Abstract

câncer peniano (PECA) é uma entidade tumor relativamente raro, mas possui taxas de morbidade e mortalidade, especialmente nos países em desenvolvimento. Até à data, as vias de sinalização patogénicos concretas e máquinas de núcleo envolvidos na tumorigénese e na progressão da PECA permanecem por ser elucidados. Vários estudos sugeriram miRNAs, que modulam a expressão do gene ao nível pós-transcricional, eram frequentemente mis-regulado e expressão aberrante em cancros humanos. No entanto, o perfil de miARN no PECA humano não foi relatada antes. No presente estudo, o perfil de miRNA foi obtido a partir de 10 fresco penianas tecidos cancerosos e combinados tecidos não cancerosos adjacentes através de sequenciamento de última geração. Como resultado, um total de 751 e 806 miARNs anotados foram identificados em tecidos normais e cancerosos penianas, respectivamente. Entre os quais, foram identificados 56 miRNAs com significativamente diferentes níveis de expressão entre os tecidos emparelhados. Posteriormente, vários miRNAs anotados foram selecionados aleatoriamente e validado utilizando quantitativa PCR em tempo real. Em comparação com as publicações anteriores sobre a expressão miRNAs alterados em vários tipos de câncer e cânceres especialmente geniturinário (próstata, bexiga, rim, testículos), o mais maioria dos miRNAs desregulados mostrou o padrão de expressão semelhante em câncer de pênis. Além disso, os bioinformática análises sugeriu que os genes-alvo putativas de miARNs diferencialmente expressos entre os tecidos penianas normais cancerosas e combinados foram firmemente associada a junção de células, proliferação, crescimento, bem como a instabilidade genómica e assim por diante, através da modulação de Wnt, MAPK, p53, PI3K -Akt, vias Notch e TGF-β de sinalização, que foram todos bem estabelecidos para participar na iniciação e progressão do câncer. Nosso trabalho apresenta uma visão global da diferencialmente expressos miRNAs e redes potencialmente reguladoras de seus genes-alvo para esclarecer a transformação patogênica do pénis normal a Peca, que recurso de investigação também fornece novos insights sobre futuras investigações destinadas a explorar os mecanismos em profundidade de miRNAs e outros pequenos RNAs incluindo piRNAs na regulação carcinogênese peniana e theragnosis específica do destino eficaz

Citation:. Zhang L, Wei P, Shen X, Y Zhang, Xu B, Zhou J, et al. Expression Profile (2015) MicroRNA no cancro do pénis revelado pelo Next-Generation Sequencing pequeno RNA. PLoS ONE 10 (7): e0131336. doi: 10.1371 /journal.pone.0131336

editor: Yu Xue, Huazhong Universidade de Ciência e Tecnologia, CHINA

Recebido: 10 de fevereiro de 2015; Aceito: 01 de junho de 2015; Publicação: 09 de julho de 2015

Direitos de autor: © 2015 Zhang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Toda a sequenciação crua arquivos estão disponíveis no banco de dados ArrayExpress (número de acesso: E-MTAB-3087)

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pela National Science Foundation Natural da China (No.81401518, No. 31.430.028, http: //www.nsfc.gov.cn/) (LZ); a National Science Foundation Natural da China (No. 81.170.698, No. 81.370.856, https://www.nsfc.gov.cn/) (CZL); a National Science Foundation Natural da China (No. 31.370.983, https://www.nsfc.gov.cn/) (DHZ); Anhui Provincial Natural Science Foundation (No.1408085QH180, https://www.ahkjt.gov.cn/) (LZ), a Clínica-chave Assuntos Programa do Ministério da Saúde Pública da China (Urology, http: //www.nhfpc .gov.cn /) (CZL), o projeto de cultivo para NSFC na Universidade de Medicina de Anhui (No. 2013KJ14, https://www.ayfy.com) (LZ) eo projeto chave do Ministério da Educação da China (No. 212080, https://www.moe.edu.cn/) (DHZ). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declaram que não há interesses concorrentes existem

