Abstract
Para elucidar a função de GPCR relacionados com o MAS, membro do D (MRGD) em cancros, investigamos o
in vitro
e
in vivo
função oncogénica de MRGD usando murino linha de células de fibroblastos NIH3T3 em que é expressa de forma estável MRGD. O padrão de expressão de MRGD em amostras clínicas também foi analisada. Descobrimos que a sobre-expressão de MRGD em NIH3T3 formação de focos induzido e formação esferóide multicelular, e promoveu tumores em ratinhos nus. Em outras palavras, a superexpressão de MRGD em NIH3T3 induzida pela perda de inibição de contacto, crescimento independente de ancoragem e
in vivo
tumorigênese. Além disso, verificou-se que o ligando de MRGD, beta-alanina, a formação de esferóides melhorada em MRGD-expressando células NIH3T3. De investigação de tecidos de câncer clínicas, encontramos alta expressão de MRGD em vários cancros do pulmão por imuno-histoquímica, bem como PCR em tempo real. Com base nestes resultados, MRGD poderiam estar envolvidos na tumorigênese e também poderia ser um alvo droga anticâncer romance
Citation:. Nishimura S, Uno M, Kaneta Y, Fukuchi K, Nishigohri H, Hasegawa J, et al. (2012) MRGD, uma G-proteína relacionada ao MAS Receptor Acoplado, Promove Tumorigenisis e é altamente expressa em câncer pulmonar. PLoS ONE 7 (6): e38618. doi: 10.1371 /journal.pone.0038618
editor: Jun Li, Sun Yat-sen University Medical School, China
Recebido: 05 de setembro de 2011; Aceito: 08 de maio de 2012; Publicação: 08 de junho de 2012
Direitos de autor: © 2012 Nishimura et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este estudo foi financiado por Daiichi Sankyo Co. Ltd. os financiadores não tiveram papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar e preparação do manuscrito
CONFLITO dE iNTERESSES:. SN, MU, YK, KF, HN, JH, NK, FN, e TA são empregados por Daiichi Sankyo Co. Ltd. Este estudo também foi financiado por Daiichi Sankyo Co. Ltd. Isto não altera a adesão dos autores para todos os PLoS ONE políticas de dados e materiais de compartilhamento.
Introdução
membros da família
receptor acoplado a proteína G (GPCR) activam vários sinalização fisiológica e desempenham um papel importante no desenvolvimento, bem como a função de cada órgão [1]. Além disso, diversas GPCRs foram encontrados para ser sobre-expresso em células de tumor primário e secundário da cabeça e carcinoma de células escamosas do pescoço, cancro do pulmão de células não pequenas, da mama, da próstata e tumores gástricos, melanoma e difusa do linfoma de células B grandes [2]. Alguns GPCRs também têm sido relatados para ser funcionalmente envolvidos na progressão do cancro [3], tal como o receptor de péptido de libertação da gastrina (GRPR) no cancro da próstata [4], o CXCR4 na metástase [5], e assim por diante. MAS1, é o primeiro GPCR a ser relatado para ter qualquer relação com o desenvolvimento do câncer. Foi relatado que células NIH3T3 ectopicamente expressar MAS1 promoveu formação de focos
in vitro Comprar e tumorigênese facilitado em ratinhos nus [6], no entanto, nem expressão MAS1 significativa nem mutação MAS1 ativa têm sido relatados em cânceres clínicos, portanto, a papel da MAS1 no câncer ainda é incerto. Por outro lado, foi observada elevada expressão de MAS1 no sistema nervoso central, tais como o hipocampo e cerebelo, e MAS1 melhorada do influxo de cálcio dependente de ligandos de receptor de angiotensina II (AT2R) onde MAS1 formado um complexo com o AT2R. Estes sugerem que MAS1 desempenha um papel importante no sistema nervoso central [7], [8].
Relacionada-MAS
receptor acoplado à proteína G, D (MRGD), também referido como hGPCR45 [9] ou TGR7 [10], foi identificado como um GPCR novo em murino e genomas humanos [11]. Verificou-se que MRGD serve como o receptor de beta-alanina [12]. Vários membros da família MRG foram relatados para ser expressos em subpopulações específicas de neurónios sensoriais, que detectam estímulos de dor [11]. Quanto MRGD, a sua expressão foi encontrado nos gânglios da raiz dorsal (DRG) e co-localizada com o receptor de vanilde-1 (VR-1), que é um receptor essencial para o calor e sensação de dor [12]. Além disso, a ablação genética de MRGD expressando neurónio reduz a sensibilidade a estímulos mecânicos comportamental nocivos mas não ao calor ou a estímulos frios em ratos [13]. Assim, MRGD é considerado para ser um dos jogadores na sensibilidade e /ou a transdução de dor. Também foi relatado que MRGD transduz sinalização intracelular dos receptores da angiotensina (Ang) II metabólito, Ang- (1-7) [14]. Como descrito acima, a função de MRGD no sistema nervoso central tem sido observado em vários grupos.
