastos foram seleccionados e eliminados como as células fusiformes uniformizados com pequenas dimensões núcleos, então o número de células cancerosas viáveis ​​foi quantificado utilizando um software dedicado (Primege, versão 1.01, Nitta Gelatin Inc., Osaka, Japão) [17, 18]. A viabilidade das células tratadas ou erlotinib-Crizotinibe foi comparada com a das células de controlo não tratadas.

B. estudo clínico usando cirurgicamente ressecado amostras de tecido de câncer de pulmão fresco

Este estudo foi aprovado pela comissão de ética do Hospital Medical School Kochi (Revisão Ética Número de aprovação: ERB-100.866), e foi conduzido a partir de junho de 2013 a agosto 2014 . as todos os participantes desde que o seu consentimento informado por escrito para participar neste estudo de acordo com o processo de aprovação. Trinta e cinco pacientes com NSCLC cirurgicamente ressecável (SDI e CD-DST, n = 23 e 12, respectivamente) foram incluídos no estudo clínico. Após a ressecção cirúrgica, uma parte de amostras de tecido de câncer frescos, verificado células tumorais por citologia toque esfregaço, foram obtidos para os testes in vitro de sensibilidade às drogas, conforme descrito nas seções a seguir.

B- (1) previsão SDI de a sensibilidade ao erlotinib para espécime de tecido de cancro de pulmão clínicos.

o SDI é o protocolo baseado no ensaio de MTS para a maior parte da amostra de tecido fresco, incluindo tanto as células cancerosas e células não cancerosas, [19, 20]. Em resumo, os espécimes cirúrgicos frescas em cubos (10 ml: 1 ml) foram cortados em fragmentos de uma pasta, tratada com uma enzima de dispersão de células a 37 ° C durante 2-3 h, centrifugou-se, e, em seguida, o sobrenadante foi removido. células de cancro do pulmão viáveis ​​foram então transferidas para placas de 96 poços a uma densidade de 1,0 x 10

6 células /poço e incubadas em meio modificado por Dulbecco de Eagle (DMEM) contendo soro fetal de bovino (FBS) a 37 ° C com 5% CO

2 durante 72 h. As células foram expostas ao mesmo intervalo de concentração de erlotinib utilizado no ensaio MTS. Em seguida, 20 uL do título de células foi adicionado a cada poço, e as placas foram incubadas durante 150 minutos, seguido por medição da absorvância a 490 nm para quantificar a viabilidade celular.

B- (2) CD-DST predição da sensibilidade ao erlotinib para espécime de tecido de cancro de pulmão clínicos

espécimes de tecido fresco em cubos (3 mililitro: 27μL). obtidas a partir do tecido excisado cirurgicamente o cancro do pulmão foi picada finamente usando um bisturi e digerido em uma enzima dispersão celular solução de (EZ, Nitta Gelatin Inc., Osaka, Japão) durante 2 h. As células dispersas foram lavadas duas vezes, colhidas por centrifugação a 2400 rpm durante 3 min, filtrada através de um nylon de 80 mícrons mesh para obter mais do que 1,0 x 10

5, as células que foram incubadas num frasco revestido de gel de colagénio (CG balão, Nitta Gelatin Inc., Osaka, Japão) numa CO

2 incubadora a 37 ° C durante 24 h. As células recuperadas foram então fechado em uma gota de colagénio para ser cultivadas num ambiente 3D. células de cancro do pulmão viáveis ​​foram então incubados com 0,2 uM de erlotinib (dose óptima foi determinada em A- (2)) durante 7 dias. Meios de cultura preparados (PCM) 2 foi utilizada no protocolo padrão para CD-DST. No entanto, os resultados significativos não foram obtidos utilizando o método anterior de teste [21] e, portanto, PCM4 (Kurabo, Oosaka, Japão), um meio de crescimento da cultura reduziu-fator foi utilizada no estudo atual.

B- (3)

EGFR

análise de mutação genética.

Nós selecionados para a mutação EGFR utilizando o péptido de ácido nucleico de reação em cadeia da polimerase locked-ácido (PNA-LNA PCR) método de fixação nucleico [22, 23] . O estado de mutação do gene detalhada de cada amostra foi confirmado usando o método de sequenciação directa. mutações de EGFR em ADN extraído foram examinadas usando o sequenciamento directo baseado em PCR para os exões 19 e 21. A sequenciação foi realizada utilizando o método de terminador de corante de sequenciação cíclica PRISM da Applied Biosystems (Perkin-Elmer Corp., Foster City, CA, EUA) com ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA).

