Abstract

A quimioterapia padrão para tumores cerebrais é temozolomida (TMZ), no entanto, como muitos como 50% dos tumores cerebrais são declaradamente TMZ resistentes deixando pacientes sem uma opção quimioterapêuticos. Foi realizada rastreio em série de linhas de células de astrocitoma resistente TMZ, e compostos identificados que são citotóxicos para as células. O composto mais citotóxico foi um análogo de ácido tiobarbitúrico a que nos referimos como CC-I. Há um efeito citotóxico dependente da dose de CC-I em células de astrocitoma resistente TMZ. A morte celular parece ocorrer através de apoptose. Após a exposição CC-I, houve um aumento nas células de astrocitoma na S e G2 /M fases. Em

in vivo

atímicos (

nu

/

nu

) ratos nu modelos de tumores subcutâneos e intracranianas, eu CC-crescimento do tumor inibiu completamente sem hepática ou renal toxicidade. ensaios de modelagem e atividade enzimática moleculares indicam que CC-I inibe selectivamente topoisomerase IIα semelhante a outras drogas em sua classe, mas os seus efeitos citotóxicos sobre as células astrocitoma são mais fortes que estes compostos. O efeito citotóxico do CC-I é mais forte em células que expressam não metilado O

6-metilguanina metiltransferase (MGMT), mas ainda é tóxico para as células com MGMT metilado. CC-I também pode aumentar o efeito tóxico de TMZ em astrocitoma quando os dois compostos são combinados. Em conclusão, nós identificamos um composto que é eficaz contra astrocitomas incluindo astrocitomas resistentes TMZ tanto na cultura de células e

In vivo

modelos de tumor cerebral. A citotoxicidade melhorada do CC-I e o perfil de segurança desta família de drogas poderia fornecer uma ferramenta interessante para a avaliação mais ampla contra tumores cerebrais

Citation:. Lee SY, Slagle-Webb B, Rizk E, Patel A, Miller PA, Sung SS, et al. (2014) Caracterização de um novo composto anti-cancro para astrocitomas. PLoS ONE 9 (9): e108166. doi: 10.1371 /journal.pone.0108166

editor: Javier S. Castresana, da Universidade de Navarra, Espanha |

Recebido: 19 de maio de 2014; Aceito: 19 de agosto de 2014; Publicação: 25 de setembro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Lee et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel

Financiamento:. Este projecto é financiado, em parte, por uma concessão com o National Cancer Institute dos Institutos Nacionais de Saúde sob Award Número R21CA167406 para SL. O conteúdo é da exclusiva responsabilidade dos autores e não representam necessariamente as opiniões oficiais dos Institutos Nacionais de Saúde. Este estudo também apoiado em parte pela U. Pardee Fundação Elsa eo Tara Leah Witmer Endowment. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES: Connor é proprietário parcial de NuHope LLC, que tem um interesse financeiro no desenvolvimento de compostos para o tratamento tumores cerebrais que foram inicialmente rastreados utilizando linhas de células escolhidas para HFE genótipo. Lee tem um acordo de royalties com NuHope LLC. Isto não altera a adesão dos autores para PLOS ONE políticas em dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

conta Gliomas por 28% de todos os cerebral primário e tumores do sistema nervoso central (SNC), e 80% dos gliomas malignos são [1]. Entre os gliomas, glioblastomas (glioblastoma multiforme, astrocitoma de grau IV, GBM) é o glioma maligno mais comum. A taxa de mortalidade da cerebral maligno primário e tumores do SNC é elevada; cerca de 22,620 novos casos em adultos de cerebral maligno e cânceres do sistema nervoso central, em 2013 [1] e 13.700 mortes ocorreram em 2012 [2]. A sobrevida média para pacientes com GBM foi de 14,6 meses ea sobrevivência dois anos de pacientes com GBM foi de 10,4% para a radioterapia sozinho e apenas 26,5% passando por tratamento combinado de terapia de temozolomida (TMZ) e radiação [3].

A tratamento padrão atual para GBM é a ressecção total seguida de radioterapia isolada ou combinação com quimioterapia TMZ [4], [5]. TMZ é um agente alquilante oral utilizado no tratamento de cancro do cérebro,

por exemplo.

, Oligodendroglioma GBM e [6]. Também tem sido usada para tratar o melanoma, o cancro da próstata, o carcinoma pancreático, o sarcoma de tecido mole, carcinoma de células renais e [7] – [11]. TMZ inibe a reprodução celular por inibição da replicação de ADN [12], e tem características únicas em comparação com outros agentes de alquilação. Por exemplo, é administrado por via oral, atravessa a barreira sangue-cérebro, é menos tóxico do que a outros agentes alquilantes, e não faz quimicamente ADN de ligação cruzada. No entanto, embora TMZ é o padrão actual quimioterapêutico para o tratamento de tumores do cérebro e de outros cancros, tal como cerca de 50% dos tumores cerebrais são resistentes à terapia TMZ [13], [14]. Além disso, quase todos os tumores, eventualmente, voltar e a grande maioria dos tumores recorrentes são resistentes à quimioterapia [15], [16]. Portanto, o desenvolvimento de novas opções de tratamento, incluindo novas drogas para tumores cerebrais resistentes à terapêutica é urgentemente necessário.

Além dos agentes de alquilação, como TMZ, inibidores da topoisomerase são outro grupo de drogas anti-câncer em avaliação. As topoisomerases são enzimas nucleares importantes que regulam a topologia do ADN, mantêm a integridade genómica e são essenciais para a replicação de ADN, a recombinação, transcrição e cromossoma segregação [17]. Há seis enzimas humanas topoisomerase [18] e três deles, topoisomerase I, topoisomerase IIα e topoisomerase IIβ, têm um envolvimento significativo no câncer e quimioterapia [19]. A topoisomerase I enzima nicks e se une a uma cadeia do DNA duplex, e enzima topoisomerase II transitoriamente quebra e fecha DNA de cadeia dupla [20]. Os inibidores da topoisomerase I (e.g., topotecano) têm sido utilizadas em doentes com cancro recorrente das células pequenas do pulmão, os gliomas malignos recorrentes, tumores cerebrais recorrentes infância [21], [22]. Embora os inibidores da topoisomerase II foram estudados em células de glioma [23] – [25], os inibidores da topoisomerase II não têm sido amplamente utilizados em adultos com tumores primários do cérebro, devido à sua fraca penetração do SNC. Portanto, pequenas moléculas com a capacidade de penetrar o cérebro seria altamente desejável para tratar gliomas

in vivo

.

Temos relatado anteriormente que as células do neuroblastoma humano e linhas de células de astrocitoma humanas que expressam polimorfismos que ocorrem comumente no gene HFE eram resistentes à quimioterapia e à radiação [26]. O produto do gene HFE está envolvida na homeostase do ferro e os polimorfismos comuns HFE, H63D e C282Y, levam a uma série de alterