Abstract

sulindaco é um medicamento anti-inflamatório não esteróide aprovado pela FDA com as atividades anticancerígenas documentados. Nossos estudos recentes mostraram que sulindac reforçada selectivamente a morte de células cancerosas expostas a agentes oxidantes através da produção de espécies reativas de oxigênio (ROS), resultando em disfunção mitocondrial. Este efeito de sulindac e o stress oxidativo em células cancerosas poderia estar relacionada com o defeito na respiração nas células cancerosas, primeiro descrito por Warburg há 50 anos, conhecido como o efeito de Warburg. Nós postulado que o sulindac pode aumentar a morte selectiva de células de cancro quando combinada com qualquer composto que altera a respiração mitocondrial. Para testar esta hipótese, foram utilizados dicloroacetato (DCA), que é conhecido para deslocar metabolismo do piruvato longe da formação de ácido láctico à respiração. Seria de esperar que DCA, uma vez que estimula o metabolismo aeróbico, poderia enfatizar a respiração mitocondrial em células de cancro, o que iria resultar em morte aumentada na presença de sulindac. Neste estudo, demonstrámos que a combinação de sulindac e DCA aumenta a morte selectiva de células de cancro A549 e SCC25 sob as condições utilizadas. Como previsto, o mecanismo da morte envolve a produção de ROS, disfunção mitocondrial, sinalização JNK e a morte por apoptose. Nossos resultados sugerem que a combinação de drogas sulindac-DCA pode proporcionar uma terapia eficaz do cancro

Citation:. Ayyanathan K, Kesaraju S, Dawson-Scully K, Weissbach H (2012) Combinação de sulindac e Dichloroacetate Câncer mata células via O dano oxidativo. PLoS ONE 7 (7): e39949. doi: 10.1371 /journal.pone.0039949

editor: Joseph Alan Bauer, Bauer Research Foundation, Estados Unidos da América

Recebido: 12 Agosto, 2011; Aceito: 4 de junho de 2012; Publicação: 17 de julho de 2012

Direitos de autor: © 2012 Ayyanathan et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Assistência Financiamento do National Institutes of Health para KA (concessão 5K01CA95620) e HW (concessão R15 CA122001) e do Estado da Flórida para HW (SURECAG concessão R94007) para realizar este trabalho é reconhecido agradecimento. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

é um Sulindac aprovado pela FDA não-esteróides anti-inflamatórias (NSAID), que também tem sido demonstrado ter actividade anti-cancro [1] – [6]. Estudos recentes do nosso laboratório mostraram que RKO, linhas de células A549 e cancerosas SCC25 exibiram sensibilidade em relação a uma combinação de sulindac e de um agente oxidante, tal como TBHP ou H

2O

2 [7]. Os dados indicaram que o efeito sulindac não estava relacionado com a sua actividade de AINE, mas que o sulindac feito células de cancro mais sensíveis ao stress oxidativo resultante da disfunção mitocondrial e perda de viabilidade. Em contraste, as células normais não mostram a morte aumentada sob condições semelhantes [7]. Nos últimos 10 anos tem havido relatos dispersos de morte do cancro aumentada usando sulindac em combinação com uma variedade de compostos, incluindo o trióxido de arsénio, bortezomib, difluorometilornitina (DFMO) e ácido hidroxâmico suberoilanilida (SAHA) [8] – [14]. Embora estes compostos têm diferentes sítios de acção, um mecanismo comum para a combinação de sulindac /droga melhorada morte pode envolver danos oxidativos, tal como foi claramente demonstrado nos nossos estudos anteriores utilizando o sulindac e um agente oxidante [7], [15]. Na verdade, ROS têm sido implicados nos estudos utilizando sulindac em combinação com trióxido de arsénico, bortezomib e SAHA [10], [12], [14].