Introdução

a investigação molecular surgiu como uma ferramenta promissora para a compreensão aprofundada sobre a carcinogênese, com seus componentes celulares, caminhos e metas farmacêuticas na terapêutica do câncer sinalização. Infelizmente, o progresso notável não abrangeu todos os tipos de câncer. câncer de pênis (PECA) é uma entidade tumor tais relativamente rara nos países desenvolvidos do mundo, apenas cerca de 1.640 casos de câncer de pênis foram recentemente diagnosticados e 320 mortes relacionadas ao câncer foram estimadas em 2014 nos Estados Unidos a nível nacional [1]. Considerando que as taxas de morbidade e mortalidade de PECA, na maioria dos países em desenvolvimento foram consideravelmente maiores, representando um aumento de 3-10 vezes às taxas dos países desenvolvidos nas últimas décadas [2]. câncer de pênis está associado a vários fatores de risco estabelecidos, como o papilomavírus humano (HPV), falta de higiene, fimose com inflamação crônica, tabagismo e algumas alternâncias epigenéticas, incluindo modificações das histonas metilação [3,4]. Além disso, alguns genes durante a carcinogénese, da proliferação, invasão e metástase de PECA foram identificados. Por exemplo, p53, 2A inibidor de quinase dependente de ciclina (CDKN2A) e metalopeptidase de matriz 9 (MMP-9) foram confirmados como desempenham papéis cruciais na PECA rotas cancerígenas e epitelial-mesenquimal transição (EMT), respectivamente [5]. No entanto, como mencionado acima, a pesquisa abrangente adicional para elucidar os mecanismos exatos de alterações moleculares subjacentes à iniciação, desenvolvimento e progressão do PECA é imperativo para nós para explorar novas e preventiva, a detecção precoce valioso, terapias direcionadas e previsão prognóstico abordagens para este geniturinário desordem.

microRNAs Adultos (miRNAs) são um grupo de expresso endogenamente, evolutivamente conservada, de cadeia simples e não-codificante pequenos RNAs (smRNAs, cerca de 19-23 nucleótidos de comprimento) que atuam como reguladores pós-transcricional de gene expressão em uma ampla variedade de organismos [6]. Até à data, mais de 1000 miARNs humanos foram identificados e observações tremendas foram alcançados em ligar os níveis alternativos e expressão aberrante de miARNs com a iniciação e progressão de doenças humanas, especialmente para vários tipos de tipos de cancro [7-9], quanto não menos do que a metade miRNA genes estão localizados em regiões associadas a cancro ou sítios frágeis em todo o genoma [10]. miARN desregulação na biologia do tumor foi observada pela primeira vez no miARN-15a e miARN-16-1 dentro locus de 13q14, ambos os dois miARNs que segmentados linfoma de células B 2 (BCL-2) mARN foram eliminados ou regulados negativamente na maior parte do crónica casos de leucemia linfocitica (CLL), resultando em tumorigénese pela redução de actividades apoptóticas [11]. Atualmente, ele tem sido amplamente aceito que distintos tipos de câncer, estágios, graus de regressão ou estados de diferenciação pode possuir perfis de expressão miRNA individuais, que detêm grande promessa em atuar biomarcadores moleculares como confiável para o diagnóstico de câncer e também podem revelar novas vias de sinalização patogênico correlacionados com a carcinogênese e progressão para a terapêutica alvo molecular [12]. Desde então, uma variedade de técnicas têm sido introduzidos para conduzir miARN perfis. Por exemplo, quantitativa de transcrição reversa-reacção em cadeia da polimerase (qRT-PCR) ensaios, análises e microarranjos de Northern blotting já sido extensivamente utilizado para estudos de perfis de miARN [13]. Recentemente, uma tecnologia recém-desenvolvida chamada próxima geração seqüenciamento (NGS) tem atraído muita atenção no RNA pequeno (smRNA) profiling devido às suas vantagens únicas em especificidade do teste, sensibilidade e romance identificação smRNAs [14-16]. Através do qual, podemos detectar quase todos os smRNAs como miRNAs conhecidos e novos, mesmo com extremamente baixa abundância, pequenos RNAs citoplasmáticos (scRNAs), RNAs nucleares (snRNAs), RNAs nucleolares (snoRNAs) e RNAs-interagindo Piwi (piRNAs) [17] .