C. A análise estatística

Descrevemos a curva de dose-resposta das drogas dirigidas moleculares para linhas celulares de cancro de pulmão. A correlação entre as mutações genéticas somáticas de

EGFR

nas células cancerosas e sensibilidade droga para erlotinib foram comparados. Os pacientes foram divididos em dois grupos: do tipo selvagem e mutantes de EGFR grupos. Os resultados do teste de sensibilidade ao fármaco de ambos os grupos foram comparados estatisticamente utilizando o teste U de Mann-Whitney. Nós refered estatisticamente significativa em p 0,05. O ideal cortado valor da viabilidade celular designada para prever as células cancerígenas sensíveis a elrotinib foi determinada utilizando uma curva receiver operating characteristic (ROC). Curvas ROC dose-resposta e foram construídos utilizando o GraphPad Prism versão 6.0 para Windows (GraphPad Software, San Diego, CA, EUA).

Resultados

A. Efeito inibidor dos fãrmacos alvo molecular na linha celular de cancro do pulmão

A- (1) ensaio de MTS em linhas celulares de cancro de pulmão.

A viabilidade das linhas celulares de cancro de pulmão a seguir à exposição a 2,0 uM de erlotinib durante 3 dias foi de 98,9 ± 9,3, 99,4 ± 10,7, 85,7 ± 10,7, e 31,9 ± 1,6 (%) para H460, A549, H1975, e HCC827, respectivamente. O crescimento da HCC827 (com

EGFR

mutação, del E746_A750), mas não a dos outros linhas de células sem a mutação ou com a linha de células de 2

nd mutação resistente (T790M) foi inibida significativamente após a exposição ao erlotinib (p = 0,030, Fig 1-a). Do mesmo modo, a viabilidade das linhas de células após exposição a 0,60 uM de crizotinibe durante 3 dias foi 103,2 ± 5,67, 8,05 ± 96,9, e 35,8 ± 3,24% para H460, A549, H3122 e, respectivamente. H3122 (com

EML4-ALK

gene de fusão) exibiram inibição do crescimento significativo após a exposição a Crizotinibe (Fig 1-b)

(a) A exposição ao erlotinib no ensaio MTS:. HCC827 (exão EGFR 19 supressão) exibiram inibição do crescimento significativo, enquanto A549 e H460 (wild EGFR) ou H1975 (EGFR resistência T790M segunda mutação) não foram sensíveis ao elrotinib. (B) A exposição à Crizotinibe no ensaio MTS: H3122 (

EML4-ALK

fusão) exibiram inibição do crescimento significativo, enquanto outras células cancerosas sem um gene de fusão não foram sensíveis ao Crizotinibe. (C) Expressão da proteína de EGFR e a inibição de fosforilação por erlotinib em linhas de células NSCLC na análise de Western Blot: erlotinib inibiu a fosforilação do EGFR (pEGFR) em HCC827, mas não inibiu-o em H1975. (D) A expressão de LFA e a inibição de fosforilação por crizotinibe em linhas de células NSCLC na análise de Western Blot: H3122 expressa ALK e Crizotinibe fosforilação inibida de ALK (Palk). (E) Exposição ao erlotinib em CD-DST. (F) A exposição a Crizotinibe em CD-DST. Em comparação com o ensaio de MTS, CD-DST necessárias doses mais baixas de erlotinib para expor diferença significativa no crescimento entre linhas celulares.

EGFR

, gene do receptor do factor de crescimento epidérmico;

EML4-ALK

, gene da proteína-like associada a microtúbulos echinoderm 4-anaplásico linfoma quinase.

A- (2) Análise de imunotransferência.

Foram examinados EGFR e ALK expressão nas células tumorais e o efeito de erlotinib e crizotinibe sobre a fosforilação do EGFR e ALK por Western blotting. Todas as linhas celulares expressavam o EGFR. A fosforilação do EGFR foi suprimida por erlotinib em HCC827. Por outro lado, erlotinib não suprimiu a fosforilação do EGFR em células H1975 (Figura 1-C). células H3122 expressa ALK, e a fosforilação ALK foi suprimida pelo crizotinib (Fig 1-d).

