Abstract

baicaleína, a fitoterapia chinesa amplamente utilizado, tem várias atividades farmacológicas. No entanto, os mecanismos precisos sobre os efeitos anti-proliferação e anti-metastáticos de baicaleína sobre câncer de vesícula biliar (GBC) continuam a ser mal compreendido. Portanto, o objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos anti-proliferação e anti-metastáticos de baicaleína eo mecanismo relacionado (s) em GBC. No presente estudo, verificou-se que o tratamento com baicaleína induziu um significativo efeito inibitório sobre a proliferação e promoveu a apoptose em GBC-SD e SGC996 células, duas linhas celulares de cancro da vesícula biliar amplamente usados. Além disso, o tratamento com baicaleína inibiu a metástase de células GBC. Além disso, demonstramos pela primeira vez que o crescimento celular inibido baicaleína GBC e metástases através de regulação negativa do nível de expressão da proteína de dedo de zinco ligado ao X (ZFX). Em conclusão, nossos estudos sugerem que baicaleína pode ser um potencial flavonóide fitoquímica para a terapêutica de GBC e ZFX pode servir como um marcador molecular ou alvo preditivo para GBC

Citation:. Liu TY, Gong W, Tan ZJ, Lu W, Wu XS, Weng H, et al. (2015) baicaleína Inibe a progressão das células câncer de vesícula biliar por downregulating ZFX. PLoS ONE 10 (1): e0114851. doi: 10.1371 /journal.pone.0114851

Editor do Academic: Seok-Geun Lee, Kyung Hee University, Coréia, República da

Recebido: 16 Janeiro, 2014; Aceito: 13 de novembro de 2014; Publicação: 24 de janeiro de 2015

Direitos de autor: © 2015 Liu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento: Este estudo foi apoiado pela National Science Foundation Natural da China (No. 81172026, 81272402, 81301816 e 81172029), pesquisa Nacional de alta Tecnologia e do Programa de Desenvolvimento (Programa 863) (No. 2012AA022606), Fundação para a investigação Interdisciplinar da Shanghai Jiao Tong University (No. YG2011ZD07) , ciência Xangai e tecnologia da Comissão inter-governamental projeto de cooperação internacional (nº 12410705900), Xangai projeto médico-orientador ciência e tecnologia comissão (nº 12401905800), Programa de Changjiang Scholars, ciência natural Fundação de Pesquisa da Shanghai Jiao Tong University School of Medicine (No. 13XJ10037), programa que Talent de Xangai, programa de Vela da comissão de ciência e tecnologia Xangai (14YF1403000) e Fundação de Pesquisa especializada para o programa de Ph.D do Ensino Superior com prioridade ao domínio do desenvolvimento (No. 20130073130014). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

câncer de vesícula biliar (GBC) é o quinto câncer mais comum do trato biliar, caracterizada pela invasão dos linfonodos cedo e metástases à distância [1-3]. Ele tende a ser um tumor agressivo que se espalha precoce e 90% dos pacientes GBC são apresentados em fase avançada, inoperável [4, 5]. carcinoma da vesícula biliar precoce é assintomática ou manifesta apenas como um desconforto abdominal. Alguns pacientes podem desenvolver os sintomas da colecistite aguda ou crónica, que é fácil ignorar ou perder. No período da tarde, os pacientes podem desenvolver dor abdominal, icterícia e angular, mas a maioria dos pacientes não têm oportunidades cirúrgicas. O prognóstico do carcinoma da vesícula biliar avançada é muito pobre [6-10], ea taxa de sobrevida em 5 anos é de apenas cerca de 5%. Até agora, a ressecção cirúrgica é o único tratamento que oferece uma esperança de cura [11]. Por isso, é muito importante para identificar biomarcadores confiáveis ​​e drogas para monitorar tanto a evolução e tratamento da doença.