no presente estudo, objetivou-se a preencher a lacuna de informações sobre o perfil de miRNA em câncer de pênis humano e avaliou uma possível correlação entre os níveis de expressão miRNA diferenciados com tumorigênese e progressão. Ao aplicar a tecnologia (NGS) sequenciamento de última geração, realizamos smRNA-seq por dez emparelhado espécimes fresco congelado de carcinoma de células escamosas do pênis e combinados histologicamente tecidos normais peniana que eram adjacente ao câncer. Nós têm abordado o conhecimento geral dos perfis de expressão de miARN em ambos os tecidos do pénis emparelhados e, especialmente, descobriram que um certo número de miARNs foram expressas de forma aberrante em cancros penianos em comparação com os tecidos normais correspondentes. Notavelmente, a análise ontologia gene (GO) de potenciais genes de miARN alvo indicou que miARNs desreguladas em processos biológicos enriquecido, funções moleculares e componentes celulares foram envolvidos no crescimento celular, forma da célula, axonogenesis, regulação da actividade de proteínas e angiogénese, que em conjunto participaram no transformação de células normais em lesões malignas. Além disso, a enciclopédia kyoto de genes e análise de genomas (KEGG) via enriquecida com sucesso várias vias firmemente associados ao câncer que foram todos bem documentados para participar na iniciação do câncer, desenvolvimento, invasão, metástase e terapia também promissor. Nossos resultados fornecem um recurso de pesquisa valiosa para elucidar ainda mais as funções reguladoras dos miRNAs na tumorigênese peniana e progressão, o que também é uma grande promessa no sentido de facilitar o desenvolvimento de novos biomarcadores de diagnóstico e estratégias terapêuticas eficazes para o PECA.

Materiais e Métodos

Ética declaração

consentimentos informados foi assinada por todos os treze próprios pacientes com carcinoma epidermóide de pênis que tinham recebido penectomy parcial ea investigação foi avaliada cuidadosamente e em seguida aprovados estritamente de acordo com os regulamentos por parte do Comitês de ética em Pesquisa em Seres Humanos do primeiro Hospital Afiliado da Universidade de Medicina de Anhui (Aprovação No. PJ20140906).

amostras clínicas coleção

câncer

peniana e espécimes não malignas combinados foram coletados a partir de um total de 13 pacientes que se submeteram penectomy parcial 2013-2015 no Departamento de Urologia, o primeiro Hospital Afiliado da Universidade de Medicina de Anhui. Imediatamente após a cirurgia, e tecidos cancerosos penianas normais combinados foram armazenados separadamente em solução RNAlater (Ambion, EUA) e congelou-se a -80 ° C de acordo com um procedimento de operação padrão (SOP) guiado pela uropathologist. Resumidamente, foram incluídos tecidos de tumor, que contenham mais de 80% de lesões tumorais para análises posteriores. Correspondentemente, os tecidos adjacentes normais correspondentes foram obtidos a partir de onde, pelo menos, 1,0 cm para além dos tecidos tumorais visíveis no pénis. Cada tecidos cancerosos e não malignas foram diagnosticadas histopatologicamente pela hematoxilina-eosina (HE) -staining.

SmRNA construção da biblioteca e profunda sequenciamento

O RNA total foi coletado de dez pares de peniana fresco congelado cancros e combinados tecidos do pénis histologicamente normais usando o reagente TRIzol (Life Technologies, EUA). ARN qualificada com razão A260 /A280 mais do que 1,8 foi posteriormente avaliada para a integridade de ARN através da realização do ensaio de chip de ADN. Duas bibliotecas smRNA foram construídos a partir de RNAs reunidas e integradas de dez indivíduos de cada grupo (tecidos peniana normais cancerosas e combinados) usando um kit de amostra prep smRNA (Illumina, EUA) seguindo os protocolos padrão com modificações específicas [15]. Resumidamente, as fracções apropriadas variou de 18 nt a 28 nt foram separadas, purificado por meio de 15% (w /v) de electroforese em gel desnaturante de poliacrilamida e, em seguida, ligado a adaptadores de ARN (5′-GTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATC e 3′-TCGTATGCCGTCTTCTGCTTG) seguido por RT-PCR amplificação. Em seguida, os produtos de PCR foram adicionalmente purificados em geles de agarose para estabelecer as bibliotecas. Finalmente, as duas bibliotecas que construídos a partir de dez tecidos cancerosos do pénis (reunidas e homogeneizadas para uma biblioteca) e dez correspondentes tecidos do pénis normal adjacente (reunidas e homogeneizadas para outra biblioteca) foram sequenciados através da aplicação Ilumina Hiseq 2000 (Ilumina, EUA) em Pequim Genomics Instituto (Shenzhen, China) seguindo estritamente os protocolos padrão [18].

