Abstract

MicroRNA regulamenta respostas celulares à radiação (IR) ionizante através do controle de translação de genes alvo. Foram analisadas as mudanças de séries temporais na expressão de microRNA seguintes irradiação γ em H1299 células de câncer de pulmão através da análise de microarray. Significativamente alterada microARNs IR responsivas foram seleccionados com base na análise de análise de variância, e previu mRNAs alvo foram enriquecidas em proteína-quinase activada por mitogénio (MAPK) de sinalização. A análise simultânea de mRNA de séries temporais e perfis de microRNA descobriram que a expressão de miR-26b foi regulada negativamente, e seu alvo fator ativador de transcrição 2 (ATF2) mRNA foi-se regulamentada em células H1299 irradiadas-gama. IR em miR-26b overexpressed células H1299 não pode induzir a expressão de ATF2. Quando a actividade da quinase c-Jun N-terminal foi inibida usando SP600125, expressão de miR-26b foi induzida a seguir a irradiação com raios γ em células H1299. A partir desses resultados, concluímos que IR induzida pelo aumento da regulação do ATF2 foi coordenada reforçada pela supressão de miR-26b em células de câncer de pulmão, o que pode aumentar o efeito de IR na via de sinalização MAPK

Citation.: Arora H, Qureshi R, Parque AK, Parque WY (2011) coordenado Regulamento de ATF2 por miR-26b em células γ irradiados câncer de pulmão. PLoS ONE 6 (8): e23802. doi: 10.1371 /journal.pone.0023802

editor: Sangdun Choi, da Universidade Ajou, Coreia

Recebido: 16 de junho de 2011; Aceito: 26 de julho de 2011; Publicação: 25 de agosto de 2011

Direitos de autor: © 2011 Arora et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este artigo é apoiado por uma bolsa Coreia Ciência e Engenharia Foundation (KOSEF) (M20706000020-07M0600-02010) e pelo programa Laboratório de Pesquisa básica (BRL) através da Fundação Nacional de Pesquisa da Coreia financiado pelo Ministério da Educação, Ciência e Tecnologia (2009 -0087452) e pela Coreia do Healthcare Tecnologia R D Project, Ministério da Saúde, Bem-Estar e Assuntos da família (A084022). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

MicroRNAs são transcritos pela polimerase de ARN II e ligam-se a região 3 ‘não traduzida (UTR) para suprimir a tradução de mRNAs alvo [1]. Ao nível pós-transcricional, microARNs estão envolvidos em muitos processos biológicos, incluindo o desenvolvimento [2], a proliferação, a morte de células [3], e tumorigénese [4]. Muitos estudos têm analisado a regulação da transcrição de mRNAs e microRNAs em células irradiadas-gama para entender as respostas celulares a radiação (IR) ionizantes [5], [6], [7].

O MAP quinase (MAPK) desempenha um papel importante em vários processos biológicos, tais como a apoptose, proliferação, diferenciação, a sinalização de Wnt, e de sinalização de p53. sinalização MAPK é frequentemente desregulado em cancros humanos, levando à proliferação celular descontrolada e sobrevivência [8]. IR pode induzir a activação de vias de MAPK para controlar a sobrevivência celular de um modo dependente do tipo de célula [9]. A activação responsiva de IR de vias de sinalização MAPK está relacionada com a proliferação das células [10].

A maioria das vias de sinalização celular pode ser regulada por controlo da transcrição e pós-tradução de genes. O microARNs miR-7, miR-4, miR-79, o miR-2, e miR-11 estão envolvidas em vias de sinalização Notch, visando os motivos de sequências reguladoras da UTR 3 ‘de genes alvo [11]. miR-15 e miR-16 está envolvida na via de sinalização Nodal [12]. factor nuclear kappa de luz potenciador gene do polipéptido em células B-1, um mediador de sinalização de danos de ADN, é regulada por miR-9 e deixou-se 7 g em resposta ao IR em linhas celulares de cancro do pulmão [7]. No presente estudo, examinamos o perfil de expressão de séries temporais de microRNAs em linhas celulares de cancro do pulmão irradiado-gama. Procuramos identificar microRNAs IR-sensível que regulam a expressão de genes MAPK sinalização através da análise simultânea de perfis de microRNA e mRNA. Nós demonstramos a regulação coordenada de fator ativador de transcrição 2 (ATF2), que é codificada por um gene sinalização MAPK, por miR-26b em resposta ao IR.

