Abstract

Objectivos

Como as células-tronco do câncer hepático (HCSCs) Acredita-se que derivar a partir da conversão de células estaminais normais hepáticas (HNSCs), a identificação das diferenças que distinguem HCSCs de HNSCs é importante.

Métodos

o modelo foi estabelecido HCC em ratos F344 por indução DEN . Utilizando análise de FACS, as células da população lado de HCC (SP-HCC) foram isolados a partir das células epiteliais do tipo de tecidos de carcinoma hepatocelular, e as células da população lado de fígado normal (SP-NLCs) foram isoladas a partir de células de fígado normais singeneicos. A expressão dos marcadores de células estaminais foi detectada em ambas as subpopulações recentemente isolados e amplificados. Após indução com HGF, a diferenciação de cada subpopulação foi analisada por detecção de marcadores hepáticas precoces e tardias. In vivo, as características biológicas de SP-HCC e SP-NLCs foram analisados ​​por reparar fígados lesionados ou a formação de tumores em ratinhos nus. Além disso, a expressão de miRNAs foi examinado em ambas as populações de matriz miRNA e QRT-PCR.

Resultados

SP-NLCs e SP-HCC foram 4,30 ± 0,011% e 2,100 ± 0,010% de toda a população, respectivamente. Ambos SP-CLN e SP-HCC exibida maior expressão de marcadores de células estaminais (CD133 e EpCAM) do que NSP-CLN e PEN-HCC, respectivamente, (

P

0,01), tanto após isolamento fresco e amplificação. Após a indução de HGF, SP-NLCs gerado muitas células positivas ALB e alguns 7 CK-células positivas, mas NSP-NLCs poderia gerar apenas as células positivas ALB. Em contraste, SP-HCC deram origem a células positivas apenas AFP. Como poucos como 5 × 10

5 SP-NLCs foram capazes de reparar danos no fígado, enquanto que o mesmo número de NSP-NLCs não poderia reparar o fígado. Além disso, apenas 1 × 10

4 SP-HCCs eram necessários para iniciar um tumor, enquanto NSP-HCC não conseguiu formar um tumor. Comparado a SP-NLCs, 68-regulada e 10 miRNAs regulados negativamente estavam presentes na SP-HCC (

P Art 0,01).

Conclusão

Com base em os papéis decisivos de alguns miRNAs na gênese da HCSCs, miRNAs podem contribuir para as diferentes características que distinguem SP-HCCs da SP-NLCs

Citation:. Liu Wh, Tao Ks, Você N, Liu Zc, Zhang Ht, Dou Kf (2011) Diferenças nos perfis de Propriedades e Mirna de expressão entre as populações colaterais de células de câncer hepático e células normais do fígado. PLoS ONE 6 (8): e23311. doi: 10.1371 /journal.pone.0023311

editor: Xin Wei Wang, do National Cancer Institute, Estados Unidos da América

Recebido: 02 de setembro de 2010; Aceito: 15 de julho de 2011; Publicação: 03 de agosto de 2011

Direitos de autor: © 2011 Liu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiada pela National Science Foundation Natural da China (No. 30.772.102) e Nature Science Foundation da Província de Shaanxi (No. 2007K09-05 (7)). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a evidência crescente mostra que o câncer contêm um pequeno subconjunto de suas próprias células-tronco-like, chamadas de “células-tronco cancerosas” (CSCs) [1], [2], [3], que são os mais afetados pela ambos os supressores de tumores e indutores de cancro [4], [5], [6]. HCC também contém CSCs hepáticas (HCSCs), que têm o maior potencial para proliferar e invadir o tecido circundante [7]. Publicações recentes mostraram que HCSCs podem ter origem a partir de células estaminais normais hepáticas (HNSCs) [8]. Mesmo o evento inicial que transforma HNSCs para HCSCs se propõe a ser uma forma de desregulamentação do HNSCs auto-renovação [9]. Assim, comparando as características dos HNSCs e HCSCs é importante. hepática normal é rica em HNSCs [10], ea sugestão de que estes HNSCs pode servir como um controle ótimo para estudar as características de HCSCs é razoável. No entanto, marcadores moleculares que definem ambos os HCSCs e HNSCs permanecem controversos; por conseguinte, o isolamento de células de populações lado (SP) tem sido amplamente utilizada para enriquecer a ambos os tipos de células estaminais [11]. células SP têm demonstrado ser células indiferenciadas e imaturos e para expressar níveis elevados de alguns marcadores específicos de células estaminais [12]. Assim, o isolamento de células SP é uma fonte alternativa de células estaminais, o que é particularmente útil em situações em que se originam de células são marcadores desconhecido [12]. Em ratinhos e ratos, o fenótipo SP parece ser uma característica comum das células estaminais, incluindo as células estaminais normais e cancerosas [13], [14], [15]. No fígado, as células SP têm sido mostrados para servir um papel central na regeneração do fígado e cancro do fígado [16]. Portanto, as células SP podem ser consideradas alternativas adequadas para estudar HNSCs e HCSCs.