baicaleína é um dos ingredientes eficazes extraídos da

labiatae

plantas

scutellaria baicalensis Georgi raiz seca de

, que tem muitos efeitos farmacológicos, tais como anti-inflamatórios, anti-bacteriana, anti-viral, anti-alérgicos, anti-oxidação e assim por diante [12-14]. Recentemente, o efeito anti-tumoral de baicaleína causou mais e mais atenção das pessoas. experiências celulares e animais demonstraram que baicaleína tinha actividade anti-tumoral forte. Por exemplo, baicaleína activado Ahr e facilitada a degradação de ciclina D1, que provoca a paragem do ciclo celular na fase G1, e induz a inibição da proliferação de células [15]. Baicaleína inibe DMBA /TPA pele induzida por tumorigenesisin ratinhos por modulação da proliferação, apoptose e inflamação [16]. Baicaleína anula espécies reactivas de oxigénio (ROS) mediada por disfunção mitocondrial durante a carcinogênese pulmonar experimental

in vivo

[17]. Baicaleína pode desempenhar um papel importante no efeito inibitório sobre a proliferação de células de cancro do ovário [18]. Devido ao seu espectro antitumoral largo, fonte de medicamento adequada, pouca toxicidade e efeitos secundários, baicaleína parece ser um marcador molecular promissora ou alvo terapêutico do cancro da vesícula biliar.

proteína de dedo de zinco ligado ao X (ZFX) é um factor de transcrição codificado pelo seu gene no cromossoma X de mamífero. O ZFX desempenha um papel chave no controlo da auto-renovação e manutenção de ambas as células estaminais embrionárias e as células-tronco hematopoiéticas [19-23]. O nível de ZFX expressão correlaciona-se com a agressividade e gravidade em muitos tipos de câncer, incluindo câncer de próstata, câncer de mama, glioma maligno humano e leucemia. Estudos prévios demonstraram que ZFX pode desempenhar um papel crítico na proliferação celular, a distribuição do ciclo celular e a apoptose em muitas células de cancro [24-29]. Nossa anteriormente resultados também descobriram que ZFX pode envolver na regulação da proliferação e migração celular no cancro da vesícula biliar [30]. Assim, o presente estudo foi desenhado para investigar os efeitos e mecanismos de baicaleína contra a proliferação de câncer de vesícula biliar celular, invasão e metástase

in vitro Comprar e em um modelo de tumor da vesícula biliar ortotópico

in vivo

. Além disso, o ZFX tinha sido demonstrada como alvo a jusante da baicaleína, que pode oferecer uma nova abordagem promissora para o tratamento eficaz de carcinoma da vesícula biliar.

Materiais e Métodos

declaração Ética

camundongos Nude (com um peso inicial de 20-22 g) foram obtidos a partir de Xangai SLAC Laboratório animal Co., Ltd. (Xangai, China). Todos os tratamentos em animais foram realizados em estrita conformidade com as diretrizes éticas internacionais e do National Institutes of Health Guide relativas ao Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. Os experimentos foram aprovados pelo Comitê Cuidado e Uso Institucional animal de Shanghai Jiao Tong University.

As linhas celulares e cultura

GBC-SD e SGC996 células foram adquiridos a partir de Xangai Cell Institute País Cell Bank . As células GBC-SD foram cultivadas em DMEM-elevado teor de glucose (Gibco, EUA) e as células foram cultivadas SGC996 em RPMI 1640 (Gibco, EUA). Todas as duas células foram suplementados com 10% de soro fetal de bovino (Gibco, EUA), 100 ug /mL de estreptomicina e 100 U /mL de penicilina (Hyclone, EUA), a 37 ° C, sob uma atmosfera de CO2 a 5,0%.

Drogas e anticorpos

o baicaleína foi adquirido de Sigma-Aldrich (St. Louis, EUA), dissolvido no seio de DMSO como um estoque de concentração de 100 mmol /L, e armazenado no escuro a -20 ° C. FIG. 1 mostra a estrutura química de baicaleína. As concentrações finais baicaleína utilizados para as diferentes experiências foram preparadas por diluição da solução de reserva com DMEM-elevado teor de glucose ou RPMI1640. Os anticorpos utilizados para a transferência de Western foram como se segue: de coelho anti-caspase-3, anti-Bcl-2, anti-Bax, anti-PARP, anti-p53, anti-cyclinA, anti-cyclinB1, anti-cyclinD1, anti-MMP2 , anti-MMP9, anti-ZFX e de ratinho anti-β-actina. Todos os anticorpos foram adquiridos da Cell Signaling Technology.

A fórmula molecular de baicaleína C15H10O5and é o seu peso molecular é 270,24.

