Abstract

O ácido úsnico composto líquen (UA) é um ácido fraco lipofílico que atua como um serviço de transporte de prótons e provoca a perda do potencial de membrana mitocondrial interna. No presente estudo mostramos que o tratamento UA induzida a formação de autofagossomas em células de cancro humanas, mas teve efeitos mínimos sobre fibroblastos humanos normais. No entanto, o fluxo autofágica estava incompleta, a degradação do conteúdo autophagosomal não ocorreu ea acidificação estava com defeito. células tratadas com UA mostraram níveis reduzidos e ativação da AMP quinase ATP, bem como sinais de estresse celular. UA é, portanto, susceptível de desencadear a formação autophagosome tanto pelas condições de depleção de energia e de stress. Nossos resultados indicam que o H

+ – efeito da UA vaivém opera não só nas mitocôndrias como previamente mostrado, mas também nos lisossomos, e têm implicações para a manipulação terapêutica de autofagia e distribuição de drogas determinou-pH

. citação: Bessadottir M, Egilsson M, Einarsdottir E, Magnusdottir IH, Ogmundsdottir MH, Ómarsdóttir S, et al. (2012) Proton-SHUTTLING Lichen composto de ácido úsnico afeta mitocondrial e lisossomal função em células cancerosas. PLoS ONE 7 (12): e51296. doi: 10.1371 /journal.pone.0051296

editor: Gabriele Multhoff, Technische Universitaet Muenchen, Alemanha |

Recebido: 18 de junho de 2012; Aceito: 31 de outubro de 2012; Publicação: 05 de dezembro de 2012

Direitos de autor: © 2012 Bessadottir et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Fundo de Doutorado Eimskip e da Universidade do Fundo de Investigação Islândia (www.hi.is). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

os líquenes, a simbiose entre um parceiro de fungos e um microorganismo photobiotic, são encontrados em todo o mundo e dão origem a um grande número de metabólitos secundários únicos [1]. O derivado de dibenzofurano, ácido úsnico (UA) é um metabolito secundário conhecido e tem sido estudada em certa medida [2]. Uma vasta gama de actividades biológicas tem sido relatado para o ácido úsnico, v.g. anti-microbiano, anti-virais, anti-piréticos, efeitos anti-inflamatórios e analgésicos [2]. A actividade anti-tumoral de AI foi relatada pela primeira vez há três décadas no carcinoma do pulmão em ratos e em leucemia P388 [3], [4]. Foi além disso mostrado que o ácido úsnico tem efeitos anti-mitóticos em linhas celulares de cancro humano [5] e faz com que a perda de células viáveis ​​em células de leucemia, cancro do pulmão e da mama [6], [7]. No entanto, a exposição a UA não activar p53 e não tem sido proposto para ser envolvida em danos no ADN [8].

UA é um ácido fraco lipofílico (p

K of a 4.4) que pode provocar a fuga de protões por difusão através das membranas mitocondriais [9]. Em células de fígado de murganho ácido úsnico perturba os processos metabólicos normais de células por desacoplamento da fosforilação oxidativa em mitocôndrias e ativando o stress oxidativo [10]. As mitocôndrias desempenham um papel importante na regulação dos percursos de morte celular e alterações mitocondriais foram descritos em células de cancro, incluindo o aumento da estabilidade, inibindo assim a libertação de citocromo

C

e que impede a induo da apoptose [11]. O nosso estudo anterior demonstrou que o tratamento UA provoca a perda de potencial de membrana mitocondrial nas duas linhas de células de cancro diferentes [12]. Curiosamente, tem sido demonstrado que as alterações no potencial de membrana mitocondrial pode levar ao aparecimento de autofagia [13].