Os resultados anteriores sugeriram que a morte aumentada de células cancerosas pela combinação de sulindac e de um agente oxidante pode ser devido a um defeito na respiração nas células cancerosas, tal como descrito pela primeira vez por Warburg mais de 50 anos [16], que observou que as células cancerosas favorecer a glicólise, não respiração, para obter energia, Ao contrário das células normais. Algumas células cancerosas obtidos, tanto quanto 50% da sua energia a partir de glicólise, ao passo que a glicólise em células normais representam menos de 5% do requisito de energia [16]. Para obter mais provas para os possíveis papéis da respiração alterada e ROS na morte de células cancerosas, sulindac e estresse oxidativo, iniciamos estudos com ácido dicloroacético de sódio (DCA). DCA é um candidato ideal como é conhecido para inibir uma cinase que se regula a actividade da desidrogenase de piruvato, resultando numa mudança de metabolismo do piruvato longe da formação de ácido láctico, em direcção a respiração [17], [18]. DCA tem sido utilizado clinicamente no tratamento de doentes com acidose láctica [19], e com base nas suas propriedades bioquímicas DCA também foi testado como um agente anticanceroso. Bonnet et al. 2007 demonstraram que DCA inverte o efeito Warburg em células cancerosas, redirecionando o metabolismo das células do cancro da glicólise para a fosforilação oxidativa. Nesses estudos anteriores, foi demonstrado que o DCA aumenta os níveis de ROS de complexo I. Este, por sua vez desencadeia a “remodelação” do metabolismo mitocondrial (reduz ΔΨm, abre poro mitocondrial de transição) em células cancerosas empurrando-os para a apoptose. Além disso, vários estudos recentes têm verificado que o DCA pode aumentar os níveis de ROS em células cancerosas e despolarizar a membrana mitocôndrias no pulmão, endométrio, e linhas celulares de glioblastoma, resultando em apoptose ambos

in vitro

e

in vivo

[18], [20] – [22]. De interesse foi a observação de que sob as condições utilizadas DCA não pareceu afectar significativamente o metabolismo mitocondrial ou viabilidade em células normais [18], [23].

Com base nas nossas observações anteriores sobre o efeito do cancro matando sulindac e um agente oxidante que influencia o metabolismo mitocondrial [7], postulamos que a combinação de sulindac e DCA pode sinergicamente melhorar a morte do cancro e têm valor terapêutico importante. No presente estudo, examinamos o efeito do uso sulindac, em combinação com DCA sobre a viabilidade de A549 e linhas celulares de cancro SCC25. Também estudaram o papel da função mitocondrial e apoptose no câncer de matar observado com esta combinação de drogas.

Materiais e Métodos

Materiais

Sulindac, N-acetilcisteína e Tiron foram adquiridos a partir de Sigma (St. Louis, MO). sal de sódio DCA foi obtido a partir Acros Organics (Geel, Bélgica). H2DCFDA e JC-1 foram adquiridos de Molecular Probes (Eugene, OR). MTS reagente de ensaio e Kit Deadend Tunel foram obtidos da Promega (Madison, WI). Citosol /kit fracionamento mitocôndrias eo CBA077 InnoCyte ™ Citometria de Fluxo citocromo

c

kit lançamento eram de Calbiochem, Gibbstown, NJ. Todos os meios de cultura de células, soro fetal de bovino, e outros suplementos tais como penicilina /estreptomicina, glutamina, etc. foram adquiridos da American Type Culture Collection (ATCC; Rockville, MD).

O A549 e células cancerosas SCC25, células pulmonares normais, e queratinócitos epidérmicos humanos foram tratados com as concentrações indicadas de DCA na presença ou ausência de sulindac (Sul) durante 48 horas. A viabilidade celular foi monitorada pelo ensaio de MTS como indicado nos Métodos. A viabilidade das células é expressa como% do controlo (células não tratadas com o sulindac). As barras de erro são o erro padrão da média (SEM), expresso como% do valor médio do quadruplicado de uma experiência representativa. As viabilidades celulares são ilustradas para as células de cancro A549 (A), células de cancro SCC25 (B), células de pulmão normal (C) e queratinócitos epidérmicos humanos normais (D). ♦, -Sul; ▪, + Sul. * P 0,05, ** p 0,005, *** p . 0,0005

Cultura de Células

A linha de não pequenas células do pulmão de células de carcinoma (NSCLC), A549, o a linha de células de pulmão humano normal, MRC-5, e uma linha de carcinoma de células escamosas derivado de língua, SCC25 foram adquiridas a partir da ATCC (Rockville, MD) e mantidas em meio F12-K suplementado com 10% de soro fetal bovino, glutamina 2 mM, 100 UI /ml de penicilina, e 100 ug /ml de estreptomicina, em atmosfera humidificada, 5% de CO