3- (4, 5-dimetiltiazol-2-il ) -2, 5 difenil tetrazólio (MTT)

sensibilidade ao fármaco foi determinada utilizando o ensaio de MTT. Resumidamente, as células foram tripsinizadas e plaqueadas em placas de 96 poços (Corning, EUA) a uma densidade de 5 x 10

3 células por poço. As células foram cultivadas durante a noite e, em seguida reabastecido com meio fresco contendo várias concentrações (0, 15, 30, 60, 120 e 240 pmol /l) de baicaleína para 24, 48, e 72 h. Em seguida, 20 ul de MTT (Sigma-Aldrich) dissolvida em PBS a 5 mg /ml foi adicionada directamente a todos os poços e as placas foram incubadas durante 4 h a 37 ° C. Os cristais de formazano formados que foram dissolvidos em 100 ul de DMSO após remoção do sobrenadante. A densidade óptica foi registada a 490 nm num leitor de microplacas (Bio-Tek, EUA). Os resultados representam a média de 3 experiências independentes realizadas ao longo de vários dias. A percentagem de viabilidade celular foi calculada como se segue:

ensaio de formação de colónias

As células na fase de crescimento logarítmico foram digeridos em uma suspensão de uma única célula, com uma solução de tripsina-EDTA (Gibco, EUA) , e depois 2 ml da suspensão de células foram semeadas em placas de 6 poços (Corning, EUA) a uma densidade de 200 células /ml. Após a adesão, as células foram tratadas com baicaleína (0,6,12, e 24μmol /L) durante 48 h e, em seguida, cultivadas durante 15 dias. Em seguida, as células foram fixadas com formalina a 10% e coradas com violeta de cristal a 0,1% (Sigma-Aldrich). Após lavagem, as placas foram secas ao ar, e as imagens digitais foram tomadas de clones individuais coradas observadas sob um microscópio (Leica, Alemanha). Os resultados representam a média de 3 experiências independentes feito ao longo de vários dias.

análise do ciclo celular

As células foram tratadas com baicaleína (0,30,60 e 120μmol /L) durante 48 h. Em seguida, as células foram recolhidas e fixadas com etanol frio a 70% e armazenadas a -20 ° C. As células foram então lavadas e ressuspensas em PBS frio e incubaram-se a 37 ° C durante 30 min com 10 mg /ml de RNase e 1 mg /ml de iodeto de propídio (Sigma-Aldrich). A análise do conteúdo de ADN foi realizada por citometria de fluxo (BD, San Diego, EUA). A percentagem de células nas diferentes fases do ciclo celular foi determinada utilizando o software de aquisição celular Quest (BD Biosciences).

análise de citometria de fluxo de apoptose celular

O ensaio de iodeto de anexina V /propídio foi efectuada de acordo com a recomendação do fabricante (Invitrogen, EUA). Resumidamente, as células foram plaqueadas em placas de 6 poços (Corning, EUA) e incubados durante 48 h com baicaleína (0,30,60, e 120μmol /l). Em resumo, as células foram recolhidas e em seguida, foram lavadas com PBS frio, centrifugadas, ressuspensas em 100 ul de tampão de ligação contendo 2.5ul FITCconjugatedannexin-V e 1UL 100 ug /ml de PI e incubou-se durante 15 minutos à temperatura ambiente no escuro. Um total de pelo menos 10 000 eventos foram coletadas e analisadas por citometria de fluxo (BD, San Diego, EUA).

Detecção de apoptose morfológica com Hoechst 33342 coloração

Após o tratamento com baicaleína (0 , 30,60, e 120μmol /L) durante 48 h, as células GBC-SD foram lavadas com PBS e fixadas com metanol: ácido acético (3: 1) durante 15 min à temperatura ambiente. As células fixadas foram lavadas com PBS e coradas com 5 ug /ml de Hoechst 33342 mancha durante 10 min. Mudanças nos núcleos das células após coloração com Hoechst 33342 foram observados usando um microscópio de fluorescência (Leica, Alemanha).

A migração celular e invasão

GBC-SD3 × 10

4 células e SGC996 1 × 10

5 células foram colocadas sobre a membrana não revestido na câmara de topo (Corning, EUA). As células foram plaqueadas em meio sem soro. Meio contendo 10% de FBS foi colocada na câmara inferior para actuar como um quimioatractor. Após a adesão, as células foram tratadas com várias concentrações de baicaleína (0, 7,5, 15, 30, 60 umol /L) em meio isento de soro. As células foram incubadas durante 24 horas; As células que não invadem através dos poros foram removidos utilizando um cotonete. As células que migram através de membranas de policarbonato 8,0 uM para a superfície inferior foram fixadas com metanol a 10% e coradas com violeta de cristal a 0,1%. A migração de células foram quantificados por contagem de células coradas sob um microscópio (200 ×) em cinco campos aleatórios para cada cavidade. Cada experiência foi realizada em triplicado. ensaios de invasão foram realizados de um modo semelhante aos ensaios de migração, excepto que as pastilhas foram pré-revestidos com Matrigel (BD, EUA).

