Abstract

Fundo

A maioria drogas quimioterápicas para matar o câncer as células são altamente citotóxicos em células normais, o que limita as suas aplicações clínicas. Portanto, um desafio permanente é a identificação de uma droga que é hipersensível à células cancerosas, mas tem efeitos deletérios mínimos sobre células saudáveis. Os objetivos deste estudo foram avaliar o potencial de 4β-hydroxywithanolide (4βHWE) para matar selectivamente as células cancerosas e para elucidar seus mecanismos relacionados.

Metodologia e principais conclusões

As mudanças na sobrevivência, oxidativo o stress, danos no ADN, e a apoptose de sinalização foram comparados entre o cancro tratado 4βHWE oral (Ca9-22) e (HGF-1), as células de fibroblastos normais. Ao fim de 24 h e 48 h, o número de células Ca9-22 foi fortemente reduzida, mas os números de células HGF-1 foram apenas ligeiramente diminuída. Além disso, o CI

50 valores para 4βHWE nas células Ca9-22 foram 3,6 e 1,9 ug /ml a 24 e 48 h, respectivamente. aumentos anormais dependentes do tempo em ROS e despolarização mitocondrial de dose-responsiva pode ser explorada usando 4βHWE em quimioterapias para matar selectivamente as células cancerosas. danos no DNA dependente da dose medida por ensaio extrato de cometa nuclear e análise de fluxo baseado em citometria de γ-H2AX /iodeto de propídio (PI) mostrou danos relativamente severo nas células Ca9-22. Em concentrações altas e baixas, 4βHWE perturbado de um modo preferido o ciclo celular em células Ca9-22 através do aumento da população subG1 e prisão de G1 ou G2 /M. indução selectiva de apoptose em células Ca9-22 foi ainda confirmada por anexina V /PI ensaio, por expressão preferencial de fosforilada ataxia-telangiectasia- e proteína relacionada com Rad3 (p-ATR), e por clivagem da caspase 9, caspase 3, e poli ADP-ribose polimerase (PARP).

conclusões /Significado

em conjunto, os resultados deste estudo, particularmente a uma melhor compreensão dos mecanismos de morte selectiva de 4βHWE, pode ser usado para melhorar a eficiência em matar células cancerosas orais durante quimioprevenção e terapia

Citation:. Chiu CC, Haung JW, Chang FR, Huang KJ, Huang HM, Huang HW, et al. E (2013) Golden Berry-Derived 4β-hydroxywithanolide para seletivamente matar células orais do cancro através da geração de ROS, danos no DNA, e apoptóticos Pathways. PLoS ONE 8 (5): e64739. doi: 10.1371 /journal.pone.0064739

editor: Siyaram Pandey, da Universidade de Windsor, Canadá |

Recebido: 22 Janeiro, 2013; Aceito: 17 de abril de 2013; Publicado em: 21 de maio de 2013

Direitos de autor: © 2013 Chiu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiado por bolsas do Conselho Nacional de Ciência (NSC101-2320-B-037-049), o Departamento de Saúde, Yuan Executivo, República da China (DOH102-TD-C-111-002), e do National Sun Yat- Sen University-KMU Projeto Comum de Investigação (# NSYSU-KMU 102-034). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de boca é o sexto tipo de câncer mais comum em todo o mundo [1]. A sua elevada morbidade e mortalidade são, em parte devido às suas relativamente pobres resultados de quimioterapia [2]. Devido à sua elevada citotoxicidade em células normais, os diversos fármacos anti-cancro orais desenvolvidas até agora têm aplicações terapêuticas limitadas. Portanto, um desafio permanente é desenvolver uma terapia anti-cancro oral que é mais seguro e mais eficaz, especialmente em termos de eficiência morte selectiva.

Extrato de

Physalis peruviana

(baga de ouro), que é uma planta comestível da família Solanaceae, supostamente confere um efeito anti-hepatoma através da apoptose [3]. Nosso trabalho anterior [4] descobriu que

P. peruviana

-derived E 4β-hydroxywithanolide (4βHWE) tem efeitos apoptóticos e antiproliferativa nas células de câncer de pulmão humanos [4]. Os withanolides 4βHWE são C (28) lactonas esteroidais derivados de plantas [5] com potentes propriedades anti-câncer [6]. Outros withanolides, como withaferin A, também teria induzir a apoptose em muitos tipos de cancro, incluindo o cancro da mama [7], melanoma [8], e leucemia [9].

