Abstract

Os microRNAs (miRNAs) desempenham um papel fundamental em muitos processos biológicos e são expressas de forma aberrante em cancros humanos. função de miRNAs em particular, quer como supressores tumorais ou oncogenes e parecem ter significado diagnóstico e prognóstico. Embora inúmeros miRNAs estão dis-regulada no cancro colorectal (CRC) apenas uma pequena fração tem sido caracterizada funcionalmente. Usando pesquisa funcional de alto rendimento e miRNA perfis de amostras clínicas, o presente estudo tem como objetivo identificar os miRNAs importante para o controle do crescimento celular e /ou apoptose em CRC. O rastreio funcional de elevado rendimento foi realizado em seis linhas celulares de CRC transfectadas com uma biblioteca pré-miR incluindo 319 sintética humana pré-miRs. alterações fenotípicas foram avaliados por imunocoramento cPARP clivada (apoptose) ou MKI67 (proliferação). Além disso, TaqMan MicroRNA Humano matriz Definir v2.0 foi utilizado para o perfil da expressão dos miRNAs 667, em 14 de mucosa do cólon normal e 46 microssatélites fase II, os doentes CRC estáveis. Entre os miARNs que induziram a paragem do crescimento e apoptose em linhas celulares de CRC, e ao mesmo tempo foram dis-regulados nas amostras clínicas, o miR-375 foi seleccionado para posterior análise. Independente

análise in vitro

de linhas celulares de CRC transfectadas transientes e estáveis ​​confirmou que o miR-375 reduz a viabilidade celular através da indução da morte apoptótica. Identificamos YAP1 como um miR-375 alvo direto no CRC e mostram que infernos e NOLC1 são alvos a jusante. Knock-down de YAP1 imitou o fenótipo induzido por miR-375 sobre-expressão indicando que miR-375 provavelmente exerce seu papel pró-apoptótica através YAP1 e seu anti-apoptótica a jusante metas BIRC5 e BCL2L1. Finalmente,

análise in vivo

de tumores xenoenxerto rato mostraram que miR-375 expressão reduzida significativamente o crescimento do tumor. Conclui-se que a alta-Throughput Screening miARNs identificadas com sucesso que induzem apoptose e /ou inibem a proliferação de células de CRC. Finalmente, a combinação da análise funcional com perfis de amostras de tecido CRC identificamos miRNAs clinicamente relevantes e alvos de miRNA em CRC

Citation:. Christensen LL, Holm A, Rantala J, Kallioniemi O, Rasmussen MH, Ostenfeld MS, et ai. (2014) Screening Funcional Identifica miRNAs que influenciam apoptose e proliferação do câncer colorretal. PLoS ONE 9 (6): e96767. doi: 10.1371 /journal.pone.0096767

editor: Xin-Yuan Guan, The University of Hong Kong, China

Recebido: 24 Julho, 2013; Aceito: 11 de abril de 2014; Publicação: 03 de junho de 2014

Direitos de autor: © 2014 Christensen et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada pela Fundação Nacional dinamarquesa de Tecnologia avançada, o John e Birthe Meyer Foundation, o Conselho Dinamarquês para Pesquisa Independente (Ciências Médicas), o Conselho Dinamarquês para a Investigação Estratégica, a Fundação Lundbeck e Sétimo Programa-Quadro da União Europeia (SYSCOL SAÚDE-F5 -2.010-258.236). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

O câncer colorretal (CRC) é uma doença maligna comum e uma das principais causas de mortalidade por cancro em todo o mundo. O risco é de cerca de 5% e subindo [1]. CRC é causada pelo acúmulo de numerosas alterações genéticas e epigenéticas. instabilidade cromossômica levando a alélicas contas desequilíbrio para 70-85% dos tumores enquanto que 20-15% têm defeitos DNA mismatch reparação levando a instabilidade de microssatélites. As alterações moleculares no CRC têm sido intensamente estudadas a fim de descobrir marcadores de diagnóstico e prognóstico. Entre outros, o perfil de expressão de ARNm tem sido amplamente utilizada para identificar genes expressos diferencialmente, com implicações de prognóstico e de diagnóstico. No entanto, actualmente nenhum deles foram traduzidos para a prática clínica e, consequentemente, ainda há uma necessidade de melhor caracterização molecular e classificação de CRC.