In vitro

GBC células-SD ensaio

de cura de feridas foram cultivadas em placas de 6 poços a uma densidade de 1,5 x 10

5 /mL e cultivadas até à confluência. Ferida foi criado por raspagem monocamadas de células confluentes com uma ponta de pipeta. As células foram extensivamente lavadas com meio para remover os restos celulares antes do tratamento com diferentes concentrações (0, 7,5, 15, e 30μmol /l) de baicaleína em FBS a condição privados. As células foram deixadas migrar durante 24 h e as imagens das células que migraram foram feitas usando o microscópio invertido (Leica, Alemanha).

A transcrição reversa e reacção em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (qPCR)

quantitativa da PCR foi utilizada para quantificar a expressão de ARNm nos grupos experimentais. Resumidamente, as células foram tratadas com GBC baicaleína (15, 30, 60 e 120 nmol /L) durante 48 h. O ARN total foi isolado utilizando o kit de ARN fácil (Invitrogen, EUA). O ADNc da primeira cadeia foi sintetizado a partir de ARN total utilizando um 500ng PrimeScript Transcriptase Reversa (Takara, Japão). Quantitative PCR em tempo real foi realizada em um volume de reacção de 20 uL de ADNc incluindo 2 ul. As sequências dos iniciadores foram os seguintes: MMP9 (forward-5′-TGT ACC GCT ATG GTT ACA CTC G-3 ‘, inverter-5′-GGC AGG GAC AGT TGC TTC T-3′), MMP2 (forward-5’- AAC TAC GAT GAT GAC CGC AAG ‘; AGA CGG AAG TTC TTG GTG -3-5′- GAC reversa “), ZFX (forward-5′-TGT GGA GTG TGG TAA GGG TTT T’; inverter-5′-ACT GGT GTG TTT TGC TTT CTT G-3 ‘) e GAPDH (forward-5′-AAG CTC ATT TCC TGG TAT RPDC-3′, inverter-5’-TCT TAC TCC TTG GAG GCC ATGT-3 ‘). As condições de PCR foram as seguintes: 95 ° C durante 30 segundos seguido por 40 ciclos a 95 ° C durante 5 seg, 60 ° C durante 34 seg. desidrogenase de gliceraldeído-3-fosfato (GAPDH) foi usado como um gene de referência interno para normalizar a expressão de genes apoptóticos. A quantificação relativa de genes relacionados com a apoptose foi analisada pelo método de ciclo limiar comparativa (Ct). Para cada amostra, o valor Ct do gene apoptótico foi normalizado utilizando a seguinte fórmula: Ct = ΔCt (genes apoptóticos) – Ct (GAPDH). Para determinar os níveis de expressão relativa, foi utilizada a seguinte fórmula: = ΔΔCt ΔCt (tratado) – ΔCt (controlo). O valor foi utilizada para traçar a expressão de genes apoptóticos usando a fórmula 2-ΔΔCt.

análise Western blot

As células foram tratadas com várias concentrações de baicaleína (0, 15, 30, 60 e 120 umol /l) durante 48 h e, em seguida lisadas num tampão de amostra, seguido de desnaturação. A concentração total de proteínas dos extractos celulares foi determinada usando o sistema de ensaio de ácido bicinconínico (Beyotime, China) com BSA como padrão. Quantidades iguais de proteína (80 ug por pista) de proteínas totais foram separadas por SDS-PAGE (8%, 12% de gel) sob condições redutoras. As proteínas foram então electroforeticamente transferidas para membranas de nitrocelulose. As membranas foram bloqueadas com 5% de leite desnatado e incubadas withanti-caspase-3, anti-Bcl-2, anti-Bax, anti-PARP, anti-p53, anti-cyclinA, anti-cyclinB1, anti-cyclinD1, anti- MMP2, MMP9 anti-, anticorpos anti-ZFX, respectivamente (1: 1000; Cell Signaling Technology), a 4 ° C durante a noite. Isto foi seguido por uma incubação com o anticorpo secundário de cabra anti-coelho /anti-ratinho conjugado com peroxidase de rábano (1: 5000; Abcam). Um carregamento igual de cada pista foi avaliada por imunotransf erência as mesmas membranas com anticorpos de p-actina após o desprendimento de anticorpos primários anteriores. As fotografias foram tiradas e as densidades ópticas das bandas foram digitalizados e quantificados com o Doc Gel de 2000 (BioRad, EUA).