dados NGS análises e novos miRNAs identificação

os dados de sequenciamento smRNA foram ainda analisados ​​referindo-se aos métodos descritos nas publicações anteriores [15-18]. Concretamente, após a exclusão de 5 ‘adaptador e corte 3’ sequências aceitadoras, removendo contaminado e de baixa qualidade lê (Q 10, o valor de qualidade foi calculada pela Q = caracteres ASCII code-64), como lê sem fragmento de inserção ou poli contendo ( a) se estende, as marcas exclusivas qualificados foram mapeados para GRCh37.p5 através da introdução de ferramenta SOAP2.0 ultra-rápida (https://soap.genomics.org.cn) [19]. Tags com não mais de um desencontro foram escolhidos para análises subsequentes. Os miRNAs conhecidos conservadas foram identificados, alinhando as tags mapeados para ferramenta miRBase (versão 18.0) em

Homo sapiens

[20], e as marcas não compensadas em miRBase foram alinhadas contra as sequências de outros RNAs não-codificantes (ARNr, ARNt, snRNAs, snoRNAs) apresentado na base de dados Rfam (https://www.sanger.ac.uk/resources/databases/rfam.html) [21], repete base de dados, bem como base de dados piRNA [22]. Em consideração algumas tags smRNA pode mapear para mais de uma categoria, seguimos as regras de prioridade descritos na publicação anterior para garantir que cada smRNA único foi mapeada para anotação única da seguinte forma: miRNA, Rfam, repete, piRNA e mRNA (122,228 .158.106 /mr2_dev) [23].

Depois de identificar os miRNAs conhecidos, os restantes sequências de todos os espécimes penianas normais cancerosas e correspondentes não anotadas pelas bases de dados acima mencionados foram escolhidos das duas bibliotecas a serem alinhados com o transcriptoma humano integrado para a previsão de novos miARNs. Todas as estruturas em grampo-like contendo etiquetas smRNA não classificadas que consistem em não menos de 45 leituras foram preditos usando clássica ferramenta de pré-microRNAs previsão Mireap (https://sourceforge.net/projects/mireap/) [24] estritamente de acordo com as seguintes regras: 1) Corpo de sequências de miARN variam entre 18 e 26 nt; 2) A energia livre de um precursor de miRNA é inferior a -18 kcal /mol; 3) protuberância permitido para miARN e o precursor emparelhado miARN * é inferior a 4; 4) Espaço entre miRNA e o precursor emparelhado miRNA * não é mais do que 35 nt. Enquanto isso, RNA Fold (https://rna.tbi.univie.ac.at/RNA/RNAfold.html) [25], um programa calcula a energia livre mínima (MFE) e Backtraces uma estrutura secundária ideal, foi emprestado para prever todas as estruturas secundárias potenciais precursores essenciais da miARN. Todos os dados brutos gerados por sequenciação próxima geração tenha sido depositado no banco de dados designado ArrayExpress (Número de acesso: E-MTAB-3087).

Bioinformatics análises de miRNAs diferencialmente expressos

As abordagens descritas em nossa publicação anterior para análises de bioinformática foram introduzidas para realizar a previsão de genes alvo no presente estudo [17-18]. Resumidamente, os genes-alvo de miRNAs diferencialmente expressos de tecidos do pénis normais cancerosas e combinados foram preditos usando Metas microcosmo, anteriormente chamados alvos miRBase (https://www.ebi.ac.uk/enright-srv/microcosm/) [26-27 ], TargetSpy (https://targetspy.org/) [28] e miranda (https://www.microrna.org) [29]. As previsões de betão foram estritamente de acordo com as regras descritas como se segue: 1) Qualquer desfasamento não deve ser encontrado na região da semente; 2) A energia livre da miARN duplex /alvo deve ser inferior a -20 kcal /mol; 3) A pontuação total para um par miRNA-mRNA deve exceder 140 [17-18].