Resultados

Para entender o controle pós-transcricional de as respostas celulares a IR por microARNs, o perfil de expressão do genoma de microARN foi examinado em células de cancro do pulmão humano H1299, a 0, 4, 8, 12, e 24 horas após o tratamento com 2 Gy de radiação-γ. O perfil de expressão microRNA foi analisada por uma análise de variância (ANOVA) para selecionar microRNAs IR-responsivos. Entre 328 microARNs humanos no micro-arranjo, a expressão de 56 (17,1%: 30 regulada para cima e para baixo 26-regulado) foi significativamente alterada em células H1299 (p 0,05; Figura 1 e Tabela S1). alterações proeminentes foram observadas em 8 horas após a irradiação y, na maioria dos microARNs IR responsivas.

reversamente transcrito a partir de pequenos RNAs cada ponto de tempo foram marcados com Cy5. O código de cor representa a expressão relativa da microARNs indicado para cada ponto de tempo. Uma lista de todos os microRNAs está disponível na Tabela S1.

Para explorar o significado fisiológico de IR-responsiva microRNA, listamos previu mRNAs alvo de microRNAs IR-reactivos e as vias de sinalização enriquecido foram selecionados com base em enriquecimento e análise estatística de mRNA-alvo previsto por DIANA-microT-3.0. Entre as vias de sinalização listados, enfocamos os 10 melhores caminhos com base na significância estatística (Tabela 1). Especialmente escolheu o MAPK caminho para uma análise mais aprofundada sinalização porque esta via de sinalização é essencial para a sobrevivência em resposta a danos no DNA [13].

Para validar regulação da via de sinalização MAPK por microRNAs IR-sensíveis, nós meta-análise perfis de expressão de ARNm das mesmas células H1299 irradiadas com y dos seus conjuntos de dados publicados [14]. Na análise simultânea de ARNm alvo e IR-responsivo microARN, aplicou-se dois critérios: 1) as alterações estatisticamente significativas (p 0,05) na expressão de ARNm em cima γ-irradiação por análise de variância, e 2) o valor elevada correlação inversa (P -0,4 ) entre ARNm e expressão microARN. Como resumido na Figura 2 e Tabela S2, foram identificados 35 pares de microRNAs IR-reactivos e de mRNAs alvo, incluindo 19 microRNAs e 23 mRNAs não sobrepostos para MAPK sinalização genes da via em células H1299.

validados os padrões de microRNAs e mRNAs alvo IR responsivas expressão para a via de sinalização MAPK. Entre os 35 pares, foram selecionados e analisados ​​quatro (miR-26b: ATF2, o miR-7: FOS, miR-20a: MAP3K5, e miR-128: PPARg) pares por reacção em cadeia com transcrição reversa da polimerase (RT-PCR; Figura 3A , B, C e D). Como detectado em conjuntos de dados de microarrays (Figura 2), descobrimos que ATF2, FOS, e MAP3K5 foram-se regulada e PPARG foi regulada negativamente por exposição IR. MicroRNAs como miR-26b, miR-7 e miR-20a foram regulados e miR-128 foi-se regulada por exposição IR. Por em tempo real de RT-PCR, foi demonstrado que os padrões de IV seleccionados microARNs-reactivos e de ARNm alvo de expressão foram bem entrosados ​​com os dos dados de expressão de microarray.

A expressão de quatro pares de microARN e sequências alvo de ARNm tal como (a) o miR-26b: ATF2, (B) o miR-7: FOS, (C) o miR-20a: MAP3K5, e (D) o miR-128: PPARg) foram quantificados utilizando em tempo real cadeia de polimerase inversa reacção (RT-PCR), na hora indicada. Os valores foram normalizados com gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (GAPDH) de ARNm para mRNAs alvo e U6B pequeno ARN para microARNs. Todos os valores são apresentados como médias ± desvio padrão (SD) a partir de experiências em triplicado.

Down-regulada microRNAs IR-sensível pode aumentar a função de mRNAs alvo. Para testar a relação entre microRNAs IR-responsive regulada para baixo e mRNAs alvo, foi selecionado o par de ATF2 e miR-26b entre 35 pares de demonstrar regulação coordenada entre microRNAs e mRNAs alvo após exposição IR. Um alvo previsto foi identificado para miR-26b na posição 112-118 da ATF2 UTR 3 ‘, como mostrado na Figura 3A. A sobre-expressão de miR-26b em células H1299 poderia suprimir o nível de ARNm de expressão ATF2. Além disso, o nível de proteína de ATF2 foi diminuída em células de miR-26b-sobre-expressos (Figura 4A). Em ensaios de luciferase, o miR-26b suprimiu a tradução da luciferase em construções com a UTR 3 ‘de ATF2, mas não aqueles sem a 3’ UTR (Figura 4B). O efeito supressor de miR-26b em ATF2 foi também observada em células H1299 irradiadas-y (Figura 4-C), que foi mantida até 12 horas após a exposição ao IV.