Os microRNAs (miRNAs) constituem uma classe abundante de pequeno (19-24 nt), de codificação não-moléculas de RNA regulamentares [2]. Eles desempenham um papel crítico no controle da expressão do gene ao nível pós-transcricional por ligação complementar da cadeia miARN alvo para a sequência de ARNm, que conduzem a uma inibição da degradação de ARNm ou de translação [3]. Mais do que 60% de todos os genes codificadores de proteínas contêm sítios de ligação de miARN conservadas e são, portanto, potenciais alvos de miARNs [4]. MiRNAs foram mostrados para ser envolvida em muitos processos biológicos, tais como a proliferação celular, apoptose, diferenciação e angiogénese [5] – [7]. Actualmente, miARNs ter sido demonstrado que desempenham papéis importantes em muitos tipos de cancro (revisto por Garzon et al. [8]). O papel de miARN no desenvolvimento de CRC tem sido intensivamente estudada. Em 2006, Cummins e colaboradores publicaram a primeira análise detalhada e sistemática de expressão miRNA no CRC, mostrando cima e para baixo regulação dos miRNAs específicos [9]. Desde então, vários estudos confirmaram a dis-regulação dos miRNAs no CRC [10] – [15]. No entanto, o nosso conhecimento sobre a função dos miARNs individuais é limitada a um número relativamente pequeno de miARN. rastreio funcional tem sido utilizado para identificar miARNs que são causalmente ligada aos fenótipos específicos (revisto por Izumiya et ai. [16]). Em CRC, rastreio funcional tem sido utilizado em alguns casos para identificar miARNs que afectam a proliferação celular e a morte [17], [18]. No entanto, o estudo realizado por Nakano et ai. foi realizado em apenas uma linha de células e os seus resultados não foram correlacionadas com a expressão dos miARNs em amostras clínicas de CRC. Por fim, o rastreio funcional identificou miRNAs clinicamente relevantes em tumores de células germinativas testiculares pancreáticas e [19], [20].

O potencial de diagnóstico e prognóstico reconheceu de miRNAs e uma necessidade de novas análises funcionais sistemáticas dos miRNAs no CRC encorajou-nos a combinar pesquisa funcional de alto rendimento com expressão miRNA profiling em amostras clínicas. A expressão ectópica de 319 miRNAs em 6 linhas celulares de CRC diferentes foi combinado com miRNA expressão profiling de 14 de mucosa do cólon normal e 46 tumores colorretais. Estas análises identificaram uma série de miRNAs que foram mostrados para ser diferencialmente expressos em CRC e para ter um impacto sobre a proliferação e /ou apoptose celular

in vitro

. Entre eles miR-375 foi selecionado para mais

in vitro

e

in vivo

análises, que confirmou que o miR-375 reduz o crescimento tumoral através da indução da morte apoptótica. Para identificar o potencial de miR-375 mRNA alvo a expressão de miR-375 foi correlacionada com genoma-wide perfis de expressão de mRNA. A análise de correlação de ambos

in vitro

sistemas modelo e amostras de CRC clínicos revelaram que a expressão da proteína Sim associada 1 (YAP1) foi negativamente correlacionada com miR-375. Ago2 imunoprecipitação indicou que YAP1 é um alvo direto de miR-375 no CRC. Outros estudos funcionais indicaram que o papel pro-apoptótico de miR-375 provavelmente é mediada por YAP1 e o seu anti-apoptótica alvos a jusante BIRC5 e BCL2L. Finalmente, helicase-specific linfóide (INFERNOS) e nucleolar e enrolado o corpo proteína fosforescente 1 (NOLC1) foram identificados como alvos a jusante de miR-375 potencialmente jogando um papel na regulação do ciclo celular percursos.

Materiais e métodos

a descrição completa dos materiais e métodos é fornecida no material suplementar (métodos S1).