Posteriormente, os termos GO enriquecido (https://www.geneontology.org) [30] e as vias KEGG ( https://www.genome.jp/kegg/) [31] as análises foram conduzidas para os genes alvo previstos de miARNs expressos diferencialmente a partir de amostras normais e cancerosos penianas. Concretamente, após o mapeamento dos genes alvo em potencial para o conjunto de dados de anotações ir e vias KEGG, separando os processos biológicos enriquecidos e vias de sinalização através de testes hipergeométricas e de Fisher, os índices de enriquecimento e valores p para GO e KEGG foram calculados através da introdução do idênticas fórmula mencionado em nosso relatório anterior [17], então o ajuste Falso Descoberta Rate (FDR) foi realizada para avaliar a significância das diferenças nos testes de múltipla [32]. Eventualmente, os termos e as vias GO-chave foram identificados somente sob a circunstância de que ratio≥2.0 enriquecimento e p-valor FDR 0,05 simultaneamente

verificação qRT-PCR para a expressão miRNA alterada

miRNAs maduro. quantificação foi realizada por quantitativo em tempo real de rotina de PCR utilizando um real-Time System Applied Biosystems StepOne PCR (Applied Biosystems, EUA) e um kit de SYBR pré-mistura Ex-Taq II (Takara, Japão) com as condições de reacção optimizadas e utilizando os iniciadores específicos listados na Tabela S1. Resumidamente, ARN total foi extraído a partir de 13 tecidos normais penianas cancerosas e combinados emparelhados. Entre os quais, o ARN extraído dos dez pacientes idênticos aplicados a NGS foi reunido e validados, enquanto cada ARN total a partir de outros três pacientes foram utilizados separadamente para análises posteriores. Após a síntese de ADNc, em triplicado, as reacções foram realizadas a 95 ° C /10 min, a 40 ciclos de amplificação subsequentes foram conduzidas a 95 ° C /15 s e 60 ° C /60 s. Enquanto isso, U6 snRNA foi emprestado como um controlo interno para normalizar a expressão miRNA. Para análise de dados, o ciclo limiar (Ct) foi definida como a ciclos fraccionárias quando a fluorescência passado um limiar fixo e ainda aplicada para calcular a abundância relativa de miARN (△△ Ct Ct =

miARN-CTSN

RNAU6). A expressão relativa dobram mudanças foram calculados usando 2

– △△ Ct fórmula [16]. As diferenças de concentração de miRNA entre tecidos do pénis cancerosas e normais foram analisados ​​utilizando testes t desemparelhados [18]. Quando um valor-p foi encontrado para ser menor do que 0,05, seria considerado estatisticamente significativo.

Resultados

Visão de conjunto do genoma dados smRNA-sequenciação dos espécimes penianas emparelhados

Todos os smRNAs de 18-32 nucleótidos das emparelhados espécimes fresco congelado de carcinoma de células escamosas do pênis (a seguir denominados “tecidos cancerosos”) e combinados tecidos histologicamente normais penianas adjacentes ao câncer (doravante referida como “tecidos normais” ), que foram diagnosticados histopatologicamente por HE-coloração (Fig 1), foram deep-sequenciados de modo a obter uma visão abrangente do perfil smRNAs.

coloração HE ilustrado nos tecidos normais adjacentes representativos peniana (à esquerda) e espécimes penianas cancerosas (direita) de três pacientes, respectivamente.

para cada amostra, 13.796.889 (de 15.702.009 lê) e 14.051.355 sequência lê (de 15.698.197 lê) alinhado com o conjunto de dados sequência do genoma humano foram obtidos, o que representa 704.514 (de 966.914) e 787.447 (de 1,090,353) tags únicas, respectivamente (S2 tabela). Entre os quais, 6.898 tags únicas correspondentes a 4.795.955 lê e 7.173 tags únicas correspondentes a 3.815.482 leituras foram pareados a miRNAs conhecidos por tecidos normais e cancerosos, respectivamente. Enquanto isso, 5.877 correspondente a 172.216 leituras e 6.272 correspondentes a 119.724 leituras foram pareados a piRNAs conhecidos por tecidos normais e cancerosos, respectivamente. O restante das sequências foram combinados em outros tipos de ARN, incluindo ARNm, ARNr, sRNAs, snRNAs, snoRNAs, tRNAs, repetições e assim por diante (FIG 2 e S2 tabela). Entre os quais, as repetições consistia principalmente de rRNA, quer com base no total de lê ou tags únicas (S3 tabela).