Autophagy é um processo que pode tanto a sobrevivência das células do cancro auxílio durante a escassez de nutrientes, mas também pode promover a morte de células de cancro . As vias moleculares que determinam essa dupla função permanecem obscuros e é provável que a função da autofagia no câncer depende de estágio do tumor, o contexto celular e tecidual de origem [14], [15]. Mais de 30 genes que codificam proteínas diferentes, conhecidos como genes relacionados com a autofagia (ATG), foram identificados e estudos em modelos de ratos têm mostrado que macroautofagia é essencial para a manutenção da homeostase celular em muitos tecidos [16], [17]. Autophagy pode ser desencadeada por depleção nutricional ou de tensão metabólica e pode variar dependendo da procura de degradação de substrato e estímulo. Os sensores de energia sinais AMP quinase para o alvo mamífero do complexo rapamicina 1 (mTORC1), um importante regulador da autofagia, que controla diretamente a síntese de proteínas e processos de anabolizantes de forma sensível em nutrientes. vesículas induzida por inanição autofágicos são formados, que são susceptíveis de conter citosol livre [18], [19]. Além disso, outras condições de estresse, tais como organelas danificadas, patógenos intracelulares ou estresse no retículo endoplasmático pode induzir autofagia por diferentes caminhos daqueles ativados por inanição [19]. O processo de maturação, o passo final de autofagia, envolve a entrega e a degradação de carga autophagic. A fusão ocorre com lisossomos e vesículas autofágicos se aglutinam e conteúdo são degradados. O meio ácido de lisossomas é essencial para os passos finais de autofagia, e por perturbar a vacuolar H

+ ATPase, que está envolvida em lisossomas acidificantes, a conclusão de autofagia pode ser inibida [15], [19].

O objetivo do presente estudo foi explorar as consequências da perda de potencial de membrana mitocondrial induzida pela UA. Perguntamos se isso causou liberação de citocromo

c

e desencadeou apoptose. Perda de potencial de membrana e de propriedade da UA aos prótons de transporte através das membranas seria esperado para levar a um declínio na produção de ATP pelas mitocôndrias [9]. Descobrimos que as células cancerosas tratadas UA tinha diminuído os níveis de ATP e aumento da fosforilação da AMP-quinase. Curiosamente, UA desencadeada autofagia mas sem degradação do conteúdo autophagosomal, sugerindo um efeito perturbador sobre a acidificação autophagolysosomal. Os nossos resultados indicam que a indução de autofagia foi mediada por uma combinação de resposta à escassez de nutrientes, bem como o stress celular.

(A) Níveis de ATP, medidos num luminómetro, foram diminuídas em células T47D, após tratamento com UA (10 ug /mL; DMSO 0,2%) durante 24 horas. Os dados são apresentados como luminescência /células de cada grupo em comparação com o controlo de DMSO. As barras de erro indicam o erro padrão da média, * p 0,05. (B) A fosforilação da quinase de AMP, verificada por Western blotting, foi detectado em células T47D, após tratamento com UC (10 ug /ml; 0,2% de DMSO) durante 24 e 48 horas

Materiais e Métodos.

material vegetal, cultura de células e exposição a substâncias Teste

(+) – ácido úsnico (97%) foi isolado a partir de

Cladonia arbuscula

(Wallr.) Rabenh. (Cladoniaceae) coletados em campo aberto na Islândia, não de propriedade privada. O isolamento e a identificação foi realizada como descrito [12]. A substância foi dissolvida em dimetil sulfóxido (DMSO; Merck, 2951) e diluída para utilização em meio de cultura de tecidos. Todos os testes incluíram controles, onde foi usada a maior concentração equivalente de DMSO. As linhas celulares de cancro da mama T47D e MCF7 e a linha celular de cancro pancreático Capan-2 foram obtidas a partir da American Type Culture Collection (ATCC) por meio de LGC Promochem. T47D contém uma única cópia mutada de p53 [20], mas Capan-2 e MCF7 são homozigotas para p53 de tipo selvagem [21]. MCF7 é positivo receptor de estrogénio [22]. fibroblastos humanos primários foram cultivados a partir de biópsias de pele normal e usado na passagem 6-13 (permissão do Comitê Nacional de Bioética VSNb2006020001 /03-16; consentimento informado obtido). Todas as linhas celulares foram mantidas em meio RPMI-1640 de cultura de tecidos (GIBCO ™, 52400), contendo 0,5% de penicilina e estreptomicina (GIBCO ™, 15140-148) e 10% de soro fetal de bovino inactivado pelo calor (FBS; GIBCO ™, 10270) com T47D que recebe adicionalmente de 0,01 mg /ml de insulina (Sigma, I1882) e subcultivadas seguinte descolamento por tripsina (0,25% de tripsina /EDTA, Difco ™, 215240), conforme apropriado. As células foram semeadas a um número apropriado de exceder 70-80% de confluência após cultura de 24 horas. (+) – Ácido úsnico (5 ou 10 ug /mL), a metformina (10 mM; Sigma, D150959) e controlo de solvente foram adicionados e as células foram incubadas sob condições padrão, por diferentes períodos de tempo. Para a indução de autofagia pela privação de nutrientes, as células foram incubadas com solução de Hank (Sigma, H9394) durante os últimos 40 minutos do tempo de incubação.