Existem diversos membros da família GPCR que mostram semelhança de sequência de aminoácidos para MAS1 tais como MRGA, MRGB, MRGC, MRGD, MRGE , MRGF, MRGG, MRGH e MRGX [11]. Na árvore filogenética da família MRG, MAS1, MRGD, MRGE, MRGF e MRGH são classificados como pertencentes ao mesmo ramo [11]. Isso levantou a hipótese de que os genes no ramo filogenética incluindo MAS1 poderia ter uma semelhança na função ou transdução de sinal. Foram verificadas a capacidade de MAS1 para promover a função tumorigénico em células NIH3T3, e no presente estudo, a tentativa de elucidar a função tumorigénico de MRGD, que é relatado para funcionar no sistema nervoso central, tais como MAS1. Também foi investigada a expressão de MRGD em tecidos de câncer humanos. Descobrimos que MRGD promove a perda de inibição de contacto, crescimento independente de ancoragem e
in vivo
tumorigênese e é também altamente expresso em vários tipos de câncer de pulmão humano, sugerindo que MRGD poderia desempenhar um papel importante no câncer humano.
resultados
efeito da MRGD na proliferação celular e tumorigenicidade in vitro
Para esclarecer o efeito de MRGD no crescimento celular, a linha de células NIH3T3-MRGD, que células NIH3T3 foram transfectadas de forma estável MRGD com vector de expressão retroviral foi estabelecida e os seus perfis relacionados com o crescimento foram analisadas. A expressão do gene de MRGD na linha de células NIH3T3-MRGD foi confirmada por RT-PCR e sequenciação (Figura S1). Usando as células NIH3T3-MRGD, o ensaio de formação de foco (ver Materiais e Métodos) foi realizada, onde a formação de focos significativa foi observada na cultura de células NIH3T3-MRGD, enquanto nenhum desses focos foram vistos em células NIH3T3-Mock (Figura 1A). Estes dados indicam que a expressão do gene MRGD cancela inibição de contacto das células NIH3T3, uma das características de fibroblastos normais. Para determinar outras características relacionadas com o crescimento de MRGD, o ensaio de crescimento de esferóides (ver Materiais e Métodos) foi realizada, onde as células NIH3T3-MRGD e células NIH3T3-Mock foram cultivadas numa placa de L com fundo de 96 poços não aderentes, respectivamente. Primeiro, percebemos que esferóides maiores foram observados para NIH3T3-MRGD do que para NIH3T3-Mock no 5º dia após o plaqueamento. O esferóide de células NIH3T3-Mock encolhido durante a cultura, enquanto que a de células NIH3T3-MRGD obviamente cresceu de dia para dia, como mostrado na Figura 1B. Determinou-se este carácter relacionados com o crescimento medindo a mudança nos diâmetros dos esferóides e também medindo diferença na actividade dos esferóides ATP (Figura 1C e D). Foram observados significativamente maiores diâmetros esferóides de células NIH3T3-MRGD do que aqueles para NIH3T3-Mock de 2 a 8 dias após o plaqueamento (Figura 1C, P 0,005, teste de Mann-Whitney U, 2 caudas). Além disso, muito mais teor de ATP foi observado para células NIH3T3-MRGD comparada com a de células NIH3T3-Mock aos 6 dias após o plaqueamento (Figura 1D, p 0,005, teste de Mann-Whitney U, 2 caudas). Resultados semelhantes foram obtidos por [
3H] medição de ensaio -timidina (Figura S2, S1 Arquivo). Estes resultados indicam que MRGD promove significativamente o crescimento independente de ancoragem do fibroblasto normal, por outras palavras, MRGD possuir capacidade oncogénica.
. imagens representativas de formação de focos em culturas em monocamada de células NIH3T3 expressando estavelmente Mock (células NIH3T3-Mock, esquerda) ou MRGD (células NIH3T3-MRGD, à direita). As células foram coradas com violeta de cristal após a fixação com paraformaldeído a 4%. imagens B. representativos de NIH3T3-MRGD ou esferóide NIH3T3-Mock nos dias 1 e 7. curvas de crescimento C. Spheroid. , Os tamanhos de esferóides de NIH3T3-MRGD (fechado) ou NIH3T3-Mock (aberto) nos dias 2, 3, 5 e 7 são mostrados com seus diâmetros (média ± SD). * Indica P 0,005 (teste de Mann-Whitney U, 2 caudas). A proliferação celular D. de culturas esferóides de NIH3T3-MRGD ou NIH3T3-Mock. A luminescência do conteúdo de ATP de células inteiras (médias ± DP) foi medido a 6 dias após o plaqueamento. * Indica p . 0.005 (Mann-Whitney U, 2 caudas)
Efeito da MRGD na proliferação celular e tumorigenicidade in vivo
Em seguida, para avaliar
in vivo
actividade tumorigénica, nós subcutaneamente inoculados NIH3T3-MRGD ou NIH3T3-simulada para ratinhos atímicos nus. O notável crescimento do tecido enxertado foi observada com os ratos implantados subcutaneamente com células NIH3T3-MRGD mas não com células NIH3T3-Mock (Tabela 1). Os volumes médios de tumor de ratinhos NIH3T3-MRGD células enxertadas excedeu 2,000 mm
3 em 21 dias após a inoculação. Em contraste, nenhum crescimento notável foi observada em ratinhos NIH3T3-células pseudo-enxertados até 21 dias após a inoculação. Um aglomerado de células foi encontrado em ratos-células-Mock NIH3T3-enxertado 24 dias após a inoculação, no entanto, ainda era muito pequeno e seu volume médio foi de menos de 400 mm
3. Como NIH3T3-MRGD formou o grande grupo
in vivo
, foi realizada coloração HE para confirmar que a moita NIH3T3-MRGD possuía características patológicas do tumor-like. HE coloração dos cortes de tecidos enxertados de ratos NIH3T3-MRGD células enxertadas apresentaram morfologia fibrosarcoma-like (Figura S3). Tomados em conjunto, este resultado sugere que a expressão MRGD faz com que não só
in vitro
mas também
in vivo
tumorigenicidade.
A indução do crescimento celular por estimulação do ligando
para avaliar o efeito do beta-alanina, um dos ligandos MRGD [12], no crescimento de esferóides promovido por MRGD, adicionou-beta-alanina em várias concentrações para a cultura de esferóides de células NIH3T3-MRGD ou NIH3T3-RASV12 células. células NIH3T3-Mock não crescem bem em cultura esferóide e nenhum crescimento estável foi induzida, mesmo na presença de beta-alanina (dados não mostrados), e, por conseguinte, o grupo de células NIH3T3-Mock não foi definido no presente estudo. Nesta experiência, a promoção significativa do crescimento celular por beta-alanina de um modo dependente da dose foi observada para células NIH3T3-MRGD como medida pela actividade de ATP (p 0,05, teste de Mann-Whitney U., 2-caudas), enquanto nenhum efeito de beta-alanina foi visto para crescimento de esferóides NIH3T3-RASV12 mesmo com 2,000 ug /ml de beta-alanina (Figura 2). Estes dados indicam que o crescimento independente de ancoragem de células que expressam MRGD pode ser aumentada pela sua estimulação do ligando.
células NIH3T3 transfectadas com MRGD ou RASV12 foram cultivadas em RPMI 1640 contendo BSA a 0,1% e várias concentrações de beta-alanina para 7 dias. Os dados foram obtidos a partir de três culturas de células independentes (significa SD ±). * Indica p . 0,05 (Mann-Whitney U, 2 caudas), em comparação com NIH3T3-MRGD sem beta-alanina, e com NIH3T3-RASV12
A expressão de MRGD em cancros humanos
Nós determinamos a expressão MRGD em vários cânceres clínicos. Em primeiro lugar, para esclarecer o nível de expressão da proteína MRGD em amostras de cancro de pulmão, foi realizada IHC utilizando um par de secções de tumores e de tecidos normais de 33 pares de amostras de cancro de pulmão humano (ver Materiais e Métodos). Para IHC, o anticorpo anti-coelho MRGD foi levantada e especificidade de antigénio do anticorpo foi confirmado como mostrado em Materiais e Métodos; sinais de coloração do anticorpo anti-MRGD na membrana externa foram detectados em fixados em formalina HEK293 /aVp3 células transfectadas com MRGD, embora não em HEK293 transfectadas por simulação /aVp3 células (Figura 3A e B). Com este anticorpo, 22 dos 33 casos de câncer de pulmão clínicos mostraram MRGD sinais positivos (22/33): adenocarcinomas (9/10), carcinomas pouco diferenciados de células escamosas (7/10) e carcinomas de células escamosas bem diferenciadas (6 /10) (Tabela 2). Percebemos sinais especialmente fortes em algumas amostras, incluindo adenocarcinomas (8/9) (Figura 3C e S4), carcinomas pouco diferenciados de células escamosas (3/7) e carcinomas de células escamosas bem diferenciadas (2/10). Por outro lado, nenhum sinal de coloração foi detectado para o carcinoma de células pequenas (data não mostrado).