In vivo tumor estudo xenotransplante

Seis semanas de idade do sexo masculino atímicos nu camundongos (com um peso inicial de 20-22 g) foram obtidos a partir de Xangai SLAC Laboratório animal Co., Ltd. (Xangai, China) e alojados em condições livres de patógenos com temperatura controlada (22 ° C), umidade, e uma 12 luz hora /ciclo escuro. Alimentos e água foram fornecidas à vontade durante todo o experimento. SGC996 células foram usadas para xenoenxertos de tumor e crescidas em cultura e, em seguida, isolada por tripsinização, lavadas e ressuspensas em RPMI 1640 isento de soro. Cada um dos ratinhos nus atímicos foi injectada subcutaneamente a 1 × 10

6 de células volume de ina de 100ul na área flanco direito para iniciar o crescimento do tumor. Após SGC996 inoculação, os ratos foram divididos aleatoriamente em dois grupos (5 ratos /grupo). Um grupo foi tratado com veículo (10% de DMSO e 90% de propileno glicol) por via intraperitoneal, e o outro grupo received0.4mg /rato por via intraperitoneal durante baicaleína 9 vezes. No 21 ° dia, os animais foram sacrificados, e o tecido de tumor foi removido e pesado.

A análise estatística

Todos os valores são expressos como a média ± DP e foram analisados ​​pela Student

t

-test utilizando software SPSS versão 13.0. A

p

-valor inferior a 0,05 foi considerado significativo.

Resultados

Efeito da baicaleína sobre a viabilidade e a apoptose de células de carcinoma da vesícula biliar in vitro e in vivo

os efeitos de baicaleína sobre o crescimento de GBC-SD humana e SGC996, duas linhas de células mais amplamente utilizados de cancro da vesícula biliar,

in vitro

foram testados. Como mostrado na Fig. 2 (A), após um tratamento de 24, 48, e 72 h, baicaleína induziu uma dose e uma diminuição dependente do tempo na viabilidade de ambas GBC-SD e SGC996 células, tal como analisado pelo ensaio de MTT. Como mostrado na Fig. 2 (B) (C), a capacidade de GBC-SD e SGC996 células para formar colónias na presença de baicaleína foi detectada com o ensaio de formação de colónias de placa plana. O número de colónias indicou que tinha baicaleína induziu uma redução dependente da dose na capacidade de formação de colónias. Os resultados suportam o fato de que baicaleína podem exercer uma influência significativa sobre a proliferação GBC-SD e as células SGC996. Para confirmar ainda mais o efeito de baicaleína

in vivo

, testamos a tumorigenicidade de células de carcinoma da vesícula biliar, utilizando estudo de xenotransplante tumoral ratinhos nus. Como mostrado na Fig. 2 (D), o tamanho do tumor no grupo de tratamento baicaleína era menor do que a do grupo de controlo.

(A) GBC-SD e SGC996 células foram tratadas com concentrações variáveis ​​de baicaleína, e a proliferação das células eram determinado pelo ensaio de MTT nos dias 1, 2, e 3. Cada valor representa a média ± DP (n = 3). (B e C) baicaleína suprimida a formação de colónias de GBC-SD e SGC996 células. As células foram tratadas com baicaleína (6, 12, e 24 pmol /L) e foram deixados a formar colónias em meio fresco durante 14 dias. A influência de colónias (média ± DP, n = 3) na formação de colónias são mostrados. tumores de xenoenxertos tratados com baicaleína (D) foram muito menores do que os tumores de controlo. (E) O peso dos tumores revelou que o crescimento do tumor de xenoenxerto em ratinhos nus foi significativamente mais lento nos tumores tratados nus-baicaleína do que os tumores de controlo. Os resultados apresentados são representativos de pelo menos três experiências independentes. * P 0,05, ** P 0,01, *** P 0,001.