(A) Em miR-26b transfectadas células H1299, a expressão de microARN foi confirmada por em tempo real de RT-PCR. A expressão de ARNm de ATF2 em miR-26b células transfectadas foi medido pelo tempo real de RT-PCR. Os níveis de expressão relativos ATF2 foram normalizados contra a GAPDH e apresentados como média ± DP a partir de experiências em triplicado. O nível de proteína de ATF2 foi também examinada por western blot em células transfectadas-microRNA. (B) As células foram transfectadas com o gene repórter de luciferase de Renilla vazio (psiCHECK2) ou o gene repórter fundido com o ATF2 UTR 3 ‘. Além disso, as células foram co-transfectadas com o miR-26b ou sem miR-26b; Os resultados são expressos como unidades de luz relativas (RLU) e foram normalizadas com a actividade de luciferase expressa constitutivamente pelo vector psiCHECK2. horas (C) A expressão relativa de ATF2 no miR-26b transfectadas e IR células expostas a 4 (branco), 8 (cinzento) e 12 (preto), respectivamente.

Em seguida, queríamos para confirmar o efeito de sinalização MAPK na sub-regulação de miR-26b em células irradiadas com raios y. Nós inibida a via de sinalização MAPK através SP600125, um inibidor da quinase c-Jun N-terminal (JNK), em células H1299 irradiadas com y. O tratamento com SP600125 não alterou o nível de expressão basal do ATF2; No entanto, a indução de ATF2 sobre γ-irradiação foi marcadamente bloqueada em células H1299 tratadas com SP600125 até 12 horas após a exposição IV (Figura 5A). Expressão de ATF2 requer a activação da sinalização MAPK, que foi inibida pelo inibidor da JNK pela química. Por outro lado, a expressão de miR-26b foi induzida por tratamento com SP600125 em células de cancro do pulmão H1299 (Figura 5B). Os efeitos de SP600125 sobre a expressão de ARNm de ATF2 e miR-26b foram também confirmadas em linha de células de cancro do pulmão A549 (Figura 5).

H1299 e as células A549 foram tratadas com 10? M SP600125 durante 30 minutos, e, em seguida exposto a IR. As expressões relativas de ARNm ATF2 (A) e miR-26b (B) foram normalizados para o nível de controlo da expressão, a 0 horas em ambos o controlo e as células tratadas com SP600125 a 4 (branco), 8 (cinzento) e 12 (preto ) horas. (C) A radiação ionizante induzida a expressão de ATF2, que regulada a expressão de miR-26b em células de câncer de pulmão irradiado-gama.

Discussão

As respostas celulares à estimulação exógena pode ser monitorizada por alterações na expressão de genes, incluindo expressão de microRNAs. IR pode induzir mudanças progressivas na célula de sobrevivência, crescimento e proliferação por afetar a expressão do gene. Os relatórios anteriores sugeriram que a radiação pode mudar o padrão de genes [15], [16] expressão. Analisou-se os perfis de microRNA para entender o mecanismo de respostas celulares mediadas pelo microRNA a IV, e para identificar regulação da via de sinalização MAPK por microARNs IR responsivas. No presente estudo, nós elucidaram a repressão da transcrição mediada por JNK, de miR-26b em células irradiadas com raios y, para o qual microARN pode suprimir a tradução de ARNm alvo ATF2, um membro da via de sinalização MAPK. A partir desses resultados, sugerimos que a resposta celular ao IR é coordenadamente regulada pela interação entre a via de sinalização MAPK e microRNA.