amostras bloco de células foram usadas para confirmar a especificidade do anticorpo em imunocoloração. HEK293 /aVp3 células transfectadas com vector de expressão MRGD (A) ou vector de Mock (B) são mostrados. C. A coloração representante do adenocarcinoma de pulmão que é positivo para MRGD.
Foram também analisadas a expressão do gene MRGD em cânceres clínicos por RT-PCR quantitativo. foram usadas Cento e vinte sete conjuntos de amostras de ARN com porções tanto cancerosas e não cancerosas de pulmão, esófago, da mama, rim, estômago, útero e tecidos de cancro do cólon. Nas amostras de tecido do cólon ou útero, expressão MRGD na porção cancro nunca excedeu 3 vezes a quantidade na porção normal. Como para os cancros do pulmão, a média de expressão MRGD na porção cancro ultrapassado o valor igual a 3 vezes mais que o da porção pulmonar normal, e para 12 das 33 amostras pares do pulmão, a expressão MRGD na porção cancro excedeu 3 vezes a quantidade na porção emparelhado normais (Figura 4). Em todos os 7 espécies de cancro aqui determinadas, as amostras pares do pulmão mostraram a frequência mais elevada (36%) para uma maior expressão MRGD na porção de cancro em comparação com o da porção normal com os critérios superiores a 3 vezes a quantidade (Figura 4). Algumas outras amostras de câncer, tais como mamas (3 de 16), esôfago (2 de 12), rins (1 de 10) e estômagos (1 em 25), também mostrou 3 vezes maior expressão na porção cancro, em comparação de que na porção normal. Nós não ver uma diferença estatística na comparação global do sinal mRNA entre as porções normais e cancerosas em cada tipo de cancro por ANOVA one-way. Mais categorização precisa dos pacientes devem ser necessárias para obter significância estatística. No entanto, os dados indicam claramente que os sinais de expressão de mais de 3 vezes mais elevadas estão apresentados no tumor, em vez do que a porção normal em alguns pacientes com cancro. expressão mais elevada da porção de cancro no cancro do pulmão também foi muito consistente com os resultados de IHC. Estes sugerem que os dados são muito significativos para indicar a próxima direção da pesquisa sobre a expressão MRGD no câncer.
Cento e vinte e sete conjuntos de amostras de RNA de porções cancerosas e não-cancerosas dos mesmos pacientes com pulmão ( n = 33), o esófago (n = 12), mama (n = 16), rim (n = 10), estômago (n = 25), útero (n = 12) ou cólon (n = 19) do cancro. Rácios de a quantidade de mRNA MRGD na parte tumor por que, em parte normal da cada caso foram plotados. A barra indica a média da relação em cada tipo de câncer.
Discussão
Nós demonstramos que a expressão MRGD induz perda de inibição de contacto, de ancoragem independente crescimento de esferóides
em
vitro e também tumorigénese
in vivo
, que não são vistos nas células normais de fibroblasto parentais (Figura 1, Tabela 1). Estes, por fenótipos funcionais observados para MRGD são bastante semelhantes aos relatados por um oncogene representante, RASV12 [15]. Nós também confirmou que a expressão RASV12 promove o cancelamento de inibição de contacto das células de fibroblastos normais e também induz o crescimento esferóide ou o crescimento celular independente de ancoragem (dados não mostrados). Além disso, mostrámos que as células NIH3T3-MRGD resultou um crescimento significativo de células de fibrossarcoma-like
In vivo
(Figura S3), e seus fenótipos morfológicos foram bastante semelhantes para as células NIH3T3-RASV12 (dados não mostrados). Estes resultados suportam fortemente que MRGD transduz sinalização tumorigénico e promove o crescimento celular independente de ancoragem visto com RASV12. Relatou-se que as células iPS foi feita a partir de fibroblastos de rato embrionário (MEF) reprogramado através da introdução de diversos genes, incluindo oncogenes [16]. Neste estudo, que incidiu sobre a função tumorigénico de MRGD, no entanto, pode ser também de interesse para esclarecer se ou não MRGD é capaz de promover stemness. A expressão dos marcadores de stemness tais como oct-3/4, Nanog e assim por diante [16] – [19], em células NIH3T3-MRGD e outras células MRGD-positivas, assim como a expressão da própria MRGD em células estaminais e MEFs reprogramadas, são de interesse para saber a importância de MRGD neste assunto e deve ser elucidado no futuro.