As tags únicas eo total lê alinhado com o conjunto de dados sequência do genoma humano foram obtidos. O mapeados tags únicas e limpo leituras foram anotados e classificados como miRNA, Pirna, rRNA, sRNA, snRNA, snoRNA, tRNA, repete, etc. com base na comparação com bancos de dados analíticos, tags parciais e leituras não foram anotados.

A maioria destes limpo leituras eram 22 nt em tamanho, consistentemente seguido por fragmentos de RNA de 23 nt e 21 nt (S1 FIG). Além disso, para entender o padrão de distribuição de todas as marcas únicas nos cromossomos, foi avaliada a localização detalhada de cada tag no cromossomo. Como resultado, as distribuições do cromossoma entre os tecidos cancerosos e normais foram geralmente os mesmos. Concretamente, nos tecidos do pénis cancerosas, cromossoma 1 abrigado a maioria das etiquetas originais, seguido por cromossoma 2, 11, 12 e 17, de forma correspondente, a maioria das marcas originais localizados no cromossoma 1, 2, 17, 12, 11 no lado tecidos normais peniana (S2 Fig).

Características das principais abundantes conhecidos e novos miRNAs

Para analisar os miRNAs mais abundantes nos tecidos do pénis, que listou as 20 melhores miRNAs altamente expressos com relativamente mais leituras contar em ordem decrescente para fora dos 751 e 806 miRNAs conhecidos em tecidos do pénis normais e cancerosos, respectivamente, que o perfil de expressão foi indicado tanto pela absoluta lê contar e as leituras contam fora de por milhão lê contagem. Em tecidos do pénis normais, deixe-7a-5p, deixe-7F-5p, deixe-7b-5p, deixe-7c-5p, miR-140-3p, deixe-7G-5p, deixe-7e-5p, miR-103a -3p, miR-320a, miR-143-3p foram os principais miRNAs abundantes. Do mesmo modo, os miRNAs altamente expressos em tecidos do pénis cancerosas foram deixe-7F-5p, deixe-7a-5p, deixe-7b-5p, deixe-7c-5p, miR-140-3p, miR-199b-3p, deixe-7g -5p, miR-199-3p, deixe-7e-5p e miR-143-3p possuía os melhores níveis de expressão abundantes. A partir do qual, descobrimos que os miRNAs mais altamente expressa em tecidos do pénis normais e cancerosos foram aproximadamente o mesmo (Tabela 1), indicando a origem idêntica histológica das amostras pareadas submetidos profunda sequenciamento.

Para identificar potenciais novos miRNAs em tecidos do pénis, as tags não classificados foram ainda processados ​​usando a ferramenta Mireap. Apenas as tags com lê contar mais de 50 e estritamente combinando os parâmetros padrão foram classificados como candidatos de novos miRNAs maduros. Com base nesta análise, a cada 10 precursores de miARN (cujas estruturas de haste-laçada potencial foram mostrados no S3 FIG) que codificam o novo previsto mais abundante candidatos madura miARN com comprimentos variando de 22 a 24 nt foram separadamente identificados nas duas bibliotecas smRNA de tecidos do pénis. Notavelmente, 7 abundantemente expressas novos miARNs foram sobrepostos entre cancerosas e combinados adjacentes tecidos penianas normais (Tabela 2), o que indica a origem e a localização cromossómica de forma idêntica histológica dos miARNs em ambos os tecidos mais uma vez. Enquanto isso, estes novos miRNAs originado mesmos precursores também mostraram heterogeneidade e preferência, através da geração de produtos relativamente mais maduros a partir do 3 ‘termina em comparação com o extremidades 5’ e entre os 10 novos miRNAs maduros, nem em tecidos do pénis, 9 miRNAs iniciado com adenina ou uridina (Tabela 2), que padrões foram consistentes com o relatório anterior [17].