MiRNAs estão surgindo como importantes reguladores da regulação gênica pós-transcricional. A importância de miRNAs é sublinhada pelo fato de que eles são muitas vezes desregulado durante a carcinogênese [17], [18], [19], [20]. Alguns miARNs pode promover o crescimento do tumor através de mecanismos comuns que contribuem para o controlo do ciclo celular miARN-regulados [21]. Além disso, miARNs têm demonstrado ser um componente integral de regulação das células estaminais, incluindo as células estaminais normais (NCCC) e CSCs [22]. Uma perturbação das principais redes miARN-mRNA em NSC tem sido sugerida para ser uma marca de CSCs [23]. Na verdade, um único oncogene (miARN-145) tem sido demonstrada para reprogramar células primárias para mostrar um fenótipo CSCs [24]. Assim, a identificação de padrões de expressão comum e único de miRNAs entre HCSCs e HNSCs é essencial.

Neste estudo, aplicamos análise SP para duas populações diferentes de células epiteliais de cultura principal. Um tipo de célula foi isolado a partir de tecidos de HCC de rato induzido por diethylinitrosamine (DEN) e o outro tipo de célula foi isolado a partir de tecidos de fígado de ratos singénicos. populações colaterais de células normais do fígado (SP-nlcs) e de HCC (SP-HCC) altamente expressa marcadores de células-tronco.

In vitro

, ambas as células SP teve altas capacidades a proliferar e se diferenciar em células maduras após indução com fator de crescimento de hepatócitos (HGF).

In vivo

, SP-NLCs poderia ajudar muito na reparação de um fígado de rato lesionado. Em contraste, a SP-HCCs poderia iniciar tumores, tanto em tecidos subcutâneos e fígado de não-obesos diabéticos /imunodeficiência combinada grave camundongos (NOD /SCID). Supondo-se que essas diferenças foram relacionadas às muito diferentes padrões de miRNAs entre estas duas populações de células de expressão, examinamos os perfis de miRNA de SP-NLCs e SP-HCC. Porque HCSCs são propostas a ser HCC células iniciar, identificando as diferenças entre SP-HCC e SP-NLCs, incluindo miRNAs desregulados, pode ajudar muito na compreensão da gênese da HCSCs ea tumorigênese de HCC.

Materiais e Métodos

1. COLETA

Trinta homens Fisher 344 ratos (do Resource Nacional Rodent Laboratory Animal, Xangai, China) foram divididos aleatoriamente em grupos de controlo e de avaliação. Os ratos do grupo de teste foram tratados com 0,05% de DEN (Sigma Co, EUA) na sua água de beber durante 6 semanas e foram, em seguida mudado para água potável normal, [25], enquanto que os ratos do grupo de controlo receberam uma dieta normal. Três ratos de cada grupo foram sacrificados sob anestesia de 2, 6, 10, 14 e 18 semanas após a indução DEN. Ambos os nódulos HCC do grupo de experimentação e fígados normais do grupo controle foram coletadas. Porções destes tecidos foram fixados em 10% de formalina neutra tamponada com fosfato e rotineiramente processadas e coradas com hematoxilina e eosina (H E) para exame histológico. Os tecidos remanescentes foram utilizados directamente nas experiências detalhadas abaixo. Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com protocolos de estudo animal [26] e aprovado pelo Comitê Cuidado e Uso Animal Research na Quarta Universidade Médica Militar. O número de protocolo animal era SYXK2008-005.