Uma série de relatórios indicam que não só oncogene, como RASV12 mas também proto-oncogenes, tais como ErbB2 e FYN dar semelhante fenótipo tumorigénico em células de fibroblasto de [20], [21]. Além disso, a expressão de tais oncogenes e /ou proto-oncogenes está frequentemente aumentada, em vários cancros humanos e que o seu crescimento celular e sinais anti-apoptóticos promover não só o crescimento do cancro, mas também a progressão da doença em doentes com cancro [2], [22] – [25]. Neste relatório, nós descobriram que mRNA MRGD é expressa em amostras de câncer humanos clínicos de alguns pacientes com pulmão, mama, esôfago, rim ou câncer de estômago. Além disso, verificou-se que algumas destas amostras de cancro que expressam ARNm MRGD mostrou relativamente mais elevado de expressão de proteína MRGD em comparação com as porções não cancerosas dos mesmos pacientes, embora sem significância estatística global foi observada em cada tipo de tumor (Figura 4). Para os cânceres de pulmão, o nosso RT-PCR análises mostraram alta e freqüente expressão de mRNA MRGD, e análises nosso IHC revelou que o nível mais alto, que nós detectado para a expressão da proteína MRGD, foi observada com frequência em cancros do pulmão humanos (Tabela 2), especialmente no pulmão adenocarcinomas (Figura 3). Embora sejam necessários mais análises de funções MRGD em células cancerosas e tecidos humanos, o perfil de expressão de MRGD em cânceres clínicos revelou neste estudo sugere fortemente a possível contribuição da função oncogénica de si mesmo e /ou uma via de sinal relacionado MRGD em alguns tumores sólidos tais como cancros do pulmão. GPCRs podem ser bons alvos de inibidores de moléculas pequenas, bem como anticorpos e, portanto, MRGD, um GPCR, pode servir como um novo alvo para a terapia do cancro. adenocarcinomas do pulmão pode ser um tipo de câncer especialmente interessante para uma possível terapia antineoplásica segmentação MRGD.
Os mecanismos pelos quais MRGD promove sinais oncogênicos permanecem desconhecidos. No entanto, os nossos resultados indicam que a expressão MRGD promove fenótipos oncogénicas em células normais tanto
In vitro
e
In vivo
(Figura 1, Tabela 1), e também que o ligando, beta-alanina, ativa o crescimento de células MRGD dependente
in vitro
(Figura 2). Foi relatado que os níveis normais de beta-alanina foi de cerca de 3,8 uM no plasma humano saudável [26]. Também relatada, era que as concentrações de beta-alanina em tecido nervoso-relacionada são mostradas para ser de cerca de 50 um de nervo ciático de rato e 60 uM no cérebro gato [27], [28]. Os nossos dados indicam que a beta-alanina promove o crescimento de esferóide a partir de 2 uM a 2,000 uM numa forma dependente da dose, e a promoção do crescimento de 50% foi observada a 20? M (Figura 2). Portanto, a beta-alanina em plasma humano saudável é suficientemente alta para promover o crescimento do esferóide através MRGD. Um relatório tem até à data, revelou que a alta concentração de beta-alanina está ligado ao câncer; em detalhe, tumores mamários de rato ou murganho contêm elevado nível de beta-alanina, que nunca foram encontrados em tecido mamário normal de rato ou ratinho [29]. Assim, a concentração de beta-alanina no plasma ou tumores de pacientes com cancro pode ser maior do que o de indivíduos normais. Pode ser possível que o beta-alanina ativa o crescimento do tumor e sinais de sobrevivência em doentes com cancro por meio de MRGD em certa medida. Além disso, em tecidos de cancro, de expressão elevada pode causar MRGD constitutiva transdução de sinais oncogénicos, ou podem causar maior capacidade de resposta do ligando do que em tecidos normais o que leva a promoção do crescimento de cancro. Por outro lado, nenhum relatório revelou que a beta-alanina promove o desenvolvimento de cancro, e, portanto, é possível que possa haver um outro ligando MRGD contribuindo para o desenvolvimento do cancro através MRGD. Estes devem ser elucidadas no futuro
Neste estudo, nós demonstramos.; 1) A atividade tumorigénico do MRGD
in vivo
e
in vitro
, 2) a expressão MRGD em tecidos de câncer clínicas, 3) promoção de crescimento de esferóides por beta-alanina, o ligante MRGD e 4 ) fibrossarcoma morfologia semelhante dos tecidos enxertados de ratinhos implantadas subcutaneamente células que expressam MRGD. Estes sugerem que MRGD é um alvo potente na terapia do cancro e que pequena molécula antagonistas, anticorpos ou RNAi para MRGD iria fornecer terapia anticâncer promissor.