perfis diferencialmente expressos de miRNAs em câncer de pênis

ao comparar os diferentes níveis de miRNA abundância entre os tecidos normais e cancerosos, duas quantidades são frequentes de grande importância: um é o valor p correspondente às respostas t-teste para a questão de saber se a diferença estatisticamente significativa dos níveis de expressão entre os grupos emparelhados pode ser alcançado. O outro é o valor de dobragem de troca (FC), o que poderia ilustrar o que representa a grandeza da diferença entre a abundância de miARN as amostras emparelhadas. Notavelmente, mesmo muito grandes valores FC pode ter valores de p insignificantes de acordo com o teste t causada por variabilidades consideráveis. Da mesma forma, relativamente pequena magnitude da diferença também pode significar um pequeno valor-p devido às repetições técnicos altamente consistentes dentro de cada amostras. Assim, um método de visualização útil chamado “trama vulcão”, que podem exibir simultaneamente dobra-mudança e valores de p no eixo X e do eixo Y separadamente, foi introduzido para conduzir a análise. Geralmente, os pontos localizados nas regiões superior esquerdo ou superior direito da trama e indicou com a cor verde deve chamar mais atenção, pois ambos tinham valores de p pequenos (p 0,05) e altos valores de FC (FC≥2) . Neste estudo comparativo, a visão geral da trama vulcão gerado pelos perfis de miRNAs em câncer de pênis e tecidos normais pareados foram mostrados (S4 Fig). Como resultado, o diferencial significativamente os níveis de expressão 98 miARNs foram encontrados entre PECA e espécimes penianas normais adjacentes após o ajuste para múltiplos ensaios. Através da aplicação de filtragem adicional com um corte rigoroso de 50 leituras contar em ambas as amostras, foram identificados 56 miRNAs constituída por 30 (53,6%) miRNAs que foram reprimidos (Tabela 3) e 26 (46,4%) que foram upregulated (Tabela 4) nos pacientes e poderia discriminar carcinoma de pênis de tecidos normais correspondentes.

Entre os quais, os miRNAs mais abundantemente reprimidos em tecidos do pénis cancerosas foram miR-320a, miR-205-5p, miR- 145-5p, miR-423-5p e miR-23b-3p. Dos miRNAs regulada, miR-107, miR-223-3p, miR-340-5p, miR-424-5p e miR-944 foram os top 5 miRNAs mais abundantemente expressas nos tecidos câncer de pênis, entre os quais, miR-107 tinha um nível de expressão no PECA superior a 30.000 lê contagem. Enquanto isso, o miR-107 também foi o miRNA mais significativamente regulada como o log

2 (Câncer /Normal Ratio) foi 3,83708. Correspondentemente, miR-508-3p foi o miRNA mais significativamente reprimidos como a expressão de miR-508-3p ainda não foi detectada em PECA.

Altered expressão miRNA em tecidos do pénis cancerosas validados por qRT-PCR

Para validar a expressão alterada de miARN PECA perfilado por smRNA-SEQ, qRT-PCR foi realizada em tecidos de cancro do pénis e combinados tecidos histologicamente normais. Em primeiro lugar, para excluir as possíveis diferenças individuais entre as amostras submetidas a sequenciação, a 10 emparelhado espécimes penianas dos pacientes também foram misturados como uma piscina para o ensaio validado. Subsequentemente, colhidos aleatoriamente 5 upregulated e 5 downregulated miARNs entre os miARNs expressos diferencialmente para conduzir a análise de qRT-PCR e os níveis de expressão foram apresentados usando a mudança de dobragem normalizados de tecidos cancerosos em comparação com tecidos normais. Os resultados revelaram que os níveis de expressão e a expressão alterada tendência dos 10 miARNs desreguladas eram bastante consistentes com os resultados obtidos a partir de tecnologia de NGS. A partir de ambas as técnicas, o miR-509-3p mostrou a maior dobrável mudança de níveis de expressão regulados negativamente em tecidos do pénis cancerosas, e miR-107 possuía o maior dobrável mudança de níveis de expressão regulada positivamente em tecidos do pénis cancerosas, que em conjunto indicou que os níveis de expressão de miRNAs detectados por sequenciação smRNA-seq eram confiáveis ​​(S5 Fig). Além disso, para validar o padrão de expressão de miARN alterada revelada pelos dados NGS em pacientes individuais, que se obter 4 miARNs desregulados para conduzir a análise de qRT-PCR e os níveis de expressão foram apresentados usando a mudança de dobragem normalizados de tecidos cancerosos em comparação com tecidos normais em cada paciente , respectivamente. De acordo com o resultado, verificou-se que, embora os efeitos de base populacional e diferenças inerentes inevitavelmente emergiu como o relatório anterior [33], a tendência dos padrões de expressão foi consistente com os resultados NGS, como o miR-107 e miR-223-3p mostrou os níveis de expressão regulada positivamente em tecidos do pénis cancerosas, enquanto miR-1247-5p e miR-509-3p mostraram os níveis de expressão regulados negativamente em tecidos do pénis cancerosas, que mais uma vez verificados os dados de sequenciamento smRNA-seq (S6 FIG).