As evidências acumuladas em estudos recentes indica que a activação selectiva de apoptose melhora a eficácia da quimioterapia do cancro [10] – [15]. Para uma melhor modulação do potencial apoptótica de células de cancro, uma linha de pesquisa promissora é a utilização de withanolides que matam selectivamente as células de tumor, mas que têm baixa toxicidade em células saudáveis ​​[13]. No entanto, o uso potencial de withanolides indutores de apoptose, como 4βHWE [4] e withaferin A [7] – [9] para a morte selectiva, especialmente em células de câncer bucal, raramente é discutido

Portanto, o presente estudo. examinou a eficácia potencial e mecanismos relacionados de

P. peruviana

-derived 4βHWE usado para matar selectivamente as células cancerosas orais.

Materiais e Métodos

As culturas celulares e drogas informações

Duas linhas celulares, Ca9-22 (humana carcinoma gengival) [16] – [18] e HGF-1 (fibroblastos gengivais humana normal) [19], foram cultivadas em Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) -F12 médio e meio DMEM (Gibco, Grand Island, NY), respectivamente , suplementado com soro fetal bovino a 10%, 100 U /ml de penicilina, 100 ug /ml de estreptomicina, 0,03% de glutamina, e piruvato de sódio 1 mM. Todas as células foram mantidas a 37 ° C numa atmosfera humidificada contendo 5% de CO

2. O 4βHWE (C

28H

38o

8; MW: 502,6). Foi preparado a partir de extracto de bagas de ouro como descrito em [4] e dissolvidos em dimetilsulfóxido (DMSO) para testes

avaliação da inibição de crescimento

O crescimento celular foi medido por (3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -5- (3-carboximetoxifenil) -2- (4-sulfofenil) -2H-tetrazólio ( MTS) ensaio como descrito em [18]. Resumidamente, as células foram expostas ao veículo de controlo (DMSO) ou a 4βHWE em concentrações de 1, 2, 5 e 10 ug /ml durante 24 h. As células foram então expostas a uma solução de MTS ( CellTiter 96 Aqueous One Solution, Promega, Madison, WI, EUA) e deixou-se incubar durante 1-2 horas a 37 ° C. O produto foi medida a 490 nm, utilizando uma absorvância Dynex Modelo MRX 96 Bem Plate Reader (Lab Sistemas de MTX, Inc., Vienna, VA, EUA).

Avaliação de espécies reactivas de oxigénio intracelulares (ROS)

intracelular ROS foi medida usando 2 ‘, 7’-diacetato dichlorodihydrofluorescein (DCFH-dA) a partir Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) como descrito anteriormente [17]. Após o tratamento 4βHWE, as células foram lavadas com PBS e depois incubadas com 10 pM H2DCF-DA em PBS durante 30 min a 37 ° C, no escuro. As células foram então colhidas e lavadas com PBS. Após centrifugação, as células foram ressuspensas em PBS e analisadas com um citómetro de fluxo FACSCalibur (Becton-Dickinson, Mansfield, MA, EUA) com o software Win-MDI (https://facs.scripps.edu/software.html) a excitação e emissão definições de 480 e 525 nm, respectivamente

Avaliação do potencial de membrana mitocondrial

potencial de membrana mitocondrial (ΔΨ

m; MitoMP). mediu-se utilizando um DIOC MitoProbe ™

2 ( 3) kit de ensaio (Invitrogen, San Diego, CA, EUA) como descrito em [16]. As células tratadas com 4βHWE foram suspensos em 1 ml de PBS quente, a cerca de 1 × 10

6 células /ml, carregados com 5 ul de 10 mM DIOC

2 (3), e incubou-se a 37 ° C em 5 % de CO

2 para 20-30 min. Após a colheita, as células foram lavadas, ressuspensas em PBS e analisadas imediatamente usando um citómetro de fluxo com o software Win-MDI com as definições de excitação e emissão de 488 e 525 nm, respectivamente.