Declaração de Ética

o uso das amostras de tecidos humanos para fins de pesquisa foi aprovado pelo Conselho de Pesquisa do Instituto Walter e Eliza Hall of Medical Research HREC (coorte 1 AUS; HREC Sem 12/19), a Comissão de Ética da Universidade de Pomerânia (coorte 1 POL; BN-001/174/05) , os Comitês Centrais Dinamarca Região sobre Biomedical Ética em Pesquisa (coorte 1 DK; 1999/4678) e os Comitês Região Sul da Dinamarca sobre Biomedical Ética em Pesquisa (coorte 2 DK; VF-20040047). consentimento informado por escrito foi dado por todos os participantes. Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo (número do arquivo: 2013-15-2934-00861 /ACHOV) Experimentação Animal dinamarquesa Inspecção

As amostras clínicas e linhas celulares

coorte 1 constituída por um total de 46 frescos estável congelada microssatélite (MSS), estágio primário II (T2-4, N0, M0) CRCs e 14 mucosa do cólon normal. Uma coorte independente que consiste em 25 a mucosa de cólon normal e 63 MSS, primário estádio I-IV (T2-4, N0-3, M0 /1) CRCs (coorte 2) foi usado para validação. Pacientes e características da amostra estão resumidos na tabela 1. As linhas celulares, condições de crescimento e de autenticação linha de células pode ser encontrada no material suplementar (Métodos S1).

Animais

BALB /cAnNTac ratinhos imunodeficientes -nude (6-8 semanas, 20-22 g) foram adquiridos a Taconic Europa (DK-4623 Ll. Skensved, Dinamarca). Antes das experiências, os ratos foram proporcionou um período de adaptação de pelo menos 14 dias. Os ratos foram mantidos em condições idênticas (ie temperatura constante ambiente (22 ° C) e um ciclo de luz natural do dia /noite. Comida normal de laboratório e água foram fornecidas ad libitum.

Mirna tela da biblioteca funcional

a tecnologia de microarray local de células foi utilizado para gerar alta densidade pré-miARN microarrays de transfecção como descrito anteriormente com modificações menores [21]. Resumidamente, uma biblioteca que prende 319 humana sintética pré-miARNs (Ambion pré-miR v1.0) (Ambion , Austin, TX, EUA) foi utilizado para a impressão das matrizes. Subsequentemente, as células de CRC (HCT116, LS174T TR4, DLD1 TR7, HT29, Caco2 e SW480) foram semeadas sobre as matrizes e inverter transfectadas durante 48 horas. para permitir microscópica detecção de efeitos pré-miARNs influenciar a proliferação celular e /ou apoptose das matrizes foram imunocoradas para o Ki-67 (marcador de proliferação) e por poli-polimerase ADP-ribose clivado (cPARP) (marcador de apoptose). o ADN foi corado usando 4 ‘, 6 diamidino -2-fenilindolo (DAPI) (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) ou SYTO60 (Invitrogen). A análise foi realizada com microarrays de imagem microscópica das matrizes utilizando scanR Imager elevado teor (Olympus) e o efeito de sobre-expressão de miARN sobre a proliferação celular e a apoptose foi considerado como previamente descrito [21]. Resumidamente, após a normalização um z-score (z = (χ-μ) /σ) foi calculada para pontuação dos valores momentâneos medidos. χ = valor normalizado nível local, μ = matriz global média e σ = desvio padrão (SD)

RNA e isolamento miRNA

RNA total ( 200 bases). foi isolado de sedimentos celulares e amostra de tecido congelado de fresco utilizando RNeasy Mini Kit (Qiagen), de acordo com as instruções do fabricante. Os pequenos RNAs ( 200 bases) foram recuperados a partir da fracção de fluxo utilizando RNeasy Kit Micro em conjunto com as colunas RNeasy (Qiagen MinElute de spin) (descritos no material suplementar (Métodos S1)). Os pequenos RNAs do RNAlater preservada amostras de tecidos foram isolados directamente utilizando o Kit RNeasy Micro (Qiagen).

miRNA profiling em amostras clínicas

O perfil de expressão miRNA foi realizada utilizando o loop-tronco RT- baseada qPCR TaqMan MicroRNA humano matriz v2.0 Definir como indicado pelo fabricante (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, EUA) [22]. O algoritmo NormFinder foi utilizado para identificar genes de referência adequadas [23].

miRNA e mRNA RT-qPCR

único tubo TaqMan microRNA ou ensaios de mRNA (Applied Biosystems) foram usados ​​para quantificar miRNAs maduros individuais ou mRNAs (detalhes no suplementar do material (Métodos S1)). O ensaio TaqMan da Applied Biosystems de ID e o iniciador utilizado para a detecção de ARNm de ubiquitina gene de referência C (UBC) estão listados na Tabela S1 S1 Ficheiro.