2 incubadora a 37 ° C. queratinócitos epidérmicos humanos normais foram obtidas a partir de Promocell GmbH (Heidelberg, Alemanha) e mantida em meio de cultura recomendado. passagem precoce, células normais não imortalizadas foram utilizadas para as experiências.

as células cancerosas SCC25 A549 e foram tratadas com as concentrações indicadas de DCA na presença ou ausência de sulindac sulfona (SULS) durante 48 horas. SULS foi utilizado a uma concentração final de 250 uM para células de cancro A549 e 75 uM para células cancerosas SCC25. A viabilidade celular foi monitorada pelo ensaio de MTS como descrito em Métodos. A viabilidade das células é expressa como% do controlo (células não tratadas com sulindac sulfona). As barras de erro são o erro padrão da média (SEM), expresso como% do valor da média de triplicados de uma experiência representativa. As viabilidades celulares são ilustradas para as células de cancro A549 (A) e células cancerosas SCC25 (B). ♦, -SulS; ▪, + SULS. * P 0,05, ** p 0,005, *** p . 0,0005

Viabilidade Celular Ensaio

O câncer A549 e do pulmão de células normais foram semeadas a 3 × 10

3 células por cavidade, enquanto células de cancro SCC25 e queratinócitos normais foram plaqueadas a 7,5 x 10

3 células por poço numa placa de 96 poços. As células foram cultivadas durante 18-20 horas, o meio descartado em condições assépticas e substituído com meio de cultura fresco contendo as combinações fármaco indicado. Onde indicado sulindac 500 uM foi usado com o cancro da A549 e as células normais de pulmão e 100 uM sulindac foi usado com cancro SCC25 e células de queratinócitos normais. As placas foram incubadas durante 48 horas a 37 ° C em 5% de CO

2 incubadora. O meio de cultura foi rejeitado e as células foram cuidadosamente lavados em 1 x PBS. A viabilidade celular foi determinada usando o CellTiter 96 Aqueous One Ensaio de Proliferação celular (Promega) de acordo com as instruções do fabricante. O ensaio utiliza um composto de tetrazólio que é convertido num formazano solúvel em água pela acção de desidrogenases celulares presentes nas células metabolicamente activas [24]. O formazano foi quantificada pela medição da absorvância a 490 nm utilizando um leitor de placa de microtitulação colorimétrico (SpectraMax Além disso; Molecular Devices). absorção de fundo foi subtraído de cada amostra.

intracelular Medição da ROS

O A549 e linhas celulares de cancro SCC25 foram semeadas como acima. Seguindo o tratamento de medicamento 48 h, as células foram incubadas com 50 uM de diacetato de dichlorodihydrofluorescein (H

2DCFDA, Sondas Moleculares) em meio isento de indicador durante 30 min a 37 ° C. As células foram enxaguadas com PBS e os níveis de ROS foram visualizadas por microscopia de fluorescência. As imagens foram capturadas usando o software Qcapture e processadas no Adobe Photoshop. A análise das imagens foi feito usando o software Slidebook. Os dados obtidos a partir de uma experiência representativa foram usadas para a quantificação de células DCF-positivos como medido através da fluorescência verde devido ao DCF oxidado.

Os painéis superiores (A) ilustram os resultados para células de cancro A549 enquanto que os painéis de fundo ( B) mostram os resultados para células cancerosas SCC25. As células foram tratadas com as concentrações indicadas de drogas e processados ​​para microscopia de fluorescência, tal como descrito nos Métodos. A medida de níveis de ROS intracelulares são ilustrados como a intensidade de fluorescência verde observada em células tratadas com nenhuma droga (sub-painéis A1 e B1), sulindac sozinho (sub-painéis A2 e B2), DCA sozinho (sub-painéis A3 e B3) e sulindac e tratamento de combinação DCA (sub-painéis A4 e B4). Vários campos independentes foram fotomicrografados e campos representativos para cada condição são mostrados.