Materiais e Métodos
consentimento informado por escrito foi recebido de todos participantes quando obtivemos todos os tecidos clínicos, e todas as experiências dos tecidos clínicos foram realizados de acordo com protocolos aprovados pela Daiichi Sankyo comitê de ética em pesquisa. Todo o trabalho animal foi conduzido de acordo com a diretriz nacional relevante em 2005, quando as obras animais foram estudados.
Estes protocolos experimentais com animais foram aprovados pela Sankyo comitê de ética em pesquisa animal, em Sankyo Co., Ltd., que foi o antecedente de Daiichi Sankyo Co., Ltd.
Materiais e cultura de células
FBS foi adquirido de Hyclone (South Logan, UT). DMEM, RPMI1640, Opti-MEM, Geneticina e Lipofectamine 2000 foram adquiridos a Life Technologies (Carlsbad, CA). A linha de células de empacotamento de retrovírus, 293-10A1, foi estabelecido no nosso laboratório a partir de linha de células 293 (ATCC, CRL-1573) por transfecção de PCL-10A1 (IMGENEX, Sorrento Valley, CA). A linha celular foi mantida 293-10A1 com meio DMEM suplementado com FBS a 10%, 3 ug /ml de blasticidina (Wako, Osaka, Japão), sob as condições de 5% de CO
2 a 37 ° C. A linha celular NIH3T3 foi obtido a partir de ATCC (CRL-1658) e ajustou-se para meio RPMI 1640 suplementado com 10% de FBS. brometo de hexadimetrina foi adquirido de Sigma-Aldrich (Tóquio, Japão). A linha /célula HEK293 avp3 foi estabelecida a partir de células 293 (ATCC, CRL-1573) por transfecção estável com aV da integrina p3 e vectores de expressão, e foi cultivada em meio DMEM suplementado 10% FBS.
A geração de células NIH3T3-MRGD células
cDNA de codificação de comprimento completo humana MRGD, RASV12 ou GFP foi clonado em um vetor pLNCX (Clontech Laboratories, mountain View, CA). Para a infecção, as células NIH3T3 foram semeadas numa placa de 10 cm e cultivadas durante 1-3 dias. As células foram plaqueadas em 293-10A1 uma placa de 10 cm colagénio I-revestido (AGC Techno vidro, Chiba, Japão) e foram cultivadas durante a noite. pLNCX-MRGD, pLNCX-RASV12 ou pLNCX-Mock foi transfectado para as células 293-10A1 por Lipofectamine 2000. O sobrenadante das células transfectadas foram recolhidos 293-10A1, em seguida, foram adicionados meio fresco para o próximo ciclo. O sobrenadante recolhido foi filtrada com uma membrana de PVDF de 0,45 um (Millipore, Billerica, MA) e o volume igual de meio RPMI 1640 suplementado com FBS a 10% e 16 ug /ml de brometo de Hexadimetrina foram adicionados. Esta solução virai foi adicionado às células NIH3T3 para a infecção. A série de infecção estes procedimentos foram repetidos três vezes a cada 12 horas. Após 12 horas desde a última infecção, as células foram cultivadas com 500 ng /ml de Geneticina durante uma semana para acumular células que expressam o gene alvo.
formação de focos ensaio
As células foram plaqueadas a 1 × 10
5 células /cavidade em uma placa de 6 poços de cultura de células (Corning Japão, Tokyo, Japão) e foram cultivadas durante uma semana. As células em cultura foram fixadas com paraformaldeído a 4% (Wako, Osaka, Japão) durante 30 minutos a 4 ° C e foram coradas com 0,5% de violeta de cristal (Sigma-Aldrich Japão, Tokyo, Japão).