Indução de vacúolos autofágicos, com membranas de característica de duplo autofagossomas, foi detectada por microscopia electrónica em células T47D, após tratamento com AI (2,5 e 5,0 ug /ml; 0,1% de DMSO) durante 24 horas. Setas pretas indicam vacúolos autofágicos, setas brancas indicam a formação de membrana dupla.

(A) Um aumento na LC3 puncta foi detectado, por imunofluorescência em células T47D e MCF7 após o tratamento com UA (10 ug /mL) durante 24 horas. Nenhum efeito foi observado em fibroblastos normais. A barra de escala mostrada representa 20 mm e se aplica a todos os painéis. (B) pontos lacrimais LC3 por célula foram contadas e quantificado por ImageJ e dados representados como pontos lacrimais LC3 /células de cada grupo em comparação com o controlo de DMSO. As barras de erro indicam o erro padrão da média, * p 0,05, ** p 0,001. (C) Aumento da LC3 I e II LC3, verificada por Western blotting, foi detectado em células T47D, após tratamento com UC (10 ug /mL; DMSO 0,2%) durante 24 horas

Estimativa de. Os níveis de ATP

As células foram descoladas por tripsinização, uma pequena aliquota removida para contagem e colhidas utilizando M de ácido perclórico 0,5 (Merck, 1,00519) durante 10 min a 4 ° C. Após centrifugação de 10 mL do sobrenadante foram misturados com 1 ml de água destilada. A bioluminescência foi ensaiada utilizando 75 uL de reagente de luciferase (Promega, FF2021), que lisaram as células e fornecidos no substrato luciferina. A luminescência foi medida num luminómetro (Turner TD 20/20) e expressa como luminescência /célula.

(A) Não foi detectada degradação de p62, por Western blot, em células T47D e MCF7, após tratamento com UA ( 5,0 e 10 ug /mL, 24 h; DMSO 0,1%). (B) Lyso Tracker, detectadas por microscopia de fluorescência, mostra a coloração difusa em células T47D, após tratamento com UC (10 ug /mL; DMSO 0,2%) durante 24 h e 72 h. (C) Lyso Tracker intensidade por célula foi quantificado por ImageJ e os dados apresentados como a média de fluorescência valor de cada grupo em comparação com o controlo de DMSO. As barras de erro indicam o erro padrão da média, ** p 0,001. A barra de escala mostrado representa 100 mm e se aplica a todos os painéis. (D) Não foram detectados efeitos sobre a imunocoloração LAMP2, após o tratamento com UA

(

10 ug /mL; DMSO 0,2%) durante 24 horas. A barra de escala mostrado representa 100 mm e se aplica a todos os painéis. (E) Um plasmídeo que expressa MRFP-GFP-LC3 foi transfectado em células T47D. A falta de acidificação autophagolysosomal foi observada após tratamento com UC (10 ug /mL; DMSO 0,2%) durante 24 horas através da detecção de pontos lacrimais GFP distinta. A barra de escala mostrado representa 20 mm e se aplica a todos os painéis.