JC-1 Coloração para monitorar Membrana Mitocondrial Potencial

potencial de membrana mitocondrial foi determinada utilizando o JC-1 corante ( molecular Probes). As linhas de células A549 e cancerosas SCC25 foram plaqueadas como acima. Seguindo o tratamento de medicamento 48 h, as células foram incubadas com 5 ng /ml de JC-1 em meio isento de corante indicador durante 30 min a 37 ° C. As células foram lavadas com PBS e visualizadas por microscopia de fluorescência. mitocôndrias normais ativamente tomar-se JC-1 corante de forma potencial-dependente e formar J-agregados, o que dá uma fluorescência vermelha. Perturbações e subsequente perda de potencial de membrana mitocondrial leva a um aumento da fluorescência verde no citosol devido à monomérica JC-1, que é determinada pela sequência do aparecimento de fluorescência verde utilizando um filtro FITC (Zeiss Axiovert microscópio invertido-40 CFL). captura de imagem, o processamento e análise foram realizadas como acima. Os dados obtidos a partir de uma experiência representativa foram usadas para a quantificação de células positivas de JC-1-verdes.

Os painéis superiores (A) ilustram os resultados para células de cancro A549 enquanto que os painéis de fundo (B) apresentam os resultados para SCC25 células cancerosas. perda de potencial de membrana mitocondrial foi detectada por uma alteração na distribuição de JC-1, resultando num aumento da fluorescência verde (ver Métodos). As condições experimentais para JC-1 coloração e microscopia de fluorescência são explicados detalhadamente em Métodos e os regimes de tratamento de drogas são descritos abaixo os painéis. células não tratadas (sub-painéis A1 e B1), as células tratadas com sulindac (sub-painéis A2 e B2), as células tratadas com DCA (sub-painéis A3 e B3), e as células tratadas com sulindac e DCA (sub-painéis A4 e B4). Vários campos independentes foram fotomicrografados e campos representativos para cada condição são mostrados.

Efeito da ROS Scavengers sobre a viabilidade celular na presença de sulindac e DCA

O A549 e linhas celulares de cancro SCC25 foram plaqueadas como descrito acima. Para eliminar ROS, quer mM de N-acetilcisteína 2 (NAC) ou Tirón 2 mM (sal dissódico do ácido 4,5-di-hidroxi-1,3-benzenodissulfónico) foi adicionado juntamente com o sulindac e DCA durante 48 h a 37 ° C. A viabilidade celular foi monitorada pelo ensaio de MTS e análise estatística realizada como mencionado acima.

Coloração de TUNEL para monitorar células em apoptose

ensaio TUNEL

foi realizada em placas de 96 poços utilizando o kit de ensaio de TUNEL colorimétrico deadend (Promega) seguindo o protocolo do fabricante. O A549 e linhas celulares de cancro SCC25 foram plaqueadas como descrito acima e tratadas durante 48 horas com nenhuma droga, sulindac, DCA, ou a combinação de drogas. Subsequente ao tratamento de droga, as células foram fixadas com formalina e permeabilizadas com 0,2% de Triton X-100 em PBS. As células foram incubadas com transferase recombinante de desoxinucleotidilo terminal (TdT) e nucleótidos biotinilados. peroxidases endógenas foram bloqueadas com 0,3% H

2O

2 antes da incubação com peroxidase de rábano-estreptavidina (HRP-estreptavidina) que se liga aos nucleótidos biotinilados incorporados no entalhado termina presente em células que sofrem apoptose. HRP-estreptavidina células marcadas foram detectadas por peróxido de hidrogénio e diaminobenzidina (DAB). As células que mostram coloração nuclear marrom escuro são indicativas de apoptose.

As células A549 e câncer SCC25 foram tratados com as concentrações indicadas de DCA na ausência (barras cinza) ou presença de sulindac (barra preta) ou presença de sulindac e N-acetilcisteína (barra listrado) durante 48 horas. A viabilidade celular foi monitorada pelo ensaio de MTS como indicado nos Métodos. A viabilidade das células é expressa como% do controlo (células não tratadas com o sulindac). As barras de erro são o erro padrão da média (SEM), expresso como% do valor médio do quadruplicado de uma experiência representativa. A inibição do crescimento das células do cancro ocorreu de um modo dependente da dose durante o tratamento combinado de DCA e sulindac (barras negras) em ambos câncer A549 (A) e células cancerosas SCC25 (B). No entanto, esta matança reforçada foi prevenida quando a N-acetilcisteína estava presente com o tratamento de combinação de drogas (barras listrado em A e B).