Ensaio MTT

As células foram semeadas em placas de 96 placas Bem, inverta-transfectadas e incubadas durante 72 horas com pré-miRs ou siRNAs. A viabilidade das células /proliferação foi medida usando 3- [4,5-dimetiltiazol-2-il] -2,5-brometo de difeniltetrazólio (MTT) (Roche Applied Science, Penzberg, Alemanha) (descrito no material suplementar (Métodos S1)). Os Applied Biosystems pré-Mir e

Silencer

Selecione siRNA IDs e as sequências da YAP1 siRNAs de GenePharma (Xangai, China) estão listadas na Tabela S2 em S1 Arquivo.

ensaio de LDH

as células foram semeadas em placas de 96 poços e inverter-transfectadas durante 48 ou 72 horas com pré-miRs ou ARNsi (Tabela S2 em S1 ficheiro) (mais detalhes são encontrados no material suplementar (Métodos S1)). Posteriormente, a morte celular (LDH) foi medido utilizando o Kit de Detecção de citotoxicidade

PLUS (LDH) (Roche Applied Science).

Caspase 3/7 atividade ensaio

A Caspase 3 /7 ensaio de actividade foi utilizada para medir a morte apoptótica e efectuada essencialmente tal como descrito anteriormente [24]. Resumidamente, as células foram semeadas em placas de 24 poços e inverter-transfectadas com pré-miRs ou ARNsi durante 48 horas (Tabela S2 em S1 do ficheiro). A Caspase 3/7 inibidor (Z-DEVD-FMK) (Biovision, San Francisco, CA, EUA) foi adicionado 6 horas após a transfecção (concentração final 25 uM). Caspase 3/7 actividade nos lisados ​​de células, medida pela libertação de AFC (excitação, 400 nm; emissão 489 nm) a partir do substrato Ac-DEVD-AFC (Biomol, Plymouth Meeting, PA, EUA), foi medida utilizando um leitor multiplacas ; Multiscan MCC /340 (ThermoFisher Scientific).

Captura Laser Microdissecção

Captura Laser Microdissecção (LCM) foi realizada em criocortes de cancro emparelhado e biópsias da mucosa do cólon normais adjacentes (descrito em detalhe no Suplementar Material (Métodos S1)). As células epiteliais foram capturados em tampões individuais com o Veritas 704 Microdissecção Instrumento (Applied Biosystems) usando corte a laser ultravioleta de acordo com as instruções dadas pelo fabricante.

Os MIR-375 níveis de metilação em linhas celulares de CRC e amostras clínicas

Bissulfito modificado DNA foi genoma inteiro amplificado e hibridado com Infinium HumanMethylation450 BeadChips (Illumina, San Diego, CA) durante a noite, como descrito pelo fabricante. BeadChips foram digitalizados com um instrumento BeadXpress Reader (Illumina) e os dados analisados ​​através Bead Estúdio metilação Módulo de Software (Illumina). níveis de metilação foram fornecidas em valores beta, com um valor beta de 0 correspondente à ausência de metilação e 1 corresponde a metilação completa. Os IDs dos locais de CpG nas proximidades de

MIR-375

foram os seguintes CpG1; cg00215432, CPG2; cg00218620, CpG3; cg00705280, CpG4; cg02257674, CpG5; cg04348419, CpG6; cg06214770, CpG7; cg14358282, CpG8; cg21615583, CpG9; cg22306928, CpG10; cg01822124 e CpG11; cg26394220.

análise ChIP

A análise ChIP foi realizada como descrito anteriormente [25]. Os iniciadores utilizados para amplificar as regiões do DNA ChIP estão listadas na Tabela S1 S1 Arquivo.