Electron Microscopy

Depois de um tempo de incubação de 24 horas em células condições padrão foram colhidas por tripsinização e fixado em 1 mL de glutaraldeído (Ted Pella Inc, 18426) solução durante 60 minutos à temperatura ambiente, em seguida, centrifugadas e armazenadas a 0-5 ° C durante 24 horas. Depois de remover o glutaraldeído, duas gotas de uma solução gelatinizada 2% (Ted Pella Inc, 19225) de água destilada foram adicionados ao sedimento de células, cuidadosamente misturado e armazenado a 0-5 ° C durante 24 horas. As amostras foram então lavadas duas vezes com PBS e tetróxido de ósmio (Ted Pella Inc, 18463) adicionado a cada amostra durante uma hora e lavou-se novamente com PBS. As amostras foram cortadas para 2-5 pedaços mm sob uma macroscope usando lâminas de barbear. As peças foram desidratadas utilizando etanol (Merck, 64271D) em concentrações crescentes, sob rotação. Epoxi-resina (Ted Pella Inc, 18300) foi adicionado, em primeiro 1:01 (vol: vol) com 99% de etanol (Merck, 64271), durante uma hora, em seguida, duas vezes resina apenas para uma hora de cada vez. Os moldes foram então colocados num forno a 70 ° C durante 24 horas. A resina foi em seguida cortado com uma faca de vidro (espessura de cerca de 0,5 um) e coradas com azul de toluidina para selecção de amostras para o corte com uma faca de diamante (70-100 nm de espessura). As amostras foram colocadas sobre um quadro de cobre antes da coloração com uma solução de citrato de chumbo-0,06 g /ml (Ted Pella Inc, 19314) e foram visualizados utilizando um microscópio electrónico Philips EM300. Imagens projectadas foram desenvolvidos utilizando procedimentos padrão para fotografar. O filme desenvolvido foi digitalizado em um computador com uma Nikon Coolscan V ED

(A) A diminuição da p-p70S6K foi detectada, pelo método da imunoperoxidase, após o tratamento com UA (10 ng /mL;. DMSO 0,2% ) durante 24 horas. A barra de escala mostrado representa 100 mm e aplica-se a ambos os painéis. (B) Um aumento da p-eIF2α foi detectado, após o tratamento com UA (10 ng /mL; DMSO 0,2%). Por 6 horas

Imunocitoqu�ica

Para imunofluorescência, As células foram colhidas e fixadas em paraformaldeído a 4% (Sigma, P6148) e coradas com anti-citocromo

C, anticorpo monoclonal de IgG2a do rato

(Abcam, ab110325), caspase-3 clivada, anticorpo policlonal de coelho (Cell Signaling, 9661) ou LAMP2, anticorpo monoclonal IgG1 de ratinho, obtida a partir de University School of Medicine, Baltimore), seguido de vermelho anticorpo IgG Alexa Fluor 546 anticorpo de cabra anti-coelho (Invitrogen, A11010), anticorpo (H4b4 Alexa Fluor verde 488 de cabra anti-IgG de coelho (Invitrogen, A11070) ou Alexa fluor vermelho 546 IgG de cabra anti-ratinho

anticorpos 2A (Molecular Probes, A11018) Para coloração nuclear de TO-PRO-3 iodeto de (Invitrogen, T3605) foi usado. Para a detecção LC3 as células foram fixadas com metanol (Sigma, 34860) durante 10 min a -20 ° C e coradas com anti-LC3B (D11), anticorpo de coelho IgG monoclonal (Sigma, L7543) seguido de Alexa Fluor 488 cabra anti verde -rabbit anticorpo IgG (Invitrogen, A11070). As células coradas foram visualizadas e fotografadas sob um microscópio confocal (Zeiss, LSM 5 Pascal). Para a coloração de imunoperoxidase células foram fixadas com metanol (Sigma, 34860) durante 5 min a -20 ° C e coradas com anti-fosfo-p70S6 cinase (Thr389; 108D2), IgG de coelho, anticorpo monoclonal (Cell Signaling, 9234), anti -LC3B (D11), o anticorpo monoclonal IgG de coelho (Sigma, L7543) e anti-p62 (SQSTM1), anticorpo policlonal de coelho (Enzo, PW9860) seguido de incubação com imunoglobulinas monoclonais de ratinho anti-coelho IgG1K (Dako, M0737), anticorpo policlonal de coelho imunoglobulinas anti-IgG de ratinho (Dako, Z0259), PAP, peroxidase de rábano e monoclonais de ratinho anti-imunocomplexos rábano, IgG1 (Dako, P850) e comprimidos DAB, cromogénio (Dako, S3000). As células coradas foram visualizadas e fotografadas sob um microscópio sob luz (Leica DMI 3000B).