Análise Western Blot

As células foram cultivadas a 70 % de confluência, tratada com drogas especificados para as durações indicadas, e as fracções citosólicas foram isolados utilizando o kit de citosol /mitocôndrias fraccionamento (Calbiochem, Gibbstown, NJ) seguindo o protocolo do fabricante. Resumidamente, as células foram colhidas em diferentes pontos de tempo e, em seguida, foram centrifugadas a 600 x g durante 5 min a 4 ° C. As células sedimentadas foram suspensas no tampão fornecido e incubadas durante 10 min em gelo. As células foram então homogeneizadas utilizando um douncer vidro e o homogenato centrifugado a 700 x g durante 10 min a 4 ° C para sedimentar os núcleos e os resíduos celulares. O sobrenadante foi centrifugado a 10, 000 x g durante 30 min a 4 ° C para se obter o sedimento e o sobrenadante mitocondrial foi considerada como a fracção citosólica. A concentração de proteína foi determinada utilizando um ensaio de Bradford padrão.

sessenta microgramas de proteína total foi carregado e separados num gel de 4-12% Bis-Tris NuPage (Invitrogen, Eugene, OR) e transferidas para uma membrana de PVDF que foi sondada por os anticorpos primários. Os anticorpos primários, JNK, pJNK, citocromo

c

, e PARP (Cell Signaling Technology, Danvers, MA), foram usados ​​em 1:1000 diluição. p-actina, (Santa Cruz Biotechnologies, Santa Cruz, Califórnia), foi utilizado a 1:4000 diluição. Os anticorpos secundários conjugados com peroxidase de rábano foram utilizados e as bandas foram visualizadas utilizando um método de quimioluminescência aumentada (GE Healthcare, Piscataway, NJ).

Os painéis superiores (A) ilustram os resultados para células de cancro A549 enquanto que os painéis de fundo (B) retratam os resultados para células cancerosas SCC25. A extensão de células que sofrem apoptose foi monitorizada por coloração de TUNEL de células tratadas com nenhuma droga (sub-painéis A1 e B1), sulindac sozinho (sub-painéis A2 e B2), DCA sozinho (sub-painéis A3 e B3), e sulindac e DCA (sub-painéis A4 e B4). As células foram tratadas com os fármacos indicados como mencionado nos painéis, sujeitas a coloração TUNEL, e processados ​​para microscopia de fluorescência, tal como descrito nos Métodos. Vários campos independentes foram fotomicrografados e campos representativos para cada condição são mostrados. células Brown-manchadas são indicativos de células em apoptose.

ligadura mediada por base PCR DNA Laddering Ensaio para monitorar Extensão de células em apoptose

Para confirmar a extensão da apoptose, ligation- ensaio de escalonamento de ADN mediada por PCR com base nucleossomal foi realizada como descrito [25]. As linhas de células A549 e cancerosas SCC25 foram plaqueadas a 5 x 10

4 e 1 × 10

5 células por poço em pratos de 35 mm. As células de cancro A549 foram tratadas durante 48 horas com: a) nenhuma droga, b) 500 uM sulindac, c) DCA 20 mM, e d) a 500 uM sulindac mais DCA 20 mM. Do mesmo modo, as células cancerosas SCC25 foram tratados com as quatro combinações diferentes de drogas acima mencionadas, excepto que o sulindac e DCA foram usadas em concentrações de 100 uM e 10 mM, respectivamente. Após o tratamento, o ADN celular total foram extraídos, ligado ao adaptador construído a partir de 27-mer 5′-GACGTCGACGTCGTACACGTGTCGACT-3 ‘e 5′-12-mer AGTCGACACGTGTAC-3’. Na sequência de ligação, o DNA foi aquecido para libertar o 12-mer, preenchido com polimerase Taq, submetido a PCR com iniciadores semi-quantitativa, e analisados ​​num gel de agarose a 1,2%, juntamente com marcadores de tamanho.