A- (3) CD-DST em linhas celulares de cancro de pulmão humano.

A viabilidade celular de cada linha celular de cancro do pulmão após exposição a 0,2 uM de erlotinib durante 7 dias foi de 87,1 ± 0,56, 72,2 ± 5,20, 55,8 ± 8,1, e 0,63 ± 0,19% para H460, A549, H1975, e HCC827 linhas de células, respectivamente (n = 3 cada). A linha celular HCC827 mostrou inibição significativa do crescimento após a exposição ao erlotinib (p = 0,028). Por outro lado, não se observou qualquer efeito inibidor do crescimento em linhas de células do tipo selvagem EGFR com exposição a 0,2 uM erlotinib (figura 1-E). A viabilidade de cada linha celular de cancro do pulmão após exposição a 0,6 uM crizotinibe durante 7 dias foi de 93,7 ± 3,13, 75,5 ± 7,43 e 20,1 ± 2,13% para H460, A549, e linhas de células H3122, respectivamente (n = 3 cada), e H3122 mostrou inibição significativa do crescimento de células após exposição a crizotinibe (Figura 1-f).

B. Estudo clínico

total de trinta e cinco (SDI: 23, CD-DST: 12) pacientes foram incluídos neste estudo (Tabela 1). Quatro dos 24 casos (16,7%) em homens e sete dos 11 casos (63,6%) em mulheres expressaram mutação EGFR. Por subtipo histológico, 8 de 11 casos (72,7%) de adenocarcinoma papilar, 3 dos 4 casos (75%) de BAC; carcnoma bronquíolo-alveolar expressos, e um dos 7 casos (14,3%) de adenocarcinoma acinar expressa mutação EGFR.

B- (1) SDI para amostra clínica.

Avaliação o efeito inibidor do crescimento de erlotinib pelo método SDI revelou que a viabilidade das células do câncer foi reduzido de concentração-dependente no

EGFR

casos de mutação-positiva, mas dificilmente nos

EGFR

casos -negative mesmo em alta concentração de até 20 mM (dados não mostrados). Além disso, após a exposição a erlotinib 20 uM, a viabilidade de

EGFR

casos de tipo selvagem foi de 86,3 ± 11,2%, enquanto que um dos mutantes foi significativamente inferior em 60,0 ± 9,8% (p = 0,0004, Figura 2- a).

mapa de distribuição da viabilidade celular avaliada em cirurgicamente ressecada tecido câncer de pulmão fresco usando (a) SDI após a exposição ao erlotinib 20 mM, com um caso sem

EGFR

mutação suprimida por 20 mM erlotinib e (b) CD-DST após exposição a 0,2 uM de erlotinib. A significância estatística observada na viabilidade celular entre dois grupos de

EGFR

mutação-positiva e de tipo selvagem (p = 0,026).

B- (2) CD-DST para amostra clínica.

Após a exposição ao erlotinib 0,2 mM, a viabilidade das

mutantes e selvagens-tipos EGFR

foi 33,5 ± 21,2 e 79,0 ± 18,6%, respectivamente, e houve uma diferença significativa na célula viabilidade (p = 0,026, Fig 2-b). Os resultados representativos CD-DST de ambos

EGFR

casos mutantes e de tipo selvagem são ilustrados na figura 3. Os dados do estado da mutação EGFR e viabilidade celular de cada pacientes clínicos foram mostrados em S1 Table.

resultados CD-DST de dois casos representativos, com as células cancerosas em cada gota cultivadas com ou sem 0,2 M de erlotinib durante 7 dias. Linha superior mostra fotografias de gotas de gel de colágeno contendo células cancerosas, linha do meio mostra gotas digitalizado utilizando sistema de digitalização de imagem dedicado, e linha inferior mostra gotas com fibroblastos eliminados manchadas mais fraco do que o ponto de corte. Caso com o exão 19 del em

EGFR

(deixou duas colunas) mostra o número de células cancerosas foram reduzidos para 32,0% do controlo não tratado quando expostas a 0,2 mM erlotinib. Paciente com

EGFR

caso do tipo selvagem (direita duas colunas) apresentaram crescimento de 88,4% em relação ao controle.