crescimento de esferóides ensaio
células NIH3T3-MRGD foram suspensos em meio RPMI 1640 suplementado com FBS a 10% ou 0,1% de BSA e plaqueadas em 5000 células /poço em 100 ul de uma placa de 96 poços esferóide (Sumitomo Bakelite, Tóquio, Japão) . No caso em que a beta-alanina foi adicionado, as células foram plaqueadas em 5000 células /cavidade em 80 ul e, em seguida, 20 ul de beta-alanina foi adicionado no mesmo dia. crescimento esferóide foi medida com qualquer um dos seguintes métodos. 1) Medição de diâmetro esferóide: diâmetro esferóide foi medida por micrómetro ocular. Cada diâmetro foi calculado a partir da amplificação de uma lente objectiva e uma ocular. 2) Medição da quantidade de ATP esferóide: Cell Titer-Glo Luminescent Ensaio de viabilidade celular (Promega KK, Tóquio, Japão) foi usada de acordo com as instruções do fabricante. Em seguida, esferóide com 100 ul de reagente foi pipetado bem e transferidos para uma placa de fundo plano branco (Corning Japão, Tokyo, Japão). A luminescência 1 seg da placa foi medido por Mithras LB940 (Berthold Technologies, Wildbad, Alemanha).
células NIH3T3 Análise da carcinogénese vivo de MRGD transfectadas
camundongos atímicos (BALB /ratinhos cAJcl-nu /nu, Clea Japan, 5 semanas de idade, fêmea) foram inoculados subcutaneamente com 3 células x 10
6 células NIH3T3-MRGD (n = 3) ou células NIH3T3-Mock (n = 3), como um negativo ao controle. O volume do tumor foi medido 3 vezes por semana. Os volumes tumorais foram calculados de acordo com as seguintes equações: De acordo com a diretriz nacional relevante, todos os ratos foram de ser sacrificados se sinal da toxicidade como a atividade reduzida, redução do apetite, beber reduzida, licks, guarda membros, aumento da agressão, vocalização, aversão contra con-específicos, desidratação, anatomia faltando, postura anormal, anexo fraturado e prolapso, diarréia, dermatite progressiva, postura arqueada, letargia ou decúbito persistente, tosse, dificuldade para respirar, corrimento nasal, icterícia e /ou anemia, sinais neurológicos, sangramento a partir de qualquer orifício, trauma auto-induzido, dificuldade de locomoção, hipertermia excessiva ou prolongada ou hipotermia, ou perda de peso, que ultrapassou os 10% do peso corporal total de ratinhos de controlo negativo, foi visto. Nenhum sinal de toxicidade foi observado nos ratinhos durante esta experiência.
Preparação de anticorpo policlonal MRGD anti-humano de coelho
A mistura de 2 tipos de péptidos, GTVESALNYSRGSTVH (16 mer) e ELEGGETPTVGTNEMGA ( 17 mer), foi utilizado como um antigénio. Os soros foram obtidos a partir de coelhos imunizados com o antigénio preparado com adjuvante incompleto de Freund (Difco, Detroit, MI), excepto para a primeira imunização, o qual continha o adjuvante completo de Freund (Disco, Detroit, MI). Finalmente, os anticorpos IgG policlonais foram purificados a partir dos soros por uma coluna de afinidade com os péptidos de antigénio.
A imuno-histoquímica (IHC)
A especificidade dos anticorpos anti-MRGD foram validados por coloração /células HEK293 aVp3 transfectadas com MRGD-expressar ou vector vazio. Estes transfectantes foram fixadas com uma solução a 20% de formalina neutra tampão (Wako, Osaka, Japão) e embebido em parafina para fazer blocos de células. Os blocos de células foram cortadas para cortes finos por micrótomo e definir em uma lâmina de vidro APS-revestido. As secções foram secas e pré-tratadas por o bloqueio do sistema biotina (Dako Japão, Tokyo, Japão) parafinized-de. As secções foram então bloqueadas com bloco de proteína livre de soro (Dako Japão, Tokyo, Japão) e foram tratados com um anticorpo policlonal anti-humana MRGD (1/200) em diluente de anticorpo (Dako Japão, Tokyo, Japão). As secções tratadas com anticorpo foram tratados com IgG anti-coelho biotinilado, em seguida, tratada com a ABC-AP de IgG kit de fosfatase alcalina coelho Vectastain ABC (CliniScience, Montrouge, França). AP vermelho do kit de fosfatase alcalina do substrato que foi utilizado como um substrato de coloração. seções de tecido de cancro foram preparados a partir de blocos de parafina e coloração imuno-histoquímica foi realizada com o método ABC.