ATF2 é um (CREB) proteína de ligação ao elemento cAMP-resposta com um zíper básica leucina (bZIP) de domínio, através da qual ATF2 interage com outras proteínas bZIP tais como jun, FOS, CREB, ATF1 e [17], [18]. danos no DNA e as citocinas pró-inflamatórias pode provocar a activação da actividade de transcrição por JNK ATF2 [19]. O papel da sinalização diverso na activação de ATF2 é também ilustrado pelos parceiros heterodiméricas de ATF2, que também são activadas de um modo específico do estímulo. Assim, um estímulo particular pode levar a diferentes complexos ATF2, ativando ou reprimindo sub-conjuntos distintos de genes-alvo [20].

miR-26b é um microRNA intrônica residente em intron IV do CTDSP1, C-terminal pequeno domínio de fosfatase 1. O controlo de transcrição de ARNm CTDSP1 hospedeiro não é totalmente compreendido, mas existem muitos sítios de ligação putativos de factores de transcrição, tais como CREB em CODIFICAR Transcription factor de ligação Análise [21]. ATF2 conseguiu reprimir a transcrição de genes-alvo através de dimerização com outros fatores de transcrição bZIP. A sobre-expressão de proteínas bZIP tais como ATF2 e CREB alterou a expressão de genes em células do miométrio humano [22]. Meta-análise sobre este conjuntos de dados de microarranjos em GEO (GSE1059) revelou down-regulação da CTDSP1 em células overexpressed-ATF2. Nós precisamos de um estudo mais aprofundado sobre o controlo transcricional de miR-26b por ATF2 em células de câncer de pulmão; No entanto, a actividade de JNK e de expressão reprimida ATF2 expressão de miR-26b é realizada no estudo corrente.

A desregulação da via de sinalização MAPK pode ser induzida por dano de DNA IR induzida por [23]. No presente estudo, verificou-se que a sinalização MAPK é induzida em células H1299 irradiadas-y, o qual pode mediar a sobrevivência de células do cancro do pulmão H1299 após exposição IR. Além disso, a activação da sinalização MAPK levou a sub-regulação de miR-26b, no qual a manutenção da actividade ATF2 por sua vez. A partir desses resultados, foi possível demonstrar que a exposição de células de câncer de pulmão H1299 para IR de sinalização de MAPK induzida seguida de supressão da expressão de miR-26b, que levou à fuga de mRNA ATF2 de supressão pós-tradução por miR-26b. Propomos que miR-26b medeia coordenar a regulação de ATF2 e a via de sinalização MAPK em resposta ao IR.

Materiais e Métodos

cultura celular

células do cancro do pulmão humano

H1299 foram mantidas em meio RPMI 1640 e as células A549 foram cultivadas em meio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM, Sigma Aldrich, St Louis, MO, EUA) suplementado com 10% de soro fetal bovino, 100 U /ml de penicilina, 100 ug /ml de estreptomicina, e 2 mM de L-glutamina [ambas as linhas celulares foram adquiridas a partir da ATCC]. As células foram cultivadas quer expostos a 2 Gy de radiação utilizando um acelerador linear de 4-MV (Clinac 4/100; Varian, Palo Alto, CA, EUA) ou para a esquerda não irradiados como um controlo negativo. O inibidor da JNK SP600125 específica foi adquirido da Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, EUA). células H1299 foram incubadas com 10 uM SP600125 durante 30 min, e, em seguida, expostos a IV (2 Gy) seguido por isolamento de ARN total nos tempos indicados.

MicroRNA microarray

MicroRNA de cada linha celular foi extraiu-se utilizando o kit de isolamento de miRvana microARN (Ambion, Austin, TX, EUA) de acordo com os protocolos do fabricante. microARNs purificados foram marcadas utilizando o kit de matriz Etiquetagem miRvana microARN e acoplado ao Cy5 pós-etiquetagem corante reativo (Amersham, GE Healthcare Bio-Sciences, Piscataway, NJ, EUA). As amostras marcadas foram lavadas e hibridizados em duplicata para Mirvana microRNA Bioarrays (Ambion), utilizando o Kit Mirvana microRNA Bioarray Essentials. intensidades de fluorescência foram processadas e medidas usando o scanner GeneChip 3000 7G (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EUA). Os níveis de hibridação microARN foram determinadas usando o software GenePix Pro 6.0, tal como recomendado pelo fabricante. A intensidade ajustada ao fundo para cada microARN foi submetido a um processo de estabilização de variância global de normalização [24]. Todos os dados são Miame complacente e os dados em bruto foi depositado em um banco de dados compatível Miame (GEO) (número de acesso – GSE30075).