Análise Western Blot

As células foram colhidas e lisadas com tampão RIPA. O teor de proteína foi quantificado espectrometricamente utilizando reagente de Bradford (Sigma, B6916). As proteínas foram separadas em NuPAGE 10% Bis-Tris Gels Mini e transferidos para 0,2 uM de difluoreto de polivinilideno (PVDF) por electrotransferência membrana. As membranas foram sondadas com anti-fosfo-AMPKα (Thr172) (Cell Signaling, 4188) IgG de coelho anticorpos monoclonais, anti-p62 (SQSTM1), anticorpo policlonal de coelho (Enzo, PW9860), anti-LC3B (D11), o anticorpo monoclonal IgG de coelho (Sigma, L7543), anti-fosfo-eIF2α (Ser51) (Cell Signaling, 9721) anticorpo policlonal de coelho ou um anticorpo policlonal de coelho anti-G3PDH anti-humano (R D Systems, 2275-PC-1). O anticorpo secundário foi utilizado cabra anti-IgG de coelho /HRPlinked (Cell Signaling, 7074S) e anticorpo secundário conjugado com IRDye-680 ou 800 (Metabion, 68021). As proteínas foram visualizadas pelo kit de detecção de quimioluminescência aumentada (ECL) (GE Healthcare, RPN2132) e o sinal foi detectado utilizando um filme de quimiluminescência de alto desempenho (GE Healthcare, 91415) ou detectado pelo sistema de imageamento infravermelho Odyssey.

Visualização dos lisossomos por Lysotracker Sondas

O meio de cultura de tecido foi substituído por pré-aquecido (37 ° C) de 75 nm vermelho Lyso Tracker DND-99 (Invitrogen, L7528) e as células incubadas a 37 ° C durante 1 h. Carregando solução foi, em seguida, lavou-se e substituído por meio fresco e as células coradas foram visualizadas e fotografadas sob microscópio de fluorescência (Leica DMI 3000B). Lyso Tracker é uma sonda fluorescente para acidotropic rotulagem e rastreamento organelas ácidas nas células. A forma protonada desta sonda se acumula em compartimentos ácidas, onde forma agregados que apresentam fluorescência vermelha brilhante.

A transfecção com tfLC3 Construir

O plasmídeo MRFP-GFP em tandem LC3 fluorescente etiquetado (tfLC3) construir foi gentilmente cedido pelo Prof. Kevin Ryan, Instituto Beatson, Univeristy of Glasgow, com a permissão do Prof. Tamotsu Yoshimori, Universidade de Osaka [23], [24]. Cálcio /manganésio com base (CCMB) transformação das estirpes de E. coli DH10B de foi usado como anteriormente descrito [25]. A transfecção foi realizada utilizando TransPass D2 (Biolabs, M2554S) de acordo com o protocolo do fabricante. Após a transfecção as células foram expostas a substâncias de ensaio ou de privação de nutrientes, tal como descrito acima. As células foram colhidas e fixadas em paraformaldeído a 4% (Sigma, P6148), e visualizadas e fotografadas sob um microscópio confocal (Zeiss, LSM 5 Pascal).

Análises Estatísticas

As comparações estatísticas dos valores médios foram realizados utilizando duas análises lados de variância (ANOVA), incluindo o tratamento eo número de prazo como fatores, seguido de um post. comparação hoc utilizando Tukey HSD. os valores de p são descritos no texto em pontos apropriados. Em todas as figuras, * e ** indicam p 0,05 e P 0,001, respectivamente. As imagens e os dados apresentados são representativos do que foi observado em pelo menos três experiências separadas.

Resultados e Discussão

A via intrínseca da apoptose é desencadeada pela abertura de poros na membrana mitocondrial externa levando a libertação de citocromo

C

para o citosol e a activação da cascata de caspase [26]. Para acompanhar nosso trabalho anterior sobre os efeitos da UA na membrana mitocondrial potenciais [12] nós investigamos citocromo

vazamento c

e clivagem de caspase-3 por imunocoloração na linha de células do cancro da mama T47D e a linha de células de pâncreas Capan-2. Nenhuma citocromo

C

libertação ou caspase-3 clivada produtos eram detectáveis ​​após o tratamento com ácido úsnico (10 ug /mL) após 24, 48 e 72 horas (dados mostrados durante 72 horas;. A Fig. S1A e S1B Fig ). Estes resultados suportam os nossos dados anteriores que provoca necrose UA tarde, mas não apoptose [12], e indicam que, embora o gradiente de pH mitocondrial é perturbada, as próprias mitocôndrias estão intactos.