Para avaliar se baicaleína afeta progressão do ciclo celular, análise de fluxo de citometria foi realizado. Os resultados mostraram uma diminuição significativa no número de células na fase G0 /G1 proliferativa e um aumento significativo no número de células na fase S, após 48 h de tratamento com baicaleína (Fig. 3 (A)). CyclinA, um /proteína promoção transição G1 S, foi dependente da dose, aumentou baicaleína tratamento. Ele pode ser a razão da apreensão fase S induzida por baicaleína. CyclinB1 e cyclinD1 que representam S /G2 e processo de transição M /G1, respectivamente, foram dependente da dose diminuiu baicaleína tratamento (Fig. 3 (B) e S5 Fig.). Estes resultados indicam que as detenções baicaleína o ciclo celular na fase S.

(A) células foram tratadas com 30, 60 ou 120 nmol /L durante 48 h baicaleína e o teor de ADN foi analisada por citometria de fluxo. A percentagem de células em G1, S e G2 /M fases do ciclo celular estão apresentados. Estes resultados foram de uma experiência representativa de 3 ensaios independentes. (B) Expressão de ciclina B e ciclina D em células GBC-SD e ciclina A e ciclina D em células SGC996 foram significativamente alterados após tratamento com baicaleína em comparação com o controlo. Os resultados apresentados são representativos de pelo menos três experiências independentes. * P 0,05, ** P 0,01, *** P 0,001.

Para confirmar ainda mais estes resultados, foram avaliados os efeitos de baicaleína sobre a apoptose em GBC-SD e SGC996 células usando anexina V-FITC e de propídio coloração com iodeto. Tal como avaliado por citometria de fluxo e mostrado na Fig. 4 (B), um aumento dependente da dose marcada em ambas as fases precoce e tardia da apoptose era óbvia em GBC-SD e SGC996 células após tratamento baicaleína comparação com células de controlo.

(A) modificações morfológicas apoptóticas tais morfologia anormal como nuclear, redução no número de células com a formação de corpos apoptóticos e encolhimento celular, induzida por baicaleína (30,60 e /L 120 nmol) de tratamento durante 48 h, foram observadas por coloração de Hoechst 33342 em GBC-SD e as linhas celulares SGC996 . (B) As células foram incubadas com baicaleína (30,60 e 120 nmol /L) durante 48 h, seguido de coloração com anexina-V /PI. apoptose celular foi estimada pela citometria de fluxo. (C) baicaleína induz a activação de proteínas relacionadas com a apoptose em células GBC-SD e SGC996. Após o tratamento com baicaleína (0, 15, 30, 60, e 120μmol /L) durante 48 h, os lisados ​​celulares foram preparados e análise Western Blot foi realizada contra Bcl-2, Bax, pró-caspase-3, P53 e PARP. p-actina foi utilizado como um controlo de carga. Os resultados apresentados são representativos de pelo menos três experiências independentes. * P 0,05, ** P 0,01, *** P 0,001.

alterações morfológicas nas células apoptóticas foram revelados pela coloração de Hoechst 33342, como se mostra na fig. 4 (A). No tratada GBC-SD e SGC996 células, os núcleos foram corados fraco azul homogênea, enquanto que no grupo tratado com baicaleína, condensação da cromatina brilhante e fragmentação nuclear foram observadas.

Efeito da baicaleína sobre os fatores relacionados à apoptose

Para identificar quais proteínas eram principalmente envolvidos no processo de apoptose induzida por baicaleína, analisamos uma série de fatores relacionados à apoptose por western blot. Como ilustrado na Fig. 4 (C), pró-caspase-3 e p53 foram regulados negativamente por baicaleína tratamento. PARP clivada foi significativamente aumentada. nível de proteína de Bax foi regulado para cima, enquanto que o nível de proteína de Bcl-2 foi significativamente diminuída.

Efeito do baicaleína sobre a metástase de células do carcinoma da vesícula biliar

Uma vez que a migração de células do carcinoma da vesícula biliar e invasão estão associados com a metástase, utilizou-se vários ensaios celulares para avaliar os efeitos de baicaleína no potencial metastático de células de carcinoma da vesícula biliar. Para examinar o efeito de baicaleína sobre a mobilidade de células de cancro, foi realizado ensaio de migração de células usando GBC-SD e SGC996. Como mostrado na Fig. 5 (A), a migração celular foi inibida por tratamento baicaleína. Além disso realizamos ferida ensaio cura para confirmar ainda mais o efeito de inibição da baicaleína na migração celular. Como mostrado na Fig. 5 (C), baicaleína conspicuamente inibiu a migração de células GBC-SD de um modo dependente da dose. Para explorar ainda mais se a actividade invasiva foi afectado em resposta a baicaleína, foi examinada a actividade invasiva, utilizando uma membrana revestida com matrigel. Os resultados mostraram que baicaleína dramaticamente reduzido o número de células invadidas e esta inibição ocorreu de forma dependente da concentração (Fig. 5 (B)). Além disso, a capacidade de proliferação e de metástases foram ainda mais potenciada nas células tratadas tanto com ARNsi contra ZFX e baicaleína (S4 Fig.).