Estatística e análise bioinformática

Para identificar os microRNAs para o qual a expressão níveis mudou significativamente ao longo do tempo de curso, usamos one-way análise de variância. Considerando a estrutura de correlação de repetições dentro de-array [25] em Mirvana microRNA Bioarrays, realizamos one-way análise de variância em 328 microRNAs humanos. DIANA (https://diana.cslab.ece.ntua.gr/), que integra microRNAs humanos e camundongos em vias de prever alvos de microRNA [26], foi realizado, inicialmente, identificar caminhos.

preparação de RNA e quantitativa PCR em tempo real

o ARN total foi extraído a partir de linhas de células usando o método de Trizol e depois transcrito de forma inversa em ADN complementar utilizando transcriptase reversa Superscript II (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) e oligo (dT) 12-18 iniciadores de acordo com o protocolo do fabricante. O RT-PCR quantitativo para os genes indicados foi realizado numa mistura de reacção contendo SYBR Premix Ex Taq (Takara Bio Inc., Shiga, Japão). Quantificação de microRNAs foi realizada utilizando ensaios de microRNA TaqMan (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA), de acordo com o protocolo do fabricante. As amostras foram analisadas utilizando o Prism 7000 Sequence Detection System ABI (Applied Biosystems). Todos os PCRs foram efectuados em triplicado, e a especificidade da reacção foi determinada por análise da curva de fusão na fase de dissociação. Nós sintetizados iniciadores específicos para ATF2 (para a frente: 5′-AGATTTATTAATTTTTCTGTGCTCAA-3 ‘; reversa: 5’ ACACCCCCATTTATTAAAACACC-3 ‘), FOS1 (para a frente: 5′-TGTGTTCCTGGCAATAGTGTG-3′; reverso: 5’-CAATGAACATTGATGTTGAAGAAA-3 ‘), MAP3K5 (para a frente: 5’-GCAGCAGCTATTGCACTTCA-3 ‘; reverso: 5′-TGGTCACATTTTGGTTTTGTTC-3′) e PPARg (para a frente: 5’-CCTGCAGGAGATCTACAAGGA-3 ‘; reverso: 5′-GGTGTCAGATTTTCCCTCAGA-3’). O método quantitativo relativo foi usado para a análise quantitativa. O calibrador foi o ΔCt média das células não tratadas. O controle endógeno foi gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (GAPDH) para genes e U6B para microARNs.

Western blotting

As células foram colhidas e lisadas em NP-40 tampão contendo fluoreto de fenilmetilsulfonilo e Cocktail de Inibidor de Protease (Sigma, St. Louis, MO, EUA). Os extractos de proteína foram então separados por electroforese em gel de sulfato de dodecilo-poliacrilamida de sódio, e, em seguida, transferidos para membranas de fluoreto de polivinilideno (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA). As membranas foram incubadas com um anticorpo ATF2 (1:1000; Santa Cruz Biotechnology Inc.) em solução salina tamponada com Tris Tween 20 com leite seco não gordo, e depois incubadas com anticorpo secundário conjugado com peroxidase de rábano (diluição 1:5000; Bio -Rad). bandas imuno foram visualizadas usando o West-Q-Substrato quimioluminescente Kit Plus (BIOTANG, Waltham, MA, EUA).

Construções, transfecção e ensaio de luciferase

O precursor de miR-26b foi clonado em pcDNA3 (Invitrogen) por PCR do ADN genómico, com iniciadores (directo: 5′-CCGGAATTCCGGATGGGAATTGGATACAT-3 ‘; reverso: 5′-ATTGCGGCCGCAGCTACCCTGACCACTGCTGC-3’). As UTRs 3 ‘de ATF2 foram clonados a jusante do gene da luciferase de Renilla na psiCHECK2vector (Promega, Fitchburg, WI, EUA). A construção foi transfectada utilizando FuGENE HD reagente (Roche, Basileia, Suíça) em tempo real de RT-PCR, transferência de Western, e os ensaios de luciferase. Os ensaios de luciferase foram efectuados utilizando o kit de ensaio de luciferase dupla (Promega). Normalização da expressão Renilla foi realizada utilizando presente firefly luciferase no vector psiCHECK2.

Informações de Apoio

Tabela S1. : Lista de microRNAs selecionados a partir de células H1299.

doi: 10.1371 /journal.pone.0023802.s001

(XLSX)

Tabela S2.

ARNm seleccionado: pares microRNA da via de sinalização MAPK com base na análise de enriquecimento.

doi: 10.1371 /journal.pone.0023802.s002

(XLSX)

Reconhecimentos

Os autores agradecem os membros do laboratório Parque de discussão, bem como H.-S . Shin e H.-J. Jeon por microarrays de microRNA.