Em situ

Localização de citocromo

c

por imunofluorescência

localização intracelular do citocromo

c

foi monitorada por imunofluorescência usando o CBA077 InnoCyte ™ Citometria de Fluxo citocromo

c

Kit de lançamento de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, as células foram plaqueadas a SCC25 3,5 × 10

5 células por 35 milímetros prato de vidro de fundo e tratados com os fármacos indicados durante 15 h. As células foram lavadas em 5 ml de 1 x PBS e permeabilizadas sobre gelo durante 10 minutos em 300 ul de tampão fornecido. As células foram fixadas à temperatura ambiente durante 20 min em 500 uL de paraformaldeído a 4%. Subsequentemente à lavagem e bloqueio, as células foram incubadas com 250 ul de anticorpo anti-citocromo C (1:500 diluição) durante 1 h à TA. Após lavagem, as células foram incubadas com 300 uL de FITC-IgG (1:300 diluição) durante 1 h à TA. Finalmente, as células foram coradas com 300 ul de DAPI (1 mg /ml) durante 10 min à temperatura ambiente. As células foram visualizadas utilizando um microscópio de fluorescência Olympus invertido. As imagens foram capturadas e processadas como acima mencionado. Vários campos foram analisados ​​e micrografias representativas que mostram os padrões de localização de citocromo

c

sob cada condição de tratamento foram obtidos. valores quantitativos são apresentados no texto.

A. SCC25 células foram tratadas durante 48 h com o sulindac (100 uM) e as concentrações indicadas de DCA e quando indicado 20 uM do inibidor de JNK, SP600125. ♦, nenhuma droga; ▪, sulindac; ▴, sulindac e SP600125. A viabilidade celular foi monitorada pelo ensaio de MTS como indicado nos Métodos. As barras de erro são o erro padrão da média (SEM), expresso como% do valor médio do quadruplicado de uma experiência representativa. Veja o texto para mais detalhes. A análise estatística entre ♦, Sem adição e ▪, Sul; * P 0,05, ** p 0,005, *** p 0,0005. A análise estatística entre ▪, Sul e ▴, sulindac e JNKI;

$ p 0,05,

$$ p 0,005,

$$$ p 0,0005. B. Western blots representativos que ilustram o efeito de sulindac e DCA sobre os níveis totais de JNK, phopsho-p46JNK e phopsho-p54JNK. os níveis de p-actina foram usadas como um controlo interno. fracções citosólico de células em SCC25 foram isoladas no ponto de tempo de 12 horas e os níveis de JNK e fosfo-JNK foram determinados por Western blotting. Na linha de células SCC25, JNK total apresentou duas bandas distintas de 46 e 54 kDa.

Análise estatística e determinação de Índices de Combinação

Os dados são apresentados como média ± SEM para a célula ensaios de viabilidade. Para a análise estatística, o software estatístico Minitab foi usado para realizar t-teste e valores de Student com p 0,05 foram considerados estatisticamente significativos. Para determinar o efeito sinérgico de sulindac e DCA em A549 e linhas celulares de cancro SCC25, uma análise quantitativa da relação dose-efeito foi realizada para determinar os índices de combinação [26]. Ambos sulindac e DCA foram testados isoladamente e em A549 SCC25 células nas concentrações indicadas. Para as células A549, uma proporção de 01:50 foi mantida durante o sulindac: DCA combinações de fármacos variando de 0,2 mM: 10 mm até 1 mm: 50 mm, respectivamente. Para SCC25 células, numa proporção de 1:100 foi mantida durante o sulindac: DCA combinações de fármacos variando entre 0,05 mM: 5 mm até 0,3 mm: 30 mm, respectivamente. Nossos resultados experimentais e os valores do índice de concentração determinado são incluídas no texto.