Tem sido relatado que as causas de ácido úsnico desacoplamento da mitocôndria [27], inibe a respiração mitocondrial e provoca uma queda nos níveis de ATP em hepatócitos de murino [10]. dados de expressão de gene a partir de análise de microarray reforçou a sugestão de que lançadeiras ácido úsnico protões contra o gradiente criado pelo transporte de electrões mitocondrial, uma vez que conduz à indução de genes associados com os complexos I-IV da cadeia de transporte de electrões [9]. Para aprofundar o assunto, os níveis de ATP foram avaliados e fosforilação do AMP quinase analisada em células T47D. Os resultados indicam que o tratamento UA leva à diminuição dos níveis de ATP celular após tratamento de 24 horas (5,0 ug /mL de p = 0,0523, 10 ug /mL de p = 0,010). Como esperado, a diminuição dos níveis de ATP, foram associados com o aumento da fosforilação da quinase de AMP, tanto após 24 e 48 horas de tratamento (10 ug /ml) (Fig. 1A e B).

Esta redução nos níveis de energia e celulares accionamento do mecanismo de detecção seria esperado para induzir autofagia. análise por microscopia electrónica de células T47D tratados com UA (2,5 e 5,0 ug /ml) durante 24 horas indicadas presença de vacúolos mais marcada autofágicos, com membranas de característica de duplo autofagossomas, em comparação com o controlo (Fig. 2). Estes resultados foram acompanhados por análise de pontos lacrimais LC3 por imunofluorescência, e uma estimativa da abundância de autofagossomas, em diferentes pontos de tempo e tratamentos de três tipos de células (Fig. 3a, a Fig. 3B e fig. S2A-C). Não foram observados efeitos após o tratamento com UC (10 ug /ml) durante 2 horas em qualquer uma das três linhas celulares, mas foi observado um aumento após o tratamento com a metformina droga anti-diabética na linha celular de cancro da mama T47D, que havia mais presente após o tratamento prolongado. Metformina tem sido mostrado previamente para estimular AMP da cinase já após uma hora [28]. Após 24 horas de tratamento com AI (10 ug /mL), um aumento significativo no LC3 pontos lacrimais foi comparada com controlos evidente nas linhas celulares de cancro da mama de dois. coloração com imunoperoxidase de células T47D também mostrou aumento da presença de LC3 puncta após o tratamento UA (Fig. S2D). Estes resultados foram ainda confirmados pela observação de um aumento no LC3 I e II LC3 por Western blot (Fig. 3C). Os efeitos sobre fibroblastos de pele normal não foram marcados. Para comparação, as células foram deixados em jejum por 40 min de incubação em solução equilibrada de nutrientes-livre de Hank. Embora inspeção visual sugeriu presença de formação autophagosome em células esfomeados (Fig. 3a), LC3 puncta eram difíceis de contar e esse tratamento duro não foi bem tolerada pelas células.

Tendo observado um aumento na LC3 puncta após o tratamento com UA, nós investigamos se a formação de vacúolos autofágicos foi seguido por fluxo autofágica. Os níveis de p62 autophagosomal carga foram avaliados após a exposição à UA. A concentração de p62 foi demonstrado para diminuir se autophagic fluxo é aumentado, uma vez que é degradada no processo [29]. Formação de autofagossomas como um resultado de tratamento com UC após 24 horas (5,0 e 10 ug /ml) em células T47D e MCF7 (Fig. 4A e Fig. S3) não foi seguido por degradação de proteínas internalizadas. A ausência de degradação de p62 às 24 horas sugere uma perturbação de acidificação lisossomal e autophagolysosome maturação que pode ser causado por o protão vaivém propriedades de ácido úsnico através da membrana lisossomal, como pode ser visto na despolarização das mitocôndrias [9], [10].