GO análise enriquecimento de genes diferencialmente expressos em tecidos normais e cancerosos penianas

as funções biológicas essenciais dos genes alvo putativas foram classificados através do sistema Gene ontologia. Desde genes individuais foram relacionados aos termos GO distintas, conjuntos de genes que mostraram os padrões de expressão desregulados semelhantes em vários tipos de câncer foram pensados ​​para ser funcionalmente crucial para os processos tumorigênicos [30]. A fim de compreender melhor os comportamentos biológicos de miRNAs conhecidos desregulados, genes-alvo potenciais e funções biológicas visadas por estes miRNAs foram preditos usando microcosmos, TargetSpy e softwares Miranda [26-29] (S1 arquivo). Depois de ajustar o número de genes totais contagem anotada por um term≥10 GO específica, enriquecida ratio≥2.0 e valor de p FDR 0,05 para obter o resultado mais convincente para a análise de enriquecimento, os 10 termos GO mais enriquecidos, incluindo processos biológicos, celular componentes e funções moleculares foram apresentados na Tabela 5. Entre os quais, os putativos genes alvo de miARNs desregulados entre as amostras normais e cancerosos penianas parecia ser principalmente associada com os componentes celulares enriquecidas consistiu de citoesqueleto tais como junção aderente (que ancora junção proteínas transmembranares e facilita o citoesqueleto das células de fixação), de fibras de tensão (que consiste em filamentos de actina curtas), junção célula-célula (que geralmente liga comunicando junção células adjacentes). Enquanto isso, a função molecular mais enriquecido entre os 10 melhores termos GO era obrigatório beta-catenina (que funciona como o comportamento interativo com beta-catenina de uma forma selectiva e não-covalente). Além disso, esses genes alvo putativas foram firmemente ligado a uma grande variedade de processos biológicos incluindo a regulação do crescimento (que modula extensivamente o desenvolvimento do organismo), a regulação forma da célula (que funciona como o comandante de configuração da superfície celular), axonogenesis (processo esse que geralmente modula a axónio do morfogénese e determinação forma), regulação da actividade de proteína-quinase dependente de ciclina (qual o procedimento regula a actividade de serina /treonina-quinase de forma abrangente), fosforilação peptidil-serina (processo esse que medeia a conversão de peptidil-serina para peptidil-o-fosfo-L-serina) e regulação da angiogénese positivo (qual o procedimento facilita a formação de vasos sanguíneos).

KEGG análise de caminho de genes diferencialmente expressos em tecidos do pénis cancerosas e normais

Após a análise GO, o alvo putativo genes destes miRNAs diferencialmente expressos em amostras penianas cancerosas e normais foram introduzidas para KEGG para realizar uma análise de enriquecimento caminho, que eventualmente mostrou 22 genes-alvo que foram anotados por miRNAs diferencialmente expressos, e 5 vias KEGG foram enriquecidos. Com base na definição estatisticamente significativa com valores de p 0,05, os anotados vias mais enriquecidos foram encontrados para ser fortemente ligado ao “dorso-ventral formação do eixo (GRK-EGFR)” (que modula os efectores-chave na formação do eixo tais como Rho