2. isolamento de células e cultura

células cancerosas hepática (HCC) foram isolados de acordo com Hohne et al. [27] com pequenas modificações, e células de fígado normais (nlcs) foram isoladas de acordo com Oertel et ai. [28]. Ambos HCC e hepática normal (NL) Os tecidos foram picados em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (Invitrogen Co, EUA) com 0,1% de colagenase de tipo IV e 0,005% de tripsina (Sigma Co, EUA) e, em seguida, incubadas durante 20 min a 37 ° C em um banho de água com agitação. Após a incubação, os sobrenadantes contendo as células libertadas foram passadas através de uma malha de nylon de 100 um e centrifugada a 1000 × g durante 8 min. Os sedimentos foram lavados duas vezes com solução salina equilibrada com fosfato (PBS) (Invitrogen Co, EUA), e suspensões de células isoladas foram recolhidas. A suspensão de células individuais NL foi centrifugada durante 5 min a 100 x g em DMEM, e o sobrenadante foi recolhido. Um gradiente de Percoll (Invitrogen Co, EUA) foi preparada em um tubo de 50 ml por camadas sequencialmente 10 ml de 70%, 50% e 30% de Percoll. Um total de 20 ml de CLN em PBS foi adicionado e o tubo foi centrifugado a 1000 x g durante 10 min. A fracção de células na interface entre 30% e 50% de Percoll foi recolhido. Ambas as CLN e HCC foram cultivadas em placas de 6 poços contendo de William E Médio (Sigma Co, EUA) suplementado com 10% v /v de soro fetal de bovino (Invitrogen Co, EUA), 5 ug /ml de insulina (Sigma Co, EUA), 5 hidrocortisona uM, 100 U /ml de penicilina e 100 ug /ml de estreptomicina a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO

2. As células aderentes proliferaram e estendida como uma colónia monocamada após 20 dias em cultura. Foram coletadas a população de células monoclonal por digestão local com clonagem cilindros e transferiu as células em uma nova placa de cultura para continuar o processo de cultivo.

3. SP triagem celular

As células foram divididas em duas partes: metade foi utilizada directamente como um simulacro população classificados (SSP), enquanto a outra metade foi utilizada para a separação de células em um classificador de células FACS Vantage II (Becton Dickinson Co , EUA). As informações a seguir descreve o nosso protocolo de isolamento. As células foram marcadas com Hoechst 33342 corante (Sigma Co, EUA) a uma concentração final de 4 mg /mL na presença ou na ausência de 50 uM de verapamil (Sigma Co, EUA) e incubou-se a 37 ° C durante 90 minutos de acordo com os métodos descrito por Goodell et ai. [11]. As células coradas foram lavadas com PBS gelado contendo 2% de albumina de soro bovino (BSA) e HEPES 10 mM, centrifugado a 4 ° C e ressuspensos no mesmo tampão. O iodeto de propídio (PI) (Sigma Co, EUA) foi utilizado para detectar a viabilidade celular. Hoechst 33342 foi excitado a 355 nm e sua fluorescência foi analisada em dois comprimentos de onda: Hoechst 33342 azul a 450 nm e Hoechst 33342 vermelho no 675 nm. Um segundo laser de árgon de 488 nm (100 mW) foi usado para excitar a fluorescência do PI para excluir as células mortas. células SP mostrou baixa coloração com células população não-side (NSP) Hoechst e foram mais intensamente coradas.

4. O crescimento celular teste

Este experimento foi utilizado para avaliar a capacidade proliferativa das células de cada subpopulação, incluindo SP, NSP e SSP. As células em cada uma das subpopulações foram ajustadas a 2 x 10

6 /ml e semeados em frascos de 32 (0,5 × 10

5 células por frasco). O meio de cultura foi suplementado com o factor inibidor da leucemia (LIF), a uma concentração de 10 ug /ml. Todos os dias, durante um período de 7 dias, 4 amostras de células paralelas a partir de cada uma das subpopulações foram tripsinizadas e contadas sob um microscópio invertido (BX50-32E01, Olympus, Tóquio, Japão).

5. Detecção de marcadores de células estaminais por as células activadas fluorescentes (FACS)

A expressão de marcadores de células estaminais foi analisada por um sistema de FACSCaliburTM (Sistemas Immunocytometry BD, San Jose, CA) em ambas as subpopulações recentemente isolados e amplificados subpopulações. Resumidamente, as células foram incubadas em meio de William E (contendo 20% de FBS) em 10

6 células /ml durante 15-30 min à temperatura ambiente para bloquear os sítios não específicos de ligação ao anticorpo. As células de diferentes subpopulações foram lavadas duas vezes com PBS e re-suspensas em 990 ul de PBS. Subsequentemente, 10 uL de anticorpos, incluindo CD133 (conjugado com PE, BioLegend, EUA) e EpCAM (isotiocianato de fluoresceína (ITCF) conjugadas, BioLegend, EUA), foram adicionados a cada suspensão de células. Após 30 min de incubação a 4 ° C no escuro, as células foram lavadas duas vezes com PBS, fixadas em formaldeído a 0,1% e analisadas por citometria de fluxo.