Para melhor avaliar os efeitos da UA sobre lisossomos foi utilizado o Lysotracker lisossômico marcador em células T47D que rotula e rastreia organelas ácidas nas células. Os resultados revelaram muito marcado aumento em coloração difusa Lysotracker em células T47D, após tratamento UA durante 24 e 72 horas (Fig. 4B e Fig. 4C). Este padrão de coloração foi interpretado como a dilatação do lisossoma como a causada por meio de tratamento com cloroquina, que se acumula dentro dos lisossomos. Em células tratadas com cloroquina, imunocoloração para a proteína da membrana lisossomal LAMP1 copiou o padrão obtido com Lysotracker, confirmando assim a dilatação lisossomal [30]. Em contraste, nas nossas experiências, a coloração de imunofluorescência para a proteína lisossómica LAMP2 não mostraram alterações morfológicas e não foi observada nenhuma diferença entre as células tratadas e não tratadas (Fig. 4D). Isto indica que a coloração foi Lysotracker fora do lisossoma e podia ser explicado por este facto que a retenção do corante dentro dos lisossomos depende pH ácido [31]. A coloração com Lysotracker difusa após tratamento UA pode, assim, ser devido aos protões sendo empurrados para fora do lisossoma, de uma maneira semelhante como ocorre através da membrana mitocondrial.

Para explorar maturação autophagosome após o tratamento UA, utilizou-se uma construção de plasmídeo , tfLC3 (MRFP-GFP-LC3 proteína fluorescente marcado com em tandem), com o qual as células transfectadas T47D. Este método tem sido utilizado anteriormente para seguir o processo de maturação autophagic. A GFP-LC3 perde fluorescência devido à acidez lisossomal, enquanto a fluorescência MRFP é estável [23], [24]. Os resultados mostraram que em células famintas fluorescência da GFP foi atenuada implicando condições ácidas e degradação por hidrolases lisossomais, enquanto MRFP fluorescência manteve-se estável. Após o tratamento com UC, durante 24 horas, a GFP, bem como MRFP fluorescência foi observada indicando a interrupção da acidificação autophagolysosomal e condições degradativas alterado após tratamento com UA (Fig. 4E). O fracasso dessas células para completar a autofagia poderia contribuir para a acumulação de vacúolos e retenção de p62 não degradada autofágicos.

Uma das características adaptativas de a maioria dos cânceres é pH desregulado. Em células normais de pH intracelular é menor do que o pH extracelular. Em células cancerosas do gradiente é revertido criar um ambiente favorável para a progressão metastática. Superior pH intracelular é mantida devido ao aumento H

+ efluxo devido a alterações na expressão e /ou actividade de bombas de membrana de plasma e transportadores [32]. O gradiente de pH em células tumorais é benéfico para a acumulação celular de ácidos fracos, tais como ácido úsnico, fazendo com que ácidos fracos, principalmente para ser neutra a um pH baixo e facilitar a sua transferência através da membrana. O tratamento com AI mostra a indução significativa de genes que estão ligados aos complexos de I a IV da cadeia de transporte de electrões, que pode ser um mecanismo de compensação para manter o gradiente de protões através da membrana interna mitocondrial [9], [32].

Estudos de vários síndromes herdados que predispõem para vários tipos de tumores e carcinomas levaram à identificação da via mTOR como um regulador de autofagia. Entre os alvos a jusante de mTORC1 são p70S6K e 4EBP1, que têm um papel essencial no controlo do ciclo celular e a proliferação de [33], [34]. Na Fig. 1B mostra-se que UC activa AMP-quinase, que sinaliza para o complexo mTORC1. Para explorar alvos a jusante de mTORC1 analisamos os efeitos em células tratadas com UA sobre p70S6K fosforilada por coloração com imunoperoxidase. Os resultados mostraram uma diminuição marcada na coloração após o tratamento durante 24 horas (Fig. 5a). As células respondem a uma escassez de nutrientes através da indução de autofagia mas este processo também pode ser desencadeada por stress celular [19]. Para explorar se UA pode ser desencadeamento autofagia por outro mecanismo testadas quanto à evidência de stress celular em células T47D, após tratamento com UC (10 ug /ml) durante 6 horas. O aumento da fosforilação de eIF2α, que é um dos reconhecidos sinais de stress ER, foi detectada (Fig. 5B).