Identificação de potenciais alvos de miR-375 com base em perfis de mRNA e

in silico

previsão alvo

o perfil de ARNm de miR-375 transfectadas células HCT116 e as amostras clínicas são descritos no material suplementar (Métodos S1). A localização eo número de sequências de sementes miR-375 (ou seja, complementar à posição 2-8 do miRNA) dentro da sequência de mRNA comprimento total foram mapeados utilizando dados de sequências recuperadas do TargetScan v5.2 e Ensembl 62 bases de dados [26], [27 ].

ago2 imunoprecipitação

Scr e miR-375 células transfectadas (~3.5 × 10

6) foram raspadas dos frascos de cultura no gelo em tampão de lise suave (20 mM Tris pH 7,5 , 10 mM de NaCl, 0,5% de NP-40, EDTA a 2 mM, suplementado com inibidor de RNase RNaseOut (Invitrogen) e cocktail completo Mini inibidor de Protease (Roche)) e hypertonically lisadas através do aumento da concentração de NaCl para 150 mM. Após centrifugação a 4 ° C e 19000 * g durante 10 minutos, o sobrenadante foi recolhido e submetido a imunoprecipitação (10% foi utilizado para o controlo de entrada) por incubação com anticorpo monoclonal ago2 (11A9) (Sigma-Aldrich) -bound Proteína G-acoplada Dynabeads magnéticas (Life Technologies) (15 mg 11A9 por 25 ml pérolas) seguindo as recomendações do fabricante. Anti-Flag imunoprecipitação foi feita em paralelo como um controlo negativo (o anticorpo F1804, Sigma). As pérolas foram lavadas 5 vezes em tampão de lavagem gelado (Tris 50 mM pH 7,5, NaCl a 150 mM e 0,05% de NP-40). RNA total de entrada, ago2-IP e complexos FLAG-IP foi purificado usando QIAZol (Qiagen).

Ingenuity Pathway Analysis

Ingenuity Pathway Analysis (IPA) software (Ingenuity Systems, da cidade de Redwood, CA, EUA) foi utilizado para obter conhecimento sobre as alterações biológicas totais introduzidos pela expressão ectópica de miR-375. dados de mRNA normalizadas e filtradas foram enviados para o IPA. Usando o Ingenuity Pathways Base de Conhecimento (IPKB) cada gene foi associado a funções específicas, caminhos e doenças e uma análise de enriquecimento foi realizada examinar se os dados foram enriquecidas para genes associados com uma função particular. O teste exato de Fisher foi aplicado para avaliar a significância dos enriquecimentos

A extração de proteínas e Western blot

A extração de proteínas e análise Western blot foram realizadas de acordo com procedimentos padrão (detalhes em material suplementar (Métodos S1) ).

Construção de plasmídeos para o repórter da luciferase ensaio

fragmentos seleccionados das 3’UTRs de INFERNOS (NM_018063) e NOLC1 (NM_004741) contendo locais de ligação putativo miR-375 foram amplificados do normal DNA genómico humano e clonado a jusante do

Renilla

gene da luciferase no vector siCHECK-2 (Promega, Fitchburg, WI, EUA). construtos seleccionados foram mutados na região de ligação putativo miARN usando QuickChange relâmpago Kit de mutagénese dirigida ao local (Agilent Technologies) de acordo com o protocolo fornecido. Os detalhes são fornecidos no material suplementar (Métodos S1) e os iniciadores utilizados para mutagénese de clonagem e de site dirigido estão descritos na Tabela S3 em S1 Arquivo.

repórter luciferase ensaio

As células transfectadas HEK-293T foram analisados ​​usando dupla Glo luciferase Assay System (Promega) como descrito anteriormente [28] (detalhes estão descritos no material suplementar (Métodos S1)). A luminescência foi detectada com um leitor multiplacas; Multiscan MCC /340 (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, EUA). O

Renilla

actividade da luciferase foi normalizada para o

Firefly

actividade da luciferase para cada transfectadas bem, para corrigir diferenças de transfecção e colheita eficiências.

Geração e caracterização de HCT116 estável células com expressão indutível de miR-375

a geração de células HCT116 estáveis ​​com expressão indutível de miR-375 é descrita em detalhe no material suplementar (Métodos S1). Inicialmente,

MIR-375

foi clonado a região 3 ‘UTR do

Turbo fluorescência vermelha do gene da proteína

(tRFP) do vector pSBInducer10 (

MIR375

_pSBInducer10). O vector pSBInducer10 foi construído através da substituição de elementos no vector lentiviral pINDUCER [29] com sleepingbeauty repetições terminais invertidas. Estável agrupamentos de células HCT116_miR-375 e HCT116_Scr foram gerados como se segue. Em primeiro lugar, a 1,5 × 10

6 células HCT116 foram transfectadas com pCMV-SB100XCO (vector com transposase) e ou