A avaliação dos danos do ADN por cometa-NE ensaio

O extracto nuclear (NE) de células de HGF-1 foi utilizado para realizar o ensaio cometa-NE de acordo com um protocolo previamente descrito [4], [20] com ligeira modificação. Resumidamente, suspensões de células foram misturados com volumes iguais de 1,2%, ponto de fusão baixo agarose, imediatamente carregado em 1,2% lâminas pré-revestidas de agarose regulares, e depois arrefeceu-se com gelo até à solidificação. A terceira camada com um volume igual de gel de agarose de baixo ponto de fusão a 1,2% foi então carregado para o segundo gel solidificado e novamente arrefecida com gelo. Após o tratamento, a lise de células a 4 ° C durante 2 h, as lâminas foram processadas para NE digestão com uma lamela e incubou-se a 37 ° C durante 2 h num espaço humidificada. A desnaturação das lâminas em NaOH 0,3 N e EDTA 1 mM durante 20 min foi seguida por electroforese. Após a lavagem, as lamelas foram transferidas para Tris-HCl a 0,4 (pH 7,5), e iodeto de propídio 40 ul (PI, 50 ug /mL; Sigma, St Louis, MO, EUA) foi adicionado para a observação de microscopia de fluorescência (TE2000-L ; Nikon, Tokyo, Japão). No teste do cometa, foi utilizado um programa freeware (https://tritekcorp.com) para avaliar os danos do DNA em termos de percentagem do DNA da cauda [21].

Avaliação de danos no DNA pela γ-H2AX /PI citometria

Após tratamento 4βHWE, as células foram fixadas em etanol a 70%, lavadas duas vezes em solução de BSA-PBS-T (1% de albumina de soro bovino e 0,2% de Triton X-100 em PBS; Sigma), e incubadas durante a noite a 4 ° C em 100 ul de solução de BSA-PBS-T contendo 0,2 ug de p-Histona H2A.X (Ser 139) de anticorpo monoclonal (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EUA). Após lavagem, as células foram suspensos durante 1 hora em uma diluição de anticorpo secundário marcado com 488-Alexa Fluor 1:100 (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, USA). Após outra lavagem, as células foram ressuspensas em 5 ug /ml de PI para análise com um citómetro de fluxo FACSCalibur com software Win-MDI.

A avaliação da distribuição do ciclo celular e sub-G1 da população

a coloração de PI foi realizada como descrito anteriormente [20]. Resumidamente, as células foram tratadas com veículo (apenas DMSO) ou 0,5, 1, 2, 5, e 10 ug /ml 4βHWE durante 24 e 48 h. Após a colheita, as células foram fixadas durante a noite com 70% de etanol. Após centrifugação, as peletes de células foram incubadas com 10 ug /ml de PI e 10 ug /ml de RNase A em PBS durante 15 min à temperatura ambiente na escuridão. As amostras foram então analisadas com um citómetro de fluxo FACSCalibur e o software Win-MDI.

A avaliação da apoptose

A apoptose foi medida por anexina /PI dupla marcação (Pharmingen, San Diego, CA, EUA) como previamente descrito [22]. Resumidamente, as células foram tratadas com o veículo ou com 4βHWE em doses de 1, 2, e 5 ug /ml durante 24 h. As células foram então incubadas com 10 ug /ml de anexina V-isotiocianato de fluoresceína e 5 ug /ml de PI e analisadas com um citómetro de fluxo FACSCalibur (Becton-Dickinson) com o software Win-MDI.

Western blotting

ensaio Western blot foi realizada tal como descrito previamente [23]. Resumidamente, as células foram primeiro colhidas e lisadas. Os lisados ​​foram centrifugados, e as concentrações de proteína foram determinadas. Os 40 ug de proteína de lisados ​​foram separados por electroforese em gel de SDS-poliacrilamida a 10% e, em seguida, electrotransferidas. As membranas foram bloqueadas com leite não gordo a 5%. As membranas foram, então, incubadas com anticorpos primários contra fosforilada ataxia-telangiectasia- e proteína relacionada com Rad3 (p-ATR) (# sc-109912, Ser 428, Santa Cruz Biotech., CA, EUA), caspase-9 (# 9501 , Cell Signaling Technology, Beverly, MA, EUA), caspase-3 clivada (# IMG-144A, IMGENEX, San. Diego, CA, EUA), clivado poli polimerase de ADP-ribose (PARP) (# 9541, Cell Signaling Technology) e β-actina (# sc-8432, Santa Cruz Biotech.), e os anticorpos secundários correspondentes. A ECL ™ (Amersham Piscataway, NJ, EUA), kit de detecção de quimiluminescência foi então utilizado para a detecção de sinais.

A análise estatística

Todos os dados foram apresentados como média ± SD. diferenças entre os grupos na viabilidade celular e ciclo celular foram avaliados usando JMP® 9 software para executar one-way ANOVA com Tukey HSD Post Hoc de teste. Níveis que não estão ligados pela mesma letra minúscula indicaram diferenças significativas. Outros dados foram analisados ​​por Student

t

-teste.