Resultados

Killing Sulindac e DCA Causa melhorada do A549 e células cancerosas SCC25, mas não as células normais

Para estes estudos testou-se a combinação de sulindac e DCA em A549 e células cancerosas SCC25. As células foram incubadas com cada composto sozinho ou em combinação, durante 48 horas antes do ensaio de viabilidade (ver Métodos). Uma curva de resposta à dose sulindac sob estas condições indicado que as células de cancro A549 e SCC25 pode tolerar uma concentração máxima de 500 uM e 100 uM de sulindac, respectivamente, sem exibir qualquer morte significativa (dados não mostrados), e estas concentrações foram utilizadas em toda a estudos. DCA, quando adicionado, foi usada em concentrações de 0-40 mM, tal como indicado. Usamos estas concentrações com base em relatórios anteriores, que indicaram que, acima de 5 mM é necessário para causar disfunção mitocondrial em

in vitro

experimentos [27]. Como mostrado na Figura 1A, o DCA sozinho (sem o sulindac) é um pouco tóxico para as células de cancro A549, especialmente acima de concentrações de 20 mM, mas na presença de sulindac lá é reforçada a morte dessas células em concentrações acima de 5 mM de DCA. No caso de as células cancerosas SCC25 alguma perda de viabilidade celular com DCA sozinho foi observada mesmo em concentrações inferiores a 10 mM DCA (Figura 1B). No entanto, na presença de sulindac houve novamente um aumento marcado na morte celular que era claramente evidente entre as concentrações de 2-10 mM de DCA. Anteriormente, mostrou que a combinação de sulindac e de um agente oxidante era selectiva para células cancerosas e não aumentar a morte de células normais [7]. Sulindac e DCA também não aumentar a morte de células do pulmão e da pele normais sob as condições experimentais utilizadas, como mostrado nas Figuras 1C e D. Deve notar-se que a células MRC-5 (pulmão normal), as células são especialmente sensíveis a DCA, como relatados anteriormente [28], por razões que não são conhecidos.

para verificar se havia um efeito sinérgico quando se utilizou a combinação de fármacos, foram determinados os índices de combinação através de uma análise quantitativa da relação dose-efeito [ ,,,0],26] em duas linhas diferentes de células de cancro (Figura S1). Os índices de combinação foram de 0,84 para o A549 e 0,73 para as células cancerosas SCC25, respectivamente. Um valor inferior a 1,00 indica um cancro do efeito morte sinérgica (Figura S2).

A Efeito sulindac não é devido à sua actividade de AINE

Em estudos anteriores usando sulindac e um agente oxidante, foi demonstrado que o assassinato reforçada e selectiva das células cancerosas por sulindac e um agente oxidante não estava relacionada com a capacidade NSAID conhecida de sulindac. Para determinar o papel da inibição da COX um metabolito de sulindac, sulindac sulfona, pode ser utilizado, uma vez que não inibem a COX 1 ou 2, [7], [29]. Como mostrado na Figura 2, usando ambos A549 (A) e células cancerosas SCC25 (B), a combinação de sulindac sulfona e DCA mostrou um efeito de morte semelhantes como pode ser visto acima, com o sulindac. Estes resultados indicam que o efeito de morte de cancro sulindac aumentada na presença de DCA não está relacionada com a sua actividade anti-inflamatória conhecida.

A combinação de sulindac e DCA Gerar ROS

O efeito sinérgico sobre viabilidade observada com sulindac e dicloroacetato tanto com células cancerosas SCC25 A549 e é muito semelhante aos estudos anteriores usando a combinação de sulindac e TBHP [7]. Para determinar se a produção de ROS estava envolvido no assassinato seletivo observado no presente estudo, a produção de ROS, utilizando o corante indicador H

2DCFDA (ver Métodos), foi determinada nas linhas celulares de cancro expostos a sulindac e DCA. Os resultados estão resumidos na Figura 3. A Figura 3A mostra os resultados com células de cancro A549. É evidente a partir dos resultados apresentados na Figura 3A que as células de cancro A549 não tratadas (painel A1), ou células tratadas com o sulindac sozinho (painel A2), ou DCA sozinho (painel A3), mostram apenas algumas células coradas positivamente. No entanto, quando as células foram expostas a ambos sulindac e DCA (painel A4), um grande aumento de células coradas positivamente para ROS (fluorescência verde) é vista, mostrando que a presença de ambos os sulindac e DCA resulta na geração de níveis significativos de ROS. Tal como mostrado na Figura 3B são vistas resultados semelhantes com as células cancerosas SCC25. Sulindac sozinho ou DCA em resultado um pequeno aumento na produção de células ROS (painéis B2 e B3), mas um grande aumento na produção de ROS é novamente observada quando ambas as drogas são adicionados (B4 painel). Quantificação usando SCC25 células mostra que o número de células DCF-positivo (ver Métodos) é 9-10 × mais quando as células são tratadas com o sulindac e DCA em comparação com cada um por si só as drogas (ver Figura S3A). Afigura-se a partir destes resultados e estudos anteriores de que a produção de ROS pode ser uma característica comum na morte aumentada de células cancerosas quando sulindac é usada em combinação com compostos que afectam a função mitocondrial.