6. indução celular por HGF

As células de cada uma das subpopulações foram cultivadas em meio de indução, que foi meio isento de soro comercial (Sigma Co, EUA) suplementado com HGF (20 ng /ml). A diferenciação celular foi avaliada através da detecção da expressão de marcadores específicos de fígado tal como descrito abaixo.

7. Detecção de marcadores hepáticos por imunofluorescência (IF)

Depois de indução por HGF, SE foi realizada para avaliar qualitativamente se as células induzidas expressa marcadores hepáticos específicos. Para identificar a diferenciação bi-direcional das diferentes populações em NLCs (SP-nlcs, NSP-nlcs e SSP-nlcs), foram selecionados dois marcadores primários específicos: o maduro albumina hepática marcador (ALB) (diluição 1:200; Santa Cruz, CA) e o marcador biliar citocina 7 (CK-7) (diluição 1:200; Santa Cruz, CA). Para identificar a maturação de populações diferentes em HCC (SP-HCC, NSP-HCCS e SSP-HCC), a fetoproteína marcadores de tumor alfa (AFP) (diluição 1:200; Santa Cruz, CA) e CK-19 (diluição 1:200 ; Santa Cruz, CA) foram selecionados. Resumidamente, com o meio de cultura removido, as células na lâmina de cultura foram lavadas duas vezes com PBS, fixadas com 4% de paraformaldeído durante 20 min e, em seguida, imersas em PBS durante 10 min, seguido de exposição a 0,01% de Triton X-100 à temperatura ambiente durante 10 min. Para bloquear as reacções imunitárias não específicas, as células foram tratadas com soro de 6% de cabra (Santa Cruz, CA) à temperatura ambiente durante 30 min. As células de cultura em cada lâmina foram submetidos a anticorpos primários, a 4 ° C durante a noite e foram lavadas três vezes com PBS frio. e incubou-se durante 2 h, o anticorpo secundário fluorescente de cabra conjugado com FITC anti-coelho (Santa Cruz, CA diluição 1:100). Subsequentemente, as células foram tratadas com cloreto de 2- (4-amidinofenil) dicloridrato -6-indolecarbamidine (DAPI) (diluição 1:100; Sigma) durante 15 min. A fluorescência foi observada através de um filtro apropriado, utilizando um microscópio de fluorescência (FV1000MPE, Olympus Co., Tóquio, Japão).

8. Detecção de marcadores de fígado por western blotting

Após a indução por HGF, Western blotting foi realizado para detectar quantitativamente marcadores específicos do fígado induzidas nas células. ALB e CK-7 foram examinados em SP-NLCs, NSP-NLCs e SSP-NLCs; AFP e CK-19 foram analisados ​​em SP-HCC, NSP-HCC e SSP-HCC. As células foram lisadas em tampão de extracção de células inteiras (tampão RIPA) contendo um comprimido de mistura de inibidores de protease (Complete-Mini, Roche Diagnostics, Mannheim, Alemanha). Os homogenatos foram centrifugados a 3000 × g durante 20 min a 4 ° C, e os sobrenadantes foram recolhidos. As proteínas foram separadas em 12% de gel de poliacrilamida-SDS e transferidas para uma membrana Immobilon-P PVDF (fluoreto de polivinilideno) (Millipore, Billerica, MA, EUA). As manchas foram saturados com tampão de bloqueio (5% de leite desnatado em TBS-T) durante 1 h à temperatura ambiente e, em seguida, incubadas durante a noite a 4 ° C com anticorpos de coelho anti-humanos /rato /ratinho monoclonais (1:600; Santa Cruz Biotechnology , Inc., Santa Cruz, CA) e um anticorpo da desidrogenase do gliceraldeído-3-fosfato (GAPDH) (1:600; Sigma, St. Louis, MO). Depois de lavadas em TBS-T, as membranas foram incubadas durante 1 h à temperatura ambiente com HRP de cabra anti-IgG de coelho (1:2000; Perkin Elmer, Inc., Waltham, MA). A detecção das proteínas foi realizada utilizando um sistema ECL (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, EUA). Os valores em escala de cinza de cada banda sobre as transferências foram medidos utilizando BandScan4.3.