Resultados

Avaliação da inibição do crescimento

O ensaio MTS da viabilidade celular após 24 horas e 48 h tratamento com 4βHWE (0, 1, 2, 5 e 10 ug /mL) mostrou que, para cada concentração experimental de 4βHWE, a proliferação das células cancerosas por via oral Ca9-22 foi significativamente menor do que o de HGF 1-células normais (um- way ANOVA) (Figura 1). Em HGF-1, o tratamento com células 10 viabilidade ug /ml 4βHWE ligeiramente diminuída de células de 89,02 ± 1,17% e para 65,42 ± 2,26% após 24 h e 48 h, respectivamente. Em contraste, a viabilidade das células tratadas com Ca9-22 4βHWE tratados similarmente drasticamente diminuída para 26,56 ± 2,22 e 16,01 ± 2,38 após 24 h e 48 h, respectivamente. O efeito anti-proliferativo em células de 4βHWE Ca9-22 foi tanto de dose de resposta e dependente do tempo. Além disso, IC

50 valores foram de 3,6 e 1,9 ug /ml após 24 h e 48 h, respectivamente, em células tratadas com Ca9-22 4βHWE Considerando IC

50 nao foi detectada em células de HGF-1 tratadas de forma semelhante.

As células foram tratadas com 0, 1, 2, 5, e 10 ug /ml 4βHWE durante 24 e 48 h. Os dados, média ± SD (n = 3). Para as mesmas concentrações de droga em quatro grupos diferentes (Ca9-22 durante 24 h, Ca9-22 durante 48 h, o HGF-1 durante 24 h, o HGF-1 durante 48 horas), os dados não ligados pela mesma letra minúscula ( canto superior direito da SD) diferiram significativamente (one-way ANOVA com Tukey HSD Post Hoc Test).

Avaliação da ROS

Alguns withanolides como withaferin um induzir supostamente morte celular em células de melanoma através da geração de ROS [8]. Portanto, este estudo seguinte comparou os efeitos de regulação do ROS sobre a proliferação de células Ca9-22 e HGF-1. As Figuras 2A e 2B mostram as intensidades de fluorescência de ROS em termos de percentagens de células Ca9-22 e HGF-1 positivos para DCFD-A, que foram contadas após tratamento com 3,6 jig /ml 4βHWE para vários intervalos de tempo. A Figura 2C mostra a indução suave de ROS observada em células HGF-1 em comparação com a indução dependente do tempo relativamente dramática de ROS nas células Ca9-22. Para cada concentração experimental de 4βHWE, a percentagem de-um DCFD células positivas foi significativamente mais elevada nas células cancerosas Ca9-22 oral do que nas células normais HGF-1 (

P

0,0001).

As células foram administrados num veículo e 3,6 ug /ml de 4βHWE para diferentes intervalos de tempo (0 a 5 h). Para medir a mudança ROS, 200? M H

2O

2 foi usado como um controlo positivo. (A, B) fluxo Representante baseada em citometria de ROS perfis de células tratadas com 4βHWE. (C) Análise de quantificação da intensidade de ROS em termos de positividade DCFD-A (%). Os asteriscos indicam diferenças significativas entre duas linhas de células após o tratamento com concentrações 4βHWE semelhantes (

t

-teste,

P Art 0,0001 **).

Avaliação dos potenciais de membrana mitocondrial (mitoMP)

em seguida, uma DIOC

2 (3) ensaio foi realizado para examinar os efeitos de indução de ROS induzida 4βHWE em mitoMP. As Figuras 3A e 3B mostram as intensidades de fluorescência mitoMP em termos de percentagens de DIOC

2 (3) células -positivo Ca9-22 e HGF-1 após 24 h de tratamento com 0, 1, 2, e 5 ug /ml 4βHWE. A Figura 3C mostra que mitoMP moderadamente diminuídas em células HGF-1, mas diminuiu substancialmente em Ca9-22 células de uma forma dependente da dose. Para cada concentração experimental de 4βHWE, a percentagem de células positivas para DIOC

2 (3) foi significativamente inferior nas células Ca9-22 do que nas células do HGF-1 (

P

0,0005).

(A, B) de fluxo representativas perfis MitoMP baseados em citometria de-tratada 4βHWE Ca9-22 e células HGF-1. As células foram tratadas com várias concentrações (0-5 ug /ml) de 4βHWE durante 24 h. (C) Análise de quantificação da intensidade MitoMP. Os dados são apresentados como médias ± desvios padrões% (n = 3). Os asteriscos indicam diferenças estatisticamente significativas entre as linhas de células Ca9-22 e HGF-1 após o tratamento com concentrações semelhantes de 4βHWE (

t

-teste,

P Art 0,0005 **).