MIR375

_pSBInducer10 (HCT116_miR-375) ou

Scr

_pSBInducer10 (HCT116_scr). Quarenta e oito horas pós-transf ecção de puromicina (concentração final de 1 ug /mL) (Sigma) foi adicionado a seleccionar as células transfectadas de forma estável. A selecção puromicina foi realizada durante 5 dias. Subsequentemente, as células foram tratadas com 50 ug /ml de doxiciclina (DOX) (Sigma) durante 48 horas levando a activação da transcrição do tRFP-

MIR375

cassete. O marcador de fluorescência tRFP foi utilizado como um substituto para classificar para populações de células que expressam o mais elevado nível de miR-375 após a indução da DOX. Resumidamente, as células com o nível mais elevado tRFP (100-1000 vezes acima do nível de fundo em células não tratadas) (HCT116_miR-375H e HCT116_ScrH) foram isolados por células activadas por fluorescência (FACS) utilizando um FACSAriaIII 4-laser (BD Biosciences, San Jose, CA) e utilizado para todas as análises subsequentes. Dox expressão dependente de miR-375 maduro nas células HCT116_miR-375H foi analisado por RT-qPCR como descrito anteriormente. As células HCT116_miR-375H foram fenotipicamente caracterizadas usando xCELLigence (Roche Applied Science), Caspase 3/7 ensaios e YAP1 Western Blotting (detalhes no material suplementar (Métodos S1)).

In vivo

a análise do crescimento do tumor

células

HCT116_miR-375H (3,5 × 10

6 células por injecção) foram suspensos em 200 ul de PBS e injectadas por via subcutânea no flanco esquerdo de murganhos anestesiados (n = 12). Os ratos foram divididos em dois grupos com 6 animais em cada grupo: A; miR-375 (+ DOX) e o Grupo B; controlo (- DOX). Os tumores foram medidos com regularidade (comprimento e largura) pelo mesmo observador. Para induzir a expressão de miR-375, DOX (Vibradox Sandoz) (0,2 mg /ml) foi adicionado à água de beber dos ratinhos no grupo A, quando os tumores atingiram um tamanho de cerca de 50 mm

3. Os ratinhos no grupo B receberam água de beber normal. O tratamento DOX foi realizada durante 14 dias. Quatro ratinhos foram retirados do estudo antes do tratamento com DOX (dois tinham tumores muito rápido crescimento e dois tinham tumores que pararam de crescer) ou seja, n = 4 no Grupo A e B. O volume de tumor estimado (EV) foi calculada como EV = comprimento x (largura)

2 × 1/2. EV foi em função do número de dias após o início do tratamento dox e crescimento de xenotransplante curvas foram geradas.

A análise estatística

O significado das mudanças de expressão de miRNA foram analisados ​​utilizando o teste de Mann Whitney U na Experimento Viewer (MeV) software analisador de matriz multi [30]. O agrupamento hierárquico de miARNs diferencialmente expressas foi realizada utilizando Gene Cluster 3.0 [31]. Apenas, miARNs que foram expressas em mais de 80% das amostras foram incluídos. mapas de calor foram gerados com Java TreeView [32]. de Student não pareado

t

-test foi aplicado para comparar mudanças induzidas miRNA com respectivos controles no ensaio MTT, LDH ensaio, ensaio de apoptose, análise de RT-qPCR e

in vivo

análise o crescimento do tumor. teste t emparelhado de Student foi utilizado para a análise de RT-qPCR de amostras de tecido microdissecadas. A

p

-valor 0,05 foi considerado estatisticamente significativo

Resultados

high-throughput screening identifica uma série de miRNAs que induz a apoptose e /ou inibe a proliferação de células no CRC. linhas

Para identificar miRNAs com o impacto mais consistente sobre o crescimento e /ou sobrevivência de células cancerosas CRC foi realizado um rastreio de alto rendimento em seis linhas celulares de CRC, usando uma biblioteca segurando 319 sintética humana pré-miRNAs. alterações pré-miR induzidas em cPARP e Ki-67 foram usadas para identificar miARNs que induziram apoptose e /ou inibir a proliferação respectivamente. Distribuições dos escores z para cada pré-miR são mostrados na Figura S1. Os produtos de classificação z-score foram utilizados para identificar a consistência dos efeitos pré-miRNA em todas as linhas celulares testadas CRC [33]. O produto Ranking Top-40 pré-miRs estão listadas na Tabela S4 no arquivo S2 (aumento cPARP) e Tabela S5 em Arquivo S2 (reduzido Ki-67). Vários dos Top-40 classificados miARNs ter sido previamente demonstrado que afectam quer a apoptose e /ou proliferação