Medição da expressão do gene MRGD no tecido clínica
O RNA total de tumores ou não-tumorais tecidos clínicos de do mesmo dador foram adquiridos a Biochain (Hayward, CA). Estas amostras par de RNA foram tratadas com DNase dependente de ATP (Toyobo, Osaka, Japão) com 10 unidades de inibidor de RNase (Toyobo, Osaka, Japão) durante 15 minutos em gelo. A DNase foi removido pelo sistema de RNA total miniprep (VIOGENE, Taipei County, Taiwan). Para obter ADNc, uma mistura de matriz de ARN total (2 ng), iniciadores aleatórios (9 mer, 50 pmol), ReverTra Ace (10 unidades, Toyobo, Osaka, Japão) e tampão de reacção (Tris-HCl 50 mM pH 7,5, 75 mM de KCl, 6 mM MgCl
2, 1 mM de DTT, 1 mM de dNTP tampão) foi incubada a 25 ° C durante 15 minutos, 42 ° C durante 30 minutos, e, em seguida, 95 ° C durante 3 minutos. reação real time-PCR foi realizada com TaqMaq One-Step RT-PCR Master Mix (Life Technologies Japão, Tóquio, Japão), de acordo com as instruções do fabricante, utilizando a seguinte sonda e primers.
MRGD
-2 (TaqMan sequência de sonda): TGTGTGCCACCATGCCTGGCTAATT
MRGD
-F2 (sequência Atacante primário): GCTCACTACAACCTCAATGTGCC
MRGD
-R2 (iniciador inverso sequência): GCCACATAGCAAGATCTCATCTCTAC
Os dados foram normalizados por TaqMan reagente de controlo β-actina (Life Technologies Japão, Tokyo, Japão). Estas expressões de genes foram medidos usando Mx3000P QPCR System (Tecnologia Agilent, Santa Clara, CA).
Análises Estatísticas
Todo o
vitro
experimentos foram analisados por Mann-Whitney U -Testes, excepto análise de RT-PCR quantitativo em amostras clínicas, as quais foram analisadas por ANOVA de uma via. valores de p relatados são duas caudas e são consideradas estatisticamente significativas a p . 0,05
Informações de Apoio
Figura S1. electroforese em gel de agarose
de inserções de ADNc amplificados por PCR. foram verificados sequências de ácidos nucleicos de produtos de PCR para inserções de vectores. A pista 1 e 3: RT-PCR amplificado-GFP a partir de ARN total de células NIH3T3-GFP; pista 2: GFP amplificado a partir do plasmídeo GFP (controlo positivo); pista 4 e 6: RT-PCR amplificados a partir de ARN total MRGD de NIH-3T3-MRGD; pista 5:. Amplified MRGD do plasmídeo MRGD (controle positivo)
doi: 10.1371 /journal.pone.0038618.s001
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Figura S2. A proliferação celular
de NIN3T3-MRGD esferóide medido por [
3H] -timidina. [
3H] -timidina em esferóides foi medida a 6 dias após o plaqueamento. * Indica p 0,005 (teste de Mann-Whitney U, 2 caudas)
doi:. 10.1371 /journal.pone.0038618.s002
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Figura S3.
HE coloração de NIH3T3-MRGD enxertado tecido em ratinhos nus. Os aglomerados NIH3T3-MRGD em 7 dias após a inoculação em camundongos atímicos (A, × 40, B, × 800) mostrou um tipo de tecido tumoral de células fusiformes representante celular
doi:. 10.1371 /journal.pone.0038618.s003
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Figura S4.
HE e IHQ colorações de amostras de adenocarcinoma de pulmão com o anticorpo anti-MRGD. Coloração HE (A, C, E) e coloração IHC (B, D, F) foram realizados. Estes são os exemplos de três pacientes com adenocarcinoma de pulmão independentes. Paciente 1, A, B; Paciente 2, C, D; Paciente 3, E, F.
doi: 10.1371 /journal.pone.0038618.s004
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arquivo S1.
Material e Métodos da figura S2.
doi: 10.1371 /journal.pone.0038618.s005
(DOC)
Reconhecimentos
Gostaríamos de agradecer aos membros do R D Divisão de Daiichi Sankyo; N. Maeda e N. Abe para fazer blocos de células, M. Yamada para a coloração HE e IHQ amostras, S. Endo para análise estatística, e Dr. M. Ono, Dr. P. Rodley e Dr. Y. Abe por aconselhar em a elaboração deste relatório.