9. modelo de lesão do fígado e transplante de células

SP-CLN e PEN-NLCs foram independentemente lavadas com PBS no escuro e ressuspensas em 2 ml de solução corante para marcar a membrana celular com a fluorescência vermelha a 37 ° C, de acordo com o protocolo fornecido com o kit fluorescente vermelha PKH26 ligante celular (Sigma Corp, EUA). meios contendo soro foi adicionado à solução de coloração para terminar a coloração 5 min mais tarde. As células coradas foram lavadas três vezes com PBS e suspensas em 0,5 ml de PBS para o transplante. Para induzir a lesão hepática, a 20 ratos normais F344 (10 para o transplante de SP-NLCs, 10 para injecção NSP-NLCs) foram administrados CCl

4 intraperitonealmente a uma dose de 1,2 ml /kg de peso corporal e receberam um de dois terços hepatectomia parcial (PH 2/3) três dias mais tarde. Imediatamente após a PH, das células preparadas (5 × 10

5 células por rato) foram injectados separadamente para estes ratos, através da veia porta.

Para cada fígado, que cortado aleatoriamente quatro secções congeladas. Para avaliar os efeitos de colonização de SP-NLCs e NSP-NLCs, as seções de fígado restaurados foram vistos sob um microscópio invertido. Quando foram observadas áreas vermelhas nas seções, o resultado foi identificado como positivo. No âmbito de cada campo de visualização, as áreas positivas foram contadas e foi calculada a percentagem da área positiva em relação a toda a área. Um por cento de área vermelha de 5% foi definida como negativa (-), 5-25% como positiva (+), 25-50% moderadamente positiva (++) e 50% como fortemente positiva (++ +).

10. NOD /SCID transplantados xenotransplante experimentos

Números diferentes (1 × 10

7, 1 × 10

6, 1 × 10

5 e 1 × 10

4) de SP- HCC ou NSP-HCC foram injectadas em ratinhos NOD /SCID por injecção subcutânea. Cada grupo continha 4 ratinhos; Assim, 32 os ratinhos foram usadas para xenotransplante. Cada mouce foram feitas com 4 injecções, simetricamente 2 injecções em deixado para trás e 2 injeções na parte traseira direita. O crescimento tumoral foi monitorizado a cada 2 dias após a segunda semana de inoculação. Todos os ratinhos foram sacrificados no dia 60. Todos os tecidos de tumor foram colhidas, fixadas em formaldeído a 4% e embebidos em parafina para a H E de coloração para avaliar a histologia do tumor. Todos os resultados foram avaliados por três diferentes pesquisadores independentemente. Nós resumidos os dados e calculado o diâmetro médio dos tumores em cada grupo (por exemplo, 1 × 10

7 grupo SP-HCC). De acordo com o tamanho médio dos tumores, eles foram divididos em quatro tipos diferentes: grau 1 (-), sem tumor macroscópico; grau 2 (+), o diâmetro do tumor 0,2 centímetro; grau 3 (++), 0,2-0,5 cm; grau 4 (+++), . 0,5 cm

11. A expressão de miARNs em células SP

Os ARNs totais foram obtidos a partir tanto SP-CLN e SP-HCC pelo kit de isolamento de ARN Totalmente (Ambion, Austin, TX). A qualidade e quantidade de ARN totais foram verificados por electroforese em gel de agarose a 1,5% e quantificação ultravioleta. Os perfis dos miRNAs de expressão foram então detectadas pelo miRCURY LNA ™ (ácido nucleico bloqueado) Kit microRNA Arrays (Exiqon Co, Dinamarca), que abrange todos humanos, o rato eo rato miRNA sequências anti-sentido. Além disso, o kit também incorporou 144 sondas miRPlus ™, que foram fornecidos pela Corporação Exiqon para a detecção de miARN romance. Um micrograma de ARN a partir de SP-HCC, SP-CLN e piscinas de referência foram co-hibridada no array Exiqon miARN durante 16 horas a 56 ° C. Após incubação com os dendrímeros Cy3-marcados (Genisphere Inc, de Hatfield, PA) [29], as micromatrizes foram lavadas consecutivamente com tampões de lavagem A, B e C. Os sinais de fluorescência na matriz hibridada foram capturados por um digitalizador GenePix 4000B e quantificado usando GenePix Pro4.0 (Axon Instruments, Burlingame, CA). manipulação de dados foi facilitada com a normalização Suíte v1.63 (Instituto Ontario Cancer, Toronto, Canadá) [30]. O teste de rácio de referência para cada miARN-se a média dos pontos em triplicado e entre experiências duplicadas. Rácios maiores ou menores do que duas vezes foram consideradas como sendo sobre-regulada ou regulada para baixo, respectivamente.