A curva ROC foi construída para determinar o valor de corte para predizer a presença de

EGFR

mutações a partir da taxa de inibição de crescimento dos testes in vitro de sensibilidade às drogas [24]. No teste de SDI, a área sob a curva (AUC) para a viabilidade celular foi de 0,958 (Figura 4-A). A proporção mostrou a melhor combinação de sensibilidade e especificidade para a predição de sensibilidade às drogas em valores 72,7% (93,3 e 100% de sensibilidade e de especificidade, respectivamente). No CD-DST, a curva ROC mostrou que a AUC foi de 0,963 para a viabilidade celular (figura 4-b), enquanto a melhor combinação de sensibilidade e especificidade para a predição de sensibilidade ao fármaco foi em 55,9% (sensibilidade 88,9 e 100% e especificidade, respectivamente ).

(a) curvas ROC para a viabilidade celular avaliada usando SDI em predizer

EFGR

mutação mostrando AUC de 0,958. (B) curvas ROC para a viabilidade celular avaliada usando colágeno gel gota cultura incorporado teste de sensibilidade às drogas (CD-DST) em predizer

EGFR

mutação. AUC foi 0,963.

Em perspectiva, dois pacientes com a mutação EGFR tem doença recorrente após o estudo atual. As viabilidades celulares das células cancerígenas derivadas destes pacientes foram 55,6% e 31,4% com a exposição de erlotinib em CD-DST. O erlotinib exibiu excelentes respostas clínicas para estes pacientes. O paciente teve um dos linfonodos metastáticos alargada. Após 8 meses de tratamento erlotinib, o linfonodo metastático encolheu de 10,5 mm para 3,2 milímetros e SUV (valor de absorção padronizado) de 18F-FDG (18F-fluorodeoxyglucose) reduziu 4,44-0,69. O efeito foi considerado como CR (resposta completa) radiologicamente (Figura 5-A). O outro paciente teve a disseminação pleural com a elevação da CEA (Antígeno carcinoembrionário); um dos marcadores tumorais sorológicos de câncer de pulmão. Como um resultado do tratamento erlotinib, o nível de CEA reduzida 146,0-25,6 (ng /ml) (Fig 5-b). O efeito das drogas que alvejam molecular para pacientes com sensibilidade positivo em testes in vitro drugsensitivity e alterlation gene negativo é para ser revelado.

(a) Caso # 1 tinha exibido 55,6% do crescimento de células cancerosas com a exposição erlotinib em CD-DST. O câncer se espalhou para o linfonodo medianstinal (setas amarelas). Após o tratamento erlotinib, o linfonodo mediastinal encolheu de 10,5 mm para 3,2 mm de tamanho, e SUV da FDG diminuiu 4,4-0,69. (B) Caso # 2 tinha exibido 31,4% do crescimento de células cancerosas com a exposição erlotinib em CD-DST, o paciente causou a disseminação pleural com alto nível de CEA. erlotinib resultou na redução de CEA 146,0-25,6 (ng /ml). 18F-FDG: 18F-fluorodeoxyglucose. PET: tomografia por emissão de positoron. SUV: valor de absorção padronizado. CEA:. Antígeno Carciono-emboryonic

Discussão

No estudo atual, primeiro confirmou que erlotinib e Crizotinibe inibição do crescimento dependente da dose exibido de células de câncer de pulmão cultivadas. O efeito inibitório do erlotinib foi mais forte em câncer de pulmão de células-linhas com

EGFR

mutação do que era naqueles sem a mutação. Da mesma forma, o crizotinibe mostraram inibição mais forte de linhas celulares de cancro do pulmão com um gene de fusão recorrente entre

EML4

e

ALK

do que em aqueles sem o gene de fusão. Em segundo lugar, foi demonstrado que o efeito inibidor do crescimento de erlotinib avaliado através do SDI ou CD-DST foi significativamente correlacionado com o

EGFR

estado de mutação no estudo clínico usando as amostras de tecido de cancro do pulmão cirurgicamente ressecado. Cultura celular baseada em testes de sensibilidade a drogas in vitro podem ser capazes de prever a sensibilidade de células de cancro para várias drogas alvo molecular em desenvolvimento para uma futura aplicação clínica.

SDI realizados em amostras clínicas revelaram uma inibição do crescimento em doentes com

EGFR

mutação. No entanto, o SDI necessárias concentrações mais elevadas de erlotinib para inibição da proliferação celular que são geralmente obtidos no sangue após a administração de doses orais padrão [25]. Além disso, a SDI necessários mais de seis conjuntos de 1.0 × 10

6 células, enquanto CD-DST precisou de menos de 1,0 × 10

5 células para realizar os exames. Com menor quantidade de exigência de tecido, CD-DST praticamente não afeta o exame patológico.