Os efeitos do ácido úsnico sobre autofagia pode ser comparada com aqueles descritos para a cloroquina droga anti-malária que está actualmente em ensaios clínicos em combinação com regimes anti-cancerígenos [19]. A cloroquina é uma base fraca (p

K of a 8,5) e se acumula dentro dos lisossomos, que se tornam distendido e disfuncional, bloqueando o fluxo autofágica [19]. Em contraste, o ácido úsnico é um ácido fraco que transporta protões através das membranas, aumentando assim a pH lisossomal, tal como mostrado pela retenção do sinal de GFP, mas forma lisossomal não foi afectada (coloração LAMP2). ER stress é induzido por inibição do proteosoma e autofagia ER-associado é especialmente pertinente para a terapia do câncer com inibidores de proteassoma. Foi demonstrado que a combinação de cloroquina com o bortezomib inibidor do proteassoma aumenta a morte de células tumorais

in vitro

e

in vivo

[35]. a incorporação celular e a distribuição intracelular de drogas é afectada pelo pH, [36] [32]. A cloroquina pode, por exemplo impedir o sequestro intracelular nos lisossomas [36], mas não tem nenhum efeito sobre a acumulação mitocondrial de daunorubicina, sugerindo que o composto não afecta o pH mitocondrial [37]. Como o ácido úsnico afeta pH nos lisossomos e mitocôndrias se prevê para influenciar a distribuição da droga intracelular.

Em conclusão, nosso estudo anterior mostrou que a UA provoca a perda de potencial de membrana mitocondrial. No estudo atual, nós mostramos que esta não conduz à libertação do citocromo

c

e desencadeamento de apoptose. O H

+ efeito lançadeira da UA opera em dois organelas, mitocôndrias e lisossomos e seu efeito sobre a formação autophagosome é susceptível de ser desencadeado tanto por condições de depleção de nutrição e estresse. fluxo autofágica é no entanto incompleta e degradação do conteúdo autophagosomal não ocorre. Nossos resultados têm implicações para a manipulação terapêutica de autofagia e distribuição de drogas determinou-pH.

Informações de Apoio

Figura S1. O

UA não causar apoptose. (A) O citocromo C vazamento não era detectável, por Imunofluorescência em T47D e células Capan-2, após tratamento com UC (10 ug /ml; 0,2% de DMSO) durante 24, 48 e 72 horas. (B) Nenhum produto de clivagem de caspase-3 foram detectável após tratamento com UC (10 ug /mL; DMSO 0,2%) após 24, 48 e 72 horas. A barra de escala mostrado representa 20 mm e se aplica a todos os painéis

doi:. 10.1371 /journal.pone.0051296.s001

(TIF)

Figura S2.

UA induz a formação de vacúolos autophagosome. LC3 puncta por célula foram contadas e quantificados por ImageJ e os dados apresentados como nível de confiança da família-wise 95%. (A) células T47D tratados com UC, durante 2 e 24 horas. células (B) MCF7 tratadas com UC, durante 2 e 24 horas. (C) fibroblastos humanos normais tratados com UC, durante 2 e 24 horas. (D) Um aumento na coloração com imunoperoxidase LC3 foi detectada, em células T47D, após tratamento com UC (10 ug /mL; DMSO 0,2%) durante 24 horas. A barra de escala mostrada representa 100 mm e aplica-se a ambos os painéis

doi:. 10.1371 /journal.pone.0051296.s002

(TIF)

Figura S3. O

UA não levar à degradação da p62. Não há diminuição da coloração com imunoperoxidase de p62 foi detectada, em células T47D, após tratamento com UC (10 ug /mL; DMSO 0,2%) durante 24 horas. A barra de escala mostrada representa 100 mm e aplica-se a ambos os painéis

doi:. 10.1371 /journal.pone.0051296.s003

(TIF)

Reconhecimentos

Somos gratos a membros do Centro Biomédico da Universidade da Islândia, Jóhann Arnfinnsson de ajuda com a microscopia eletrônica e Jenny Björk Þorsteinsdóttir para assistência técnica. Agradecemos a Anna Helga Jónsdóttir para obter ajuda com estatísticas.