Dois altamente sobre-regulada miARNs, três ligeiramente sobre-regulada miARNs, uma sub-regulada e uma muito miARN moderadamente foram selecionados miRNA-regulada como miRNAs representativos para ser validado pelo quantitativo em tempo real reação em cadeia da polimerase (QRT-PCR). Os ARNs totais foram sujeitos a transcrição reversa por MultiScribe (Applied Biosystems) em misturas de reacção contendo os iniciadores específicos de miR-estrutura haste-laçada de transcrição reversa (RT) (Tabela 1). Os iniciadores de PCR estão listadas na Tabela 1, e os parâmetros do ciclo para a reacção de PCR foram de 95 ° C durante 15 min, seguido de 40 ciclos de um passo de desnaturação a 95 ° C durante 15 s e uma etapa de hibridação /extensão a 60 ° C durante 60 seg. Todas as reacções foram realizadas em triplicado. A quantidade relativa de cada miARN para U6 ARN foi descrito pela equação ôc

T = (C

TmiRNA-C

TU6) [31]. A mudança vezes na miRNAs de SP-HCC, em comparação com a SP-NLCs são mostrados usando a equação 2

-ΔΔCT, onde ΔΔC

T = (Sc

T SP-HCC-Sc

T SP- NLCs).

12. Alvos de miRNAs desregulados

12.1. . Previsão de alvos potenciais para miRNAs desregulados

Os alvos potenciais para os miRNAs desregulados encontrados pelos métodos acima foram previstas por dois algoritmos publicamente disponíveis, incluindo miRBase Alvos versão 5 (disponível em: http: //microrna.sanger .ac.uk /) e TargetScan versão 4.2 (https://www.targetscan.org/).

12.2 Identificação de alvos por semi-quantitativa em tempo real reação em cadeia da polimerase (sqrt-PCR).

Nós resumimos as metas comprovados de sete miRNAs desregulados validados. Entre essas metas, as miR-200a genes * alvo ZEB1 e ZEB2 [32], [33] foram analisadas em ambos SP-HCC e SP-NLCs por sqrt-PCR. O ARN total foi extraído a partir de células utilizando o reagente Trizol (Molecular Research Center, Cincinnati, OH) e reversamente transcrito em ADNc por transcriptase reversa Superscript II de acordo com as instruções do fabricante (Invitrogen, Carlsbad, CA). Quantidades iguais de ADNc a partir destas duas amostras foram amplificadas com os seguintes iniciadores específicos: ZEB1 (com sentido 5′-AAGAAAGTGTTACAGATGCAGCTG-3 ‘, anti-sentido 5′-CCCTGGTAACACTGTCTGGTC-3′); e ZEB2 (com sentido 5’-ATACCAGCGGAAACAAGGATTTCA-3 ‘, anti-sentido 5′-CAGGAATCGGAGTCTGTCAAGTCA-3’). O número de ciclos de PCR foi 35. Cada ciclo consistiu de passo de desnaturação a 95 ° C durante 30 s, passo de recozimento do iniciador a 65 ° C durante 30 s e passo de extensão a 72 ° C durante 45 s. Os produtos de PCR foram analisados ​​por electroforese em gel de agarose a 1,5% corado com brometo de etídio.

13. Análise estatística

Os dados são expressos como a média ± erro padrão a partir de pelo menos três experiências separadas realizadas em triplicado. As diferenças entre os grupos foram analisados ​​com o software SAM versão 3.0 usando um estudante de dupla face

t

-test quando apenas dois grupos estavam presentes, e a hipótese nula foi rejeitada ao nível 0,05.

Resultados

1. Tecidos preparação e cultivo celular

tecidos NL obtidos no grupo controle foi de vermelho brilhante e exibido superfícies lisas (Figura 1A-i). Quando estes fígados foram cortados em lâminas finas, de tecido de fígado normal foi completamente revelado (Figura 1A-II). Após a H E coloração, os lóbulos hepáticos foram observados para estar em boas condições (Figura 1A-iii). NLCs pequenas foram selecionados por Percoll centrifugação descontínua gradiente (PDGC) e cultivadas. NLCs clones formado depois de aproximadamente 8 dias de cultura (Figura 1A-IV). Após cultura durante 15 dias, estas pequenas células cobertas cerca de 65% da placa (Figura 1A-v). Após 25 dias, estas células homogéneas quase totalmente coberto as placas (Figura 1A-VI).