Avaliação de danos no DNA pelo cometa-NE ensaio

no teste do cometa-NE (Figura 4A), os efeitos de “decantação” observadas nas células Ca9-22 foram maiores em alto concentrações 4βHWE. Em contraste, nenhuma das concentrações experimentais 4βHWE induziu um efeito observável rejeito em células HGF-1. A Figura 4B mostra que as células o HGF-1 não mostrou nenhum aumento visível no ADN da cauda% enquanto que as células Ca9-22 mostraram aumento dramaticamente% de ADN da cauda de um modo dose-resposta. Para cada concentração experimental de 4βHWE, o dano de ADN em termos de% de ADN nas caudas de células tratadas com 4βHWE era significativamente mais grave, em células de HGF-1 do que nas células Ca9-22 (

P

0,0001) .

(a) representativos cometa os resultados da coloração de PI para células de controlo (DMSO) e as células tratadas com 0,5, 1, 2, e 5 ug /ml 4βHWE durante 2 h. Os núcleos aparecem como manchas vermelhas, e as caudas dos pontos indicam a gravidade dos danos no DNA após tratamentos 4βHWE. (B) Média da% de ADN da cauda no-tratados 4βHWE Ca9-22 e células HGF-1. Os dados, a média ± SD (núcleos = 50). Os asteriscos indicam diferenças significativas entre as linhas celulares Ca9-22 e HGF-1 após o tratamento com concentrações 4βHWE semelhantes (

t

-teste,

P Art 0,0001 **).

Avaliação de danos no DNA pela γ-H2AX /PI citometria

Para mais uma confirmação do envolvimento de danos no DNA de inibição induzida 4βHWE do crescimento em células de câncer bucal Ca9-22, a dupla fita de DNA pausa (DSB) foi medido em termos de expressão γ-H2AX. A Figura 5A mostra os perfis γ-H2AX /PI coloração obtidos após 24 h de tratamentos com controlo positivo ou com 0, 0,1, 0,25, 0,5 e 1 ug /ml de 4βHWE. A Figura 5B mostra que, após tratamento com concentrações 4βHWE inferior a 2 ug /ml, as células HGF-1 mantidos baixos níveis de expressão γ-H2AX enquanto que as células Ca9-22 mostraram aumentos dramáticos dependentes da dose na expressão γ-H2AX. Em concentrações mais elevadas de 4βHWE, no entanto, a alteração vezes na% de células γ-H2AX-positivas foi significativamente maior em células do que em células Ca9-22 HGF-1 (

P

0,0005).

As células foram tratadas com 0, 1, 2, e 5 ug /ml de 4βHWE durante 24 h. (A) O fluxo representativas perfil ORL-base para citometria-tratada 4βHWE Ca9-22 e células HGF-1. As células tratadas com 5 uM de camptotecina (CPT) durante 24 h foram consideradas controlo γ-H2AX positivo. (B) Análise de quantificação das alterações de dobragem em danos no ADN baseada em γ-H2AX em-tratada 4βHWE Ca9-22 e células HGF-1. Os dados, a média ± SD. Os asteriscos indicam diferenças estatisticamente significativas entre Ca9-22 e células HGF-1 tratados com concentrações 4βHWE semelhantes (

t

-teste,

P Art 0,0005 **; n = 2 e 3, respectivamente).

Avaliação da distribuição do ciclo celular

Figura 6 mostra que, após 24 horas de tratamento com 4βHWE, a variação percentual em populações sub-G1 em células HGF-1 não foi estatisticamente significativa em concentrações inferiores a 2 ug /ml. A alteração percentual em sub-G1 ligeiramente aumentada para 2,75% quando a concentração atingiu 5 ug /ml. Em contraste, a variação percentual na sub-G1 em células Ca9-22 tratados com 4βHWE durante 24 h começou a mostrar mudanças significativas em concentrações tão baixas quanto 2 mg /ml e, eventualmente, chegou a 30,59%. Depois de 48 h de tratamento, a percentagem de populações sub-G1 em células de HGF-1 moderadamente aumentada para 25,03% e 29,42%, após tratamentos com 2 e 5 ug /ml 4βHWE, respectivamente. Em contraste, a percentagem de sub-G1 em células tratadas com Ca9-22 4βHWE durante 48 horas mostrou uma alteração estatisticamente significativa (42,76%) após o tratamento com 1 ug /ml e uma mudança muito maior (78,89%) após o tratamento com 5 ug /ml.