No CD-DST, erlotinib mostrou efeito inibidor do crescimento com uma concentração inferior à de ensaio MTS. o crescimento celular foi HCC827 quase completamente suprimida pela exposição a 0,01 uM enquanto que erlotinib de exposição H460, A549 e células H1975 foi suprimido ligeiramente abaixo para 0,2 ^ M, após o que se aumentou a concentração forma-dependente. Estes resultados sugerem que a DC-DST detectada a diferença nos efeitos inibidores do crescimento em todos os casos a concentração de erlotinib tão baixo como 0,2 uM, a qual é menor do que as concentrações de soro de doentes que foram administradas regularmente 150 mg de erlotinib diariamente [25].

um resultado controverso foi relatado 0,35 mM de gefitinib não conseguiu inibir o crescimento do tumor em pacientes que são mutação-positiva em um estudo anterior que investigou a correlação de

EGFR

mutação e sensibilidade de drogas usando o CD- DST [21]. O nosso estudo foi utilizado o meio isento de soro PCM4 cultura com factores de crescimento em vez de redução da PCM2 convencional, talvez esta a razão pela qual o nosso resultado exibem a mutação do EGFR correlação com a sua sensibilidade com sucesso. Mas a composição do PCM4 não é liberado por causa da patente protegida.

O ensaio de resposta à droga histocultura (HDRA), é outro teste de sensibilidade às drogas que usa um gel de colágeno tridimensional, e a curva dose-resposta de gefitinib para câncer de pulmão foi relatada utilizando este método. Contudo, o inquérito não incluiu correlacionar o

EGFR

mutação e efeitos do gefitinib [26].

No futuro, novas anormalidades moleculares pode tornar-se evidente, juntamente com o desenvolvimento esperado de molecular relevante alvo drogas para o seu tratamento. Por conseguinte, existe uma necessidade urgente de desenvolver métodos que podem prever simultaneamente as respostas clínicas de cada medicamento alvo molecular a um custo razoável. Recentes avanços em técnicas de pesquisa genética permitiram a comunicação de sistemas abrangentes de genes perfil de expressão [27, 28]. No entanto, estes sistemas ainda são incomuns. Além disso, para a predição de sensibilidade aos inibidores da ALK,

EML4-ALK

devem ser detectados por FISH ou IHC em vez de análise do gene de mutação [29, 30]. É complicado de realizar os vários tipos de vigilância necessário para detectar as alterações do gene. Cell-cultura baseada em ensaios in vitro de crescimento tem vantagem porque eles examinam drogas em simultâneo. O CD-DST, em particular, tem a vantagem de ser minimizando o volume de tecido de cancro (em cubos 3mm) na avaliação da amostra de tecido clínica, em comparação com o SDI (10 milímetro cúbico)

As limitações do estudo:. Neste estudo, demonstramos que a sensibilidade in vitro droga foi significativamente correlacionada com a

EGFR

estado de mutação. No entanto, ambos

EGFR

análise de mutação e em testes de sensibilidade a drogas in vitro são os possíveis fatores preditores de resposta clínica a terapia de EGFR-TKI. Portanto, a validade dos fatores preditores deve finalmente ser avaliada por investigar a sua correlação com respostas clínicas, o que requer esclarecimento em futuras investigações relacionadas com o prognóstico.

Informações de Apoio

Tabela S1. Características dos pacientes clínicos

doi: 10.1371. /Journal.pone.0152665.s001

(PDF)

Agradecimentos

Os autores agradecem Prof. Kazuhiko Nakagawa do Departamento de Oncologia médica, Kinki Universidade Faculdade de Medicina Osaka-Sayama, Japão e Dr. Isamu Okamoto do Instituto de Pesquisa de Doenças do Peito, Escola de graduação de Ciências médicas da Universidade Kyushu, Fukuoka, Japão para gentilmente fornecer as linhas celulares de cancro do pulmão. Os autores também reconhecem o Sr. Takehiro Tatenuma, Ms. Mai Taguchi, e Ms. Yoko Asakura para a sua assistência técnica em testes de sensibilidade a drogas in vitro.