(Ai) Morfologia dos fígados do grupo não-tratado DEN, (A-II) secções finas-cortado revelar completamente tecido normal do fígado, (a-III) As características histológicas do fígado normal, com uma estrutura regular. NLCs de cultura principal para (A-IV) 4 dias, (A-V) 15 dias e 25 dias (A-VI). painel médio: HCC primária segregação de tecidos e cultura de células. (Bi) nódulos múltiplos HCC primárias do fígado de ratos, um dos quais está indicado por uma seta, (B-II) nódulos metastático HCC em pulmões de ratos, os quais estão indicados por setas, (B-III) As características histológicas de tecido HCC metastático , em que lóbulos pulmonares normais foram substituídos por massas de carcinoma; células de carcinoma hepatocelular de cultura principal para (B-IV) 4 dias, (B-V), 15 dias e 30 dias (B-VI). painel inferior: o isolamento de diferentes subpopulações. (C-i) Sem verapamil: células SP foram mostrados como uma porcentagem dos NLCs; (C-ii) Com verapamil: o perfil das células SP diminuiu consideravelmente. (C-iii) Sem verapamil: células SP foram mostrado com baixa fluorescência em HCC; (C-IV) com verapamil: fluorescência da fracção de células SP deslocada para um nível mais elevado. (C-v) As percentagens de células SP em diferentes grupos são refletidos em um gráfico de colunas. ampliação original, de 200 × (A, B-iii), 100 × (A, B-iv, v, vi).

Pequenos tumores foram encontrados pela primeira vez em ratos sacrificados 8 semanas após a indução DEN. Após 10 semanas, dois terços dos fígados continha tecidos tumorais com superfícies ásperas (Figura 1B-I). Descobrimos também numerosos nódulos metastáticos de cancro nos pulmões (Figura 1B-II). Três diferentes patologistas avaliaram a H E de coloração e verificou-se que essas neoplasias eram todos de origem hepática (Figura 1B-III). As células isoladas a partir de tecidos de carcinoma hepatocelular primário cresceu lentamente no início, com apenas alguns clones formadas (Figura 1B-IV). Após 15 dias, as células proliferaram rapidamente cobertos e 60% de cada uma das placas (Figura 1B-v). Um mês mais tarde, essas células coberto totalmente as placas (Figura 1B-vi).

2. Isolamento de células SP por FACS

No grupo NLCs, a percentagem de células SP era 4,300% ± 0,011% (Figura 1C-i). Quando a exclusão do corante foi inibida por verapamil no grupo de controlo, as células SP foram quase idênticos para o resto das células (Figura 1C-II). A percentagem de células SP no grupo HCC foi 2,100% ± 0,010% (Figura 1C-III). Quando a exclusão do corante foi inibida por verapamil, estas células SP também podia não ser discriminados a partir de seus controlos (Figura 1C-IV). O perfil de células de SP em NLCs foi significativamente mais elevada do que em HCC (

P

0,05). (Figura 1C-V)

3. Auto-renovação das células SP

Duas características padrão são características de células-tronco: a auto-renovação e multipotency. De auto-renovação, SP-HCCs proliferaram o mais rápido durante 7 dias de cultura, seguido por SP-NLCs, SSP-HCC, SSP-NLCs e NSP-HCC (que proliferaram de forma semelhante) e, por fim, o NSP-NLCs (Figura 2A ). De um modo geral, as células SP proliferavam muito mais rapidamente do que ambas as células de PNS e células de SSP (

P

0,01), e HCC proliferaram um pouco mais rápida do que CLN. Uma vez que o número inicial de cada população de células era o mesmo, o número de células totalmente diferentes estavam presentes em cada grupo no final do período de cultura (Figura 2B). células SP (Figura 2B-I, IV) foram encontrados para ser mais homogénea e muito menor em tamanho do que as duas células de NSP (Figura 2B-II, V) e células de SSP (Figura 2B-III, VI) (

P

0,01). No entanto, não foram observadas diferenças significativas entre morfológicas SP-NLCs (Figura 2B-i), e SP-HCC (Figura 2B-IV). Assim, estas duas populações não puderam ser discriminados entre si sob um microscópio invertido.

Curva

(A) o crescimento de células durante 7 dias de cultura. (B) Após a amplificação, as densidades celulares distintas foram observadas nas diferentes subpopulações. (C) A expressão dos marcadores de células estaminais (CD133) e EpCAM era diferente em cada subpopulação isolada de fresco e amplificado por FACS. (D) Os dados exactos foram refletidas por um gráfico de colunas. CD133 /EpCAM-Fresh indica a expressão de CD133 /EpCAM em subpopulações isoladas de fresco, e CD133 /EpCAM-Amplified significa a expressão de CD133 /EpCAM em subpopulações amplificados. ampliação original, 100 × (B).