As células foram tratadas com 0, 1, 2, e 5 ug /ml 4βHWE durante 24 h e 48 h. (A) a distribuição do ciclo celular Representante no tratado 4βHWE Ca9-22 e células HGF-1. percentagens (B) a fase celular obtidos para (A) em ensaios em triplicado. Para a mesma fase de diferentes concentrações de drogas, os dados não ligados pela mesma letra minúscula (canto superior direito da SD) diferiram significativamente (one-way ANOVA com Tukey HSD Post Hoc Test).

No 24 h, analisa um dos símbolos G1 e G2 /M em populações de células HGF-1 mostrou uma alteração não significativa na população G1 e um nível basal de alteração da poluição G2 /M. Em contraste, após 24 horas de tratamento 4βHWE, as células Ca9-22 mostrou mudanças significativas em paragem em G1 (57,49% e 40,75% a 0,5 e 1 ug /ml, respectivamente) e em G2 /M de detenção (50,44% e 62,08% em 1 e 2 ug /mL, respectivamente). Depois de 48 h de tratamento com 5 ug /ml βHWE, a população de células G1 em HGF-1 diminuiu ligeiramente para 56,27%, enquanto que a fase G2 /M aumentou ligeiramente população. Em contraste, as células mostraram Ca9-22 (79,23%) G1 prisão substancial após 48 h de tratamento com uma concentração 4βHWE de apenas 0,5 ug /ml. No G2 /M população, o tratamento com 1 ug /ml resultou em 4βHWE moderada a paragem em G1 (27,34%) juntamente com acumulações subG1 dramáticas como descrito acima.

A avaliação da apoptose

Para examinar a envolvimento da apoptose na acumulação sub-G1-induzida 4βHWE, fluxo baseado em citometria de anexina V /PI dupla coloração foi realizada. A Figura 7A mostra os perfis de coloração γ-H2AX /pi de HGF-1 e células Ca9-22 tratados com diferentes concentrações 4βHWE. As áreas positivas duplas de y-H2AX e PI intensidades são comumente definida como final de apoptose. Análises de tardia de apoptose (Figura 7B) mostrou um aumento dependente da dose suave nas células o HGF-1, mas um aumento dependente da dose em células dramática Ca9-22. Para cada concentração experimental de 4βHWE, a percentagem de células que sofreram apoptose tardia após o tratamento 4βHWE foi significativamente maior em células do que em células Ca9-22 HGF-1 (

P

0,0001).

As células foram tratadas com 0, 1, 2, e 5 ug /ml 4βHWE durante 24 h. perfis apoptóticos representativos (A) obtidos por dupla marcação anexina V /PI em Ca9-22 tratados 4βHWE e células HGF-1. os resultados da análise (B) Quantificação de apoptose tardia população (%). Apenas anexina V (+) /PI (+) regiões foram analisados. Os dados, média ± SD (n = 3). Os asteriscos indicam diferenças estatisticamente significativas entre duas linhas de células (Ca9-22 e HGF-1) tratados com concentrações 4βHWE semelhantes (

t

-teste,

P Art 0,0001 **).

Avaliação de sinalização apoptótica

sinalização apoptótica foi analisada por ensaios de transferência Western de Ca9-22 e HGF-1 As células tratadas com várias concentrações de 4βHWE (0, 1, 2, e 5 ug /ml). A Figura 8 mostra que as concentrações cada vez maiores de 4βHWE induziu aumentos graduais na fosforilação ATR associada a danos no ADN celular nas células Ca9-22. A clivagem de caspase 9, caspase 3 e PARP também foi induzida em células Ca9-22, especialmente em concentrações 4βHWE de 2 ug /ml e 5 ug /ml. Em contraste, 4βHWE não desencadearam qualquer fosforilação ATR ou activação da cascata de caspase nas células do HGF-1.

As células foram tratadas com 0, 1, 2, e 5 ug /ml 4βHWE durante 24 h. A apoptose proteínas, tais como p-ATR, e a clivagem de pró-caspase 9 de sinalização, de pró-caspase 3 e PARP foram detectadas. A β-actina foi utilizado como um controlo interno. Cada mancha representa uma experiência independente realizada em triplicado.