In vitro

(um subconjunto destes estão apresentados na Tabela S6 em S1 do ficheiro).

miARN perfil de expressão amostras clínicas

Para resolver o

in vivo s

ignificance dos miRNAs identificados no rastreio funcional de alto rendimento que perfilado a expressão de 667 miRNAs únicos em 14 mucosa do cólon normal e tecido amostras de 46 amostras clínicas da fase II CRC. No total, 53 miARNs foram diferencialmente expressos entre a mucosa normal e (p≤0.01 teste U de Mann Whitney e 1.5≤FC

(log2) ≤-1,5) CRC (Figura 1 e Tabela 2). Um subconjunto de 25 miRNAs mostraram aumento da expressão em tumores de CRC em relação a mucosa normal, enquanto que 28 miRNA foram regulada para baixo nos tumores CRC. Combinando os resultados do perfil de miARN de amostras clínicas com os resultados do rastreio funcional de alto rendimento foram identificados 10 miARNs que foram diferencialmente expressos em amostras de CRC clínicos e, ao mesmo tempo induziu alterações fenotípicas na triagem funcional (Top-40 classificados) (Tabela 2 e Tabela S6 no arquivo S1). miARNs Adicionalmente, oito dis-regulados induziu alterações fenotípicas em, pelo menos, uma linha de células, mas não foram classificados Top-40 (Tabela 2). Onze dos miRNAs acima foram regulada para baixo e, portanto, estes miRNAs são tumorais candidatos supressores. Finalmente, 20 dos miARNs dis-regulados não foram incluídos na pré-miARN biblioteca de Ambion e, consequentemente, a sua capacidade para induzir mudanças fenotípicas não podem ser analisados ​​no presente estudo (Tabela 2). Em conclusão, nós identificamos 11 miRNAs que foram regulados negativamente em amostras de CRC e ao mesmo tempo a proliferação induzida e /ou inibiram a apoptose em linhas celulares de CRC e, portanto, estes miRNAs estão potencialmente envolvidos na tumorigênese colorretal.

agrupamento hierárquico de miRNAs com uma expressão diferente significativa entre adenocarcinomas colorretais e amostras de cólon mucosa normal (p≤0.01). As linhas representam miRNAs individuais e as colunas representam amostras de tecido individuais. A escala representa a intensidade da expressão de genes (log2 escala variando entre -2,98 e 2,98) (os valores de p e FCS são encontrados na Tabela 2). Os miRNAs marcados com azul foram encontrados para inibir a proliferação e /ou induzir a apoptose em tela de high-throughput (Top-40 classificou miRNAs).

Validação dos fenótipos identificados no alto tela de transferência

Para validar os fenótipos identificados, os miRNAs que foram regulados negativamente em amostras clínicas e Top-40 classificados na tela de fenótipo (miR-150, miR-375, miR23b, miR-138, miR- 139-5p e miR-9) foram sujeitos a análise funcional detalhada usando HCT116, HT29, LS174T TR4, TR7 DLD1 e linhas celulares de cancro do cólon SW480. Temos publicou recentemente uma análise funcional detalhada de miR-139-5p e, portanto, miR-139-5p não foi incluído nestas análises [25]. A expressão ectópica de miR-375, miR-9 e miR-138 reduziu significativamente a viabilidade de mais do que uma linha celular (redução do MTT 20% e p £ 0,05) (Figura 2A (HCT116) e na Figura S2), possível devido para uma função geral de anti-proliferativa ou pró-apoptótica destes miARNs. miR-150 e miR-23b apenas reduziu a viabilidade de uma linha celular (DLD1 TR7). Entre os restantes miARNs, miR-375 foi identificado como um indutor de apoptose miARNs na tela de alto rendimento. Para validar essa constatação, realizamos LDH e caspase 3/7 ensaios em linhas celulares de CRC transfectadas. MiR-375 aumentou a actividade da caspase 3/7 e demonstrou aumento coincidente na morte celular (libertação de LDH) em ambos HCT116 e DLD1 TR7 (Figuras 2B e C, e a Figura S3). Além disso, a morte por apoptose induzida por miR-375 poderia ser inibida com Z-DEVD-FMK (Caspase 3/7 inibidor) (Figura 2D), demonstrando que a apoptose induzida é dependente de caspase 3/7 actividade. Em conclusão, a análise de validação confirmou o papel anti-proliferativa de miR-9 e miR-138, e a apoptose capacidade de miR-375 induzindo como identificados na análise de alto rendimento. Os miRNAs acima tenham sido previamente mostrado ser dis-regulados em cancros humanos e para reduzir a proliferação e /ou induzir a apoptose