As células foram tratadas com 7,5, 15, 30 e 60μmol /L baicaleína durante 12 h antes para a migração (a) ou ensaio de invasão (B). (C) as monocamadas de células foram feridos por raspagem com uma ponta de pipeta de 200 uL. A área de ocupação em monocamada de células GBC-SD tratados com baicaleína foi dependente da dose diminuiu 24 horas após o início. Baicaleína afecta a expressão de metalopeptidases de matriz (MMPs). (D) A expressão de ARNm de MMP-2 e MMP-9 foi detectado por qPCR depois tratada com baicaleína durante 48 h. (E) A expressão da proteína de MMP-2 e MMP-9 foi detectado por Western blot depois tratada com baicaleína durante 48 h. Os resultados apresentados são representativos de pelo menos três experiências independentes. * P 0,05, ** P 0,01, *** P 0,001.

MMPs são conhecidas por serem cruciais para degradar componentes da matriz extracelular e para a promoção do tumor invasão celular

in vitro

e

in vivo

. Após o tratamento com diferentes concentrações de baicaleína durante 48 h em GBC-SD e SGC996 células, quantitativa PCR em tempo real e análise de Western blot mostrou que a expressão de ARNm e proteína de MMP-9 e MMP-2 diminuiu significativamente em comparação com o grupo de controlo em um modo dependente da dose (Figura 5 (D . e)).

baicaleína regulada para baixo do dedo de zinco X-cromossómico (ZFX) proteína e a expressão de ARNm em GBC-SD e SGC996 células

O nosso estudo anterior descobriu que knock-down de ZFX poderia inibir a proliferação celular GBC-SD e migração. Portanto, estamos curiosos para saber se o efeito de baicaleína em células de carcinoma da vesícula biliar está ligado a expressão ZFX. Western Blot e análise quantitativa em tempo real de PCR revelou que a expressão da proteína e ARNm de ZFX foi dependente da dose (Figura 6 (A . B)) diminuíram baicaleína tratamento em GBC-SD e SGC996 células e a translocação de ZFX em núcleos foi suprimido por tratamento baicaleína (S2 Fig.). O efeito da baicaleína na expressão ZFX foi específico porque o nível de NF-kB e STAT3 expressão não foram afectados por esta molécula (S1 Fig.).

(A e B) expressão ZFX em GBC-SD e SGC996 As células induzidas por baicaleína. As células foram tratadas com 0, 15, 30, 60 e 120 nmol /L durante 48 h baicaleína, então o nível de expressão da proteína e ARNm de ZFX foi determinada por Western blot (A) e de qPCR (B). As células (C e D) foram transfectadas com o plasmídeo ZFX-GFP e GFP plasmídeo, respectivamente. 72 horas após a transfecção, as células foram tratadas com 0, 7,5, 15, 30 e 60 umol /L baicaleína durante 72 h. ZFX-GFP bloqueou significativamente a inibição da proliferação de células GBC-SD por baicaleína utilizando o ensaio MTT (C). ZFX-GFP bloqueou significativamente a indução de apoptose de células GBC-SD por baicaleína estimada pela citometria de fluxo (D). (E e F) 72 horas após a transfecção, as células foram tratadas com 60 pmol /L durante 24 h baicaleína. ZFX-GFP bloqueou significativamente o efeito anti-migração e invasão de células GBC-SD por baicaleína. A migração celular foi estimada pelo ensaio de cicatrização da ferida (E) e a invasão de células foi estimado por ensaio Transwell (F). (L) ZFX-GFP impediu a expressão de PARP, a inibição de MMP2, MMP9 e supra-regulados a proporção de Bcl-2 /Bax em resposta a baicaleína. 72 horas após a transfecção, as células foram tratadas com 60 pmol /L para os níveis de proteína baicaleína 48h.The de PARP, MMP-2, MMP-9, Bcl2, Bax e ZFX foram determinados por Western blot. Os resultados apresentados são representativos de pelo menos três experiências independentes. * P 0,05, ** P 0,01, *** P 0,001.