Discussão

withanolides são derivados de plantas C (28) lactonas esteroidais com actividade anti-câncer potente [24], [25] . No entanto, a utilização de células cancerosas withanolides para matar selectivamente não foi intensivamente estudada. Withaferin A é conhecido por induzir a apoptose em diversos tipos de cancro, incluindo leucemia [9], o melanoma [8], e os cancros da mama [7], fígado [26], pâncreas [27], do cólon [28], do pulmão [29 ], e da próstata [30]. Em estudos anteriores, os ensaios de XTT realizada após 24 h de tratamento com withaferin A mostrou IC

50 valores de 2 uM em células de leucemia (HL-60) [31], 4 uM em células de cancro da próstata (PC3) [30], e 6 M em células do cancro renal (Caki) hepatoma (SK-HEP1), cancro do cólon (HT29), e [26]. Relatado IC

50 valores obtidos por ensaios MTT de células de cancro da mama (MDA-MB-231) incluem 13? M para anomanolide A, 15 uM para tubocapsanolide E, e 20 uM para tubocapsenolide B, tubocapsanolide C, e peruvianolide H [ ,,,0],6].

recentemente, withanolide derivado de Ashwagandha folha extrair [32] mostrou ter um papel potencial para matar selectivamente células de cancro da mama MCF-7 a uma concentração de 24 ug /ml de [33]. O presente estudo semelhante mostrou que o IC

50 valores das células de câncer bucal Ca9-22 foram 3,6 ng /ml (7,16 uM) e 1,9 ug /ml (3,78 uM) após 24 h e 48 h de tratamento com 4βHWE, respectivamente. Nós supomos que o efeito de eliminação selectiva de 4βHWE pode ser comparável ou ainda mais potente em outras linhas de células de cancro oral. Em células de HGF-1, no entanto, IC

50 valores foram indetectáveis ​​por ensaio de MTS em concentrações inferiores a 10 ug /ml. Em outros estudos de tratamentos 4βHWE durante 24 h, um IC

50 valor de 6 uM foi relatado num ensaio MTT de cancro da mama MDA-MB-231 [6] e um IC

50 valor de 1,41 uM foi relatado num ensaio de azul de tripano de células do cancro do pulmão H1299 [4]. Estes dados indicam que a sensibilidade ao fármaco de 4βHWE varia de acordo com o tipo de célula cancerosa. Além disso, o presente estudo é o primeiro a confirmar que 4βHWE mata células cancerosas orais preferencialmente às células orais normais.

Além disso, os efeitos protetores do withanolides são encontrados em células de fibroblastos normais. Por exemplo, withanone derivado da folha Ashwagandha protege contra fibroblastos humanos normais de senescência paragem do crescimento semelhante induzida por ácido metoxiacético em termos de coloração β-galactosidase associada à senescência [34]. Da mesma forma, o presente estudo constatou que a morfologia das células o HGF-1 tratadas com 1, 2, e 5 ug /ml 4βHWE foi semelhante ao de células de fibroblasto não tratada HGF-1 (dados não mostrados). São necessários mais estudos de fenótipos parada do crescimento para determinar se 4βHWE é seguro para as células normais.

Embora o acúmulo de evidências concorda que withanolides induzir a apoptose ROS mediada, seu uso potencial para matar selectivamente as células cancerosas é relativamente clara. Por exemplo, withaferin Uma é conhecida por induzir a apoptose mediada por ROS no cancro da mama [7], o melanoma [8], e leucemia [9], [31]. Embora as células cancerosas se espera que tenham maior estresse oxidativo em comparação com as células normais [35], as células normais podem tolerar um grau de estresse oxidativo exógeno suficiente para evitar a sobrecarga, resultando em morte celular. Em contraste, as células cancerosas expostas a stress oxidativo elevado não podem tolerar os agentes que modulam a ROS-exógenos, e aumentam a morte celular como o nível de limiar é excedido [36]. Este conceito pode explicar em parte os efeitos seletivos de morte do 4βHWE em células cancerosas orais observadas aqui e os de withanone em células de cancro da mama como relatado em [33], ou seja, tanto a indução ROS e da redução do potencial de membrana mitocondrial são mais elevados em células de câncer em comparação para as células normais. Estes resultados sugerem que as terapias para matar selectivamente as células cancerosas devem ser orientadas para a modulação do estado redox em ambas as células cancerosas e células normais [36]. No entanto, os papéis de caspases e inibidores de caspase [37] em apoptose selectiva induzida 4βHWE precisar de mais estudo.

Os efeitos de ROS mediada por withanolides pode ser modulada por antioxidantes. Por exemplo, N-acetilcisteína podem resgatar alegadamente células de melanoma humano a partir withaferin A-induzida, a apoptose mediada por ROS [8]. Assim, o papel das ROS na matança seletiva de 4βHWE pode ser melhor esclarecida através do estudo de moduladores de ROS.