in vitro

(Tabela S6 no arquivo S1). miR-375 e miR-138 não foram funcionalmente caracterizados em detalhe no CRC. Finalmente, miR-375, miR-138 e miR-9 foram selecionados para uma análise mais aprofundada devido ao seu baixo-regulação em amostras clínicas e sua capacidade de induziu alterações fenotípicas

in vitro

.

( A) viabilidade celular (ensaio MTT): Os dados são apresentados como ± DP. de pelo menos 3 experiências independentes, cada um com três réplicas biológicas e normalizada para a RCS. * Valor de p 0,05 e redução de MTT 20%. (B) A morte celular (ensaio de libertação de LDH): A morte celular foi expressa como percentagem de LDH libertada para fora do LDH celular total. Pelo menos duas experiências independentes foram realizados e executados em triplicado. O resultado de um experiências representativas ± sd. é mostrado. * Valor de p 0,05. (C) indução de apoptose (Caspase 3/7 actividade): A actividade de caspase 3/7 no lisado de células pré-miARN transfectadas foi examinada por análise cinética fluorimétrico e expressas em relação à actividade da caspase em 3/7 “Scr” transfectadas células. Os dados são apresentados como ± DP. de pelo menos 2 experiências independentes, cada uma com três réplicas biológicas. * Valor de p 0,05. (D) Inibição de miR-375 a apoptose induzida pelo inibidor da Caspase 3/7 Z-DEVD-FMK. A actividade da caspase 3/7 foi medida como descrito em (C). Z-DEVD-FMK (DEVD) (25 uM) foi adicionado às células de seis horas após a transfecção. As células não tratadas (NT), Lipofectamine somente (Lipo) e pré-miR miRNA Precursor Moléculas-Negativo Controle # 1 (SCR) foram incluídos como controlos negativos em todos os ensaios. As-miR-145 pré células transfectadas foram incluídos como um controlo positivo para o desempenho do ensaio MTT. (E) A sub-regulação de miR-375 é um resultado de expressão reduzida nas células epiteliais do tumor. Expressão de miR-375 na captura de laser microdissectados tecido de cancro colorectal. A expressão foi analisada em células epiteliais e de estroma de adenocarcinomas colorrectais emparelhadas (n = 3) e adjacente normal (n = 3) biópsias da mucosa do cólon de LCM através de RT-qPCR. As colunas representam a expressão significa em três amostras ± sd.

Detecção de miR-375, miR-138 e miR-9 em laser de microdissectados tecido colorectal

Para elucidar a origem celular de miR-375, o miR-138 e miR-9, foi medida a sua expressão em adenocarcinomas colorrectais a laser capturado microdissecados e mucosa do cólon normal adjacente (Figura 2E e Figura S4). Estas análises mostraram que em mucosa de cólon normal de miR-375 foi expressa a um nível mais elevado nas células epiteliais do que nas células do estroma (p = 0,02) (Figura 2E). Considerando que, no adenocarcinoma de miR-375 foi expressa em níveis comparáveis ​​em células epiteliais e do estroma (p = 0,27). Além disso, o miR-375 a expressão em células epiteliais normais foi significativamente mais elevada do que a expressão em células epiteliais de adenocarcinoma (p = 0,03). No geral, estes resultados indicam que a sub-regulação de miR-375 em CRC é um resultado de uma redução na expressão de miR-375 em células epiteliais de tumor. miR-9 e miR-138 foram expressas principalmente pelas células do estroma, tanto mucosa de cólon normal e adenocarcinomas (Figura S4). Estes resultados são consistentes com os perfis de expressão miRNA previamente publicados de microdissectados a laser normais da mucosa, adenomas e adenocarcinomas [34]. *

p Art 0,05.