Sulindac em associação com os resultados num DCA perda de membrana mitocondrial Potencial

Se a produção de ROS está envolvido na sulindac /DCA enhanced matando efeito seria de esperar que a produção de ROS pela combinação de drogas que afetam a função mitocondrial. A fim de determinar este, potencial de membrana mitocondrial foi medido usando coloração com JC-1 como descrito em Métodos. Uma perda de potencial de membrana é indicado por um aumento na fluorescência verde, tal como descrito em Métodos. Um resultado típico é resumido na Figura 4. Tanto as células cancerosas SCC25 A549 e foram expostos a sulindac e DCA, quer isoladamente ou em combinação, durante 48 horas e corados com JC-1 a fim de controlar o potencial de membrana mitocondrial. A Figura 4A mostra os resultados com a linha celular de cancro A549. Na ausência de qualquer droga, as mitocôndrias intactas aparecem e manter o seu potencial de membrana tal como indicado por pouco fluorescência verde (painel A1). Na presença de sulindac sozinho (painel A2) ou DCA sozinho (painel A3) existe um pequeno aumento na fluorescência verde, indicando alguma perda de potencial de membrana mitocondrial. No entanto, quando ambos sulindac e DCA está presente há uma perda notável do potencial de membrana mitocondrial tal como evidenciado por um grande aumento na fluorescência verde (painel A4). Observou-se o mesmo padrão quando vários campos independentes foram analisadas por microscopia fluorescente. Figura 4B mostra resultados semelhantes com as células cancerosas SCC25. Mais uma vez uma perda significativa de potencial de membrana mitocondrial foi apenas observado quando as células foram expostas a ambos sulindac e DCA (painel B4). A quantificação do efeito é mostrado na Figura S3B. Pode ser visto que a percentagem de células positivas JC1-verdes quando se utilizou a combinação de drogas é 3-4 × observado com o mesmo fármaco sozinho.

ROS estão envolvidos na morte de células cancerosas através da combinação de sulindac e DCA

Para fornecer evidência mais direta que a ROS produzidos estão envolvidos no assassinato reforçada das células cancerosas por sulindac e DCA, usamos dois captadores de ERO conhecidos, N-acetilcisteína (NAC) e Tiron ( ver Métodos). Os resultados utilizando NAC são mostrados na Figura 5. A Figura 5, painel A, mostra que tanto a DCA 20 e 30 mM, a morte aumentada de células de cancro A549 observado na presença de sulindac, é largamente evitados se NAC (2 mM) é presente durante a incubação de 48 horas. Resultados muito semelhantes são vistos com as células cancerosas SCC25, como mostrado na Figura 5, foram obtidos painel B. Resultados comparáveis ​​quando Tirón foi usada no lugar de NAC (figura S4).

sulindac e DCA morte de células do cancro envolve a morte por apoptose

os resultados anteriores (figuras 3, 4, 5) mostram que a morte aumentada das linhas de células de cancro envolve a disfunção mitocondrial, o que sugere que a morte celular por apoptose é observada. Estudos anteriores indicaram que o sulindac e seus derivados são drogas pró-apoptóticos [5], [6]. Há também relatos de que o DCA pode causar morte celular por apoptose [20], [23]. Para determinar se a morte das células cancerosas, a combinação das duas drogas, mediadas por ROS, envolve a morte apoptótica foi realizada a coloração TUNEL para medir a apoptose (ver Métodos). Várias repetições foram testados para o sulindac e DCA sozinho, ou em combinação, para as experiências de coloração TUNEL. Um resultado típico é ilustrado na Figura 6, em que os painéis de topo (Figura 6A, painéis A1-A4) representam os resultados com as células cancerígenas A549 e os painéis de fundo (Figura 6B, painéis B1-B4) representam os resultados com o cancro SCC25