O ROS são conhecidas para induzir danos no DNA e respostas checkpoint [38]. Por exemplo, os ensaios de cometa e NE γ-H2AX neste estudo revelou que 4βHWE induzida danos no ADN e G1 ou G2 /M paragem do ciclo celular, ambos os quais têm sido anteriormente observado em outros withanolides. Por exemplo, alegadamente inibe tubocapsanolide Uma proliferação de células A549 do cancro do pulmão através de paragem em G1 [39]. No entanto, 4βHWE [4] e withanone [33] são conhecidas para induzir danos no DNA e, em seguida, parada em G2 /M em células H1299 câncer de pulmão e no cancro da mama células MCF-7, respectivamente.

danos no DNA Seletiva ( ou seja, a DSB) pode ser monitorizada por H2AX, que é fosforilado de um modo dependente da ATR [40]. O H2AX também ajuda a estabilizar o genoma [41] e é essencial para a caspase-activado fragmentação de ADN [42]. Como esperado, o tratamento 4βHWE induzida expressões mais elevadas do ATR e proteínas caspase sinalização em células Ca9-22 em comparação com células de HGF-1.

Após 24 h de tratamento com 2 ug /ml 4βHWE, Ca9-22 e HGF-1 células mostraram viabilidade de células (%) de 56,09 ± 1,78 e 92,81 ± 2,20 (Figura 1); mitoMP (%) de 61,18 ± 3,21 e 99,81 ± 0,74 (Figura 3); γ-H2AX (dobra) de 8,47 ± 0,54 e 0,73 ± 0,19 (Figura 5); populações subG1 (%) de 14,74 ± 0,30 e 1,32 ± 0,15; G2 /M prisões de 62,08 ± 1,03 e 15,89 ± 0,19 (Figura 6) tarde apoptose (%) de 13,80 ± 1,05 e 7,97 ± 0,06 (Figura 7); e sobre- e sub-expressão de proteínas de sinalização de apoptose (Figura 8), respectivamente. Estes resultados mostram consistentemente os efeitos de 4βHWE em termos de morte selectiva, disfunção mitocondrial selectiva, danos no ADN selectivo (isto é, a DSB), G2 selectiva /M detenção, e a apoptose selectiva de células Ca9-22 preferencialmente às células o HGF-1. Depois de um tratamento semelhante com 3,6 jig /ml 4βHWE durante 2 h, a Ca9-22 e células HGF-1 demonstraram a indução de ROS (%) de 158,83 ± 0,34 108,63 ± 1,04 e (Figura 2) e danos no ADN-baseada-NE cometa de 29,21 ± 5,93 e 0,27 ± 0,52 (Figura 4), respectivamente. Estes resultados confirmaram ainda que o tratamento 4βHWE induz seletivamente ROS e danificar o DNA em células Ca9-22 em detrimento de células HGF-1.

Em conclusão, os resultados deste estudo confirmam que o tratamento 4βHWE induz seletivamente ROS, despolarização mitocondrial , e danos no ADN, que por sua vez induz a apoptose selectiva de sinalização, o que finalmente resulta na destruição selectiva das células cancerosas por via oral (Figura 9). Consequentemente, este estudo demonstrou, pela primeira vez, que o tratamento 4βHWE mata selectivamente as células cancerosas por via oral, de preferência a células orais normais. Um estudo mais aprofundado dos candidatos alvo e mecanismos de sinalização aqui relatados também pode fornecer um suficientemente melhor compreensão dos mecanismos de morte selectiva de 4βHWE para permitir a sua utilização eficaz no tratamento de câncer oral com mínimos efeitos adversos.

As alterações nas Ca9-22 As células são indicadas por setas azuis. células oral normal (não mostrados) mostraram alterações relativamente menores em comparação com as células Ca9-22. Em Ca9-22 tratado com 4βHWE, reforçada geração de ROS resultou em aumento do estresse oxidativo. A indução de ROS aumentada, em seguida, disfunção mitocondrial e facilitou a redução do potencial de membrana mitocondrial em células Ca9-22. Indução de ROS também resultou em um aumento de danos no DNA em células Ca9-22, por exemplo, γ-H2AX em ORL, que, em seguida, induziu fosforilação ATR. Juntos, mitocondrial sinalização de danos e de sinalização de danos ao DNA resultou em aumento da sinalização de apoptose, que, em seguida, levou a apoptose seletiva e morte de células Ca9-22.