superexpressão do ZFX aliviado o efeito viabilidade, apoptose e metástase de baicaleína em células GBC-SD

Além disso, a sobre-expressão de ZFX (S3 Fig.) Resultou em bloqueando parcialmente de baicaleína induzida proliferação e apoptose em células GBC-SD (Figura 6 (C) . (D)). Por conseguinte, a inibição da migração (Fig. 6E) e invasão (Fig. 6F) capacidades de células por baicaleína foram notavelmente revertido por sobre-expressão de ZFX. Por outro lado, a sobre-expressão de ZFX inibiu significativamente a activação induzida baicaleína da PARP e um aumento da proporção de Bcl-2 /Bax. Além disso, a sobre-expressão de ZFX também resultou no bloqueio da inibição induzida baicaleína de MMP-2 e MMP-9 (Fig. 6 (g)). Assim, os dados sugerem que a proteína ZFX pode participar de apoptose celular induzida por baicaleína e anti-metástases em células de carcinoma da vesícula biliar.

Discussão

O nosso estudo fornece algumas novas informações sobre baicaleína utilizado na A terapia anti-câncer. O efeito anti-cancro de baicaleína foi confirmada em muitos outros tipos de cancro, mas o anti-proliferação e efeito metastático e o mecanismo relacionado (s) nas células GBC não é clara. Aqui, nós mostramos os mecanismos bioquímicos e moleculares da apoptose e indução anti-metastáticos por baicaleína.

Em primeiro lugar, verificou-se que baicaleína pode desempenhar um papel importante na GBC proliferação celular, ciclo celular e apoptose

em vitro

e

in vivo

. O tratamento com baicaleína resultou numa diminuição acentuada na viabilidade das células GBC-SD e SGC996 cultivadas e no número de colónias formadas que estas células. Para o nosso conhecimento, este é o primeiro estudo a avaliar o papel potencial da baicaleína em

in vivo

modelo animal de xenotransplante. foi observada uma redução significativa da massa tumoral após um tratamento de três semanas. O efeito

in vivo

de baicaleína em tumores GBC apoiar fortemente baicaleína como um potencial novo medicamento para o tratamento anti-GBC.

O efeito da baicaleína na paragem do ciclo celular e na indução de apoptose em GBC também foi avaliada células. Acredita-se que os efeitos anti-tumorais de baicaleína para ser usado por influenciar a detenção do ciclo celular ou por interacção com as proteínas relacionadas com o ciclo celular [31]. Em nosso estudo, baicaleína também induziu parada do ciclo celular fase S e inibição da ciclina B1, ciclina D1, promoção da ciclina A em GBC-SD e SGC996 células. Uma vez que a apoptose é considerada como um mecanismo importante na inibição do cancro, foram realizados hoechst33342 ensaio de coloração, anexina V /ensaio de PI, e detecção da expressão da proteína relacionada com apoptose para explorar ainda mais o mecanismo de apoptose induzida por baicaleína. Baicaleína notavelmente induziu a apoptose de ambos GBC-SD e SGC996 células, como demonstrado por alterações na morfologia nuclear, um aumento da percentagem de anexina células V-coloração, o qual foi adicionalmente confirmada por expressão aumentada de clivagem de pró-caspase-3, clivagem de PARP, Bax e redução da expressão de Bcl-2 e p53. Muitos destes genes que estão relacionados com a via de apoptose mitocondrial. A clivagem de pró-caspase-3, a clivagem de PARP e, finalmente, a degradação do ADN. proteínas Bax e Bcl-2, que regulam a mudança essencial na permeabilidade da membrana mitocondrial para a apoptose [32]. A partir desses dados, pode-se concluir que induziu apoptose de células baicaleína GBC pela ativação da via mitocondrial intrínseco.

Além de proliferação celular, migração e capacidade invasiva de células também são duas das características mais importantes do comportamento de células malignas. Para elucidar o efeito de baicaleína na motilidade celular, a migração celular e invasão foram determinados por um ensaio de migração e cicatrização de feridas Transwell ensaio, respectivamente. A partir destes dados, descobrimos que baicaleína poderia suprimir a capacidade de migração e invasão de GBC-SD e SGC996 células. As MMPs são uma superfamília altamente regulado de endopeptidases dependentes do zinco que são causalmente associada com o desenvolvimento e a progressão de tumores [33].