No início da cultura, tanto SP-NLCs e SP-HCCs expressa mais dos marcadores de células-tronco do que NSP-NLCs e NSP-HCC, respectivamente (

P

0,01) (Figura 2C). Foram observadas as seguintes percentagens de células positivas em cada subpopulação: percentagens CD133 na SP-NLCs, NSP-NLCs, SSP-NLCs, SP-HCC, NSP-HCC e SSP-HCC foram 81,2 ± 7,08, 11,4 ± 1,31, 30,3 ± 3,21 , 86,7 ± 8,32 12,7 ± 1,39 e 31,6 ± 3,42, respectivamente; percentagens EpCAM nessas subpopulações foram 80,1 ± 8,10 10,6 ± 1,21 31,2 ± 3,18 86,5 ± 3,28 12,4 ± 1,31 e 32,6 ± 3,67, respectivamente. No final do período de cultura, SP-CLN e SP-HCC ainda expressa mais dos marcadores de células estaminais que NSP-CLN e PEN-HCC, respectivamente, (

P

0,01) (Figura 2D). Além disso, a expressão de marcadores de células estaminais diminuiu muito mais lentamente do que em células de SP tanto em células de SSP e células NSP (

P

0,01). Foram observadas as seguintes percentagens: percentagens CD133 na SP-NLCs, NSP-NLCs, SSP-NLCs, SP-HCC, NSP-HCC e SSP-HCC foram 78,6 ± 6,98, 3,4 ± 0,33, 20,2 ± 2,03, 80,5 ± 7,86, 3,6 ± 0,30 e 20,7 ± 2,38, respectivamente; percentagens EpCAM nestas subpopulações foram 78,1 ± 7,53, 3,5 ± 0,28, 21,5 ± 2,17, 80,3 ± 8,12, 2,3 ± 0,27 e 20,2 ± 2,28, respectivamente. Durante o período de proliferação, tanto SP-CLN e SP-HCC mantida a elevada expressão de marcadores de células estaminais; Em contraste, tanto NSP-CLN e PEN-HCC gradualmente perdido a expressão dos marcadores de células estaminais. Estes dados sugerem que as células SP são semelhantes às células na sua capacidade de auto-renovação haste.

4. Diferenciação de células SP induzidos por HGF in vitro

Em condições de indução, cada subpopulação gerado conseqüências distintas. Porque NLCs deve diferenciar em hepatócitos ou células epiteliais das vias biliares, foi selecionado um marcador madura hepática (ALB) e um marcador biliar (CK-7) para identificar células maduras. A maioria SP-NLCs expandiu-se em lâminas de células hermeticamente embalados que exibiam morfologia dos hepatócitos típica e foram identificadas como células positivas ALB (66,9 ± 5,34%). Uma porção da SP-NLCs diferenciadas em células de CK-7 positivas (24,6 ± 2,41%) (Figura 3A). Embora ambos NSP-NLCs e SSP-NLCs também poderia gerar ALB células positivas, apenas algumas 7 de CK células positivas poderiam ser encontrados em induzida SSP-NLCs, e não 7 de CK células positivas foram encontradas em induzida NSP-NLCs (Figura 3A) . Estes dados indicam que apenas SP-NLCs tinha um forte potencial para se diferenciar em diferentes tipos de células maduras. Western blot demonstrou que, embora as células geradas pela NSP-NLCs expressa ALB maior do que as células derivadas de SP-CLN e SSP-NLCs, filhas de SP-NLCs expressaram níveis muito mais elevados de CK-7 do que as filhas de SSP-CLN e NSP- NLCs (Figura 3C). Em particular, CK-7 exibida quase nenhuma expressão nas filhas de NSP-NLCs (Figura 3C). Estes dados foram concordantes com as observações IF.

(A) Através IF, células positivas ALB (verde, núcleos em azul) e 7 de CK células positivas (verde, núcleos em azul) foram diferencialmente produzido pela SP- NLCs, NSP-NLCs e SSP-NLCs. As percentagens de ALB ou 7 de CK células positivas são mostrados em um gráfico de colunas. (B) Em contraste, as células positivas AFP pode ser encontrada após SP-HCC, NSP-HCC e indução SSP-HCC. Os dados estão resumidos no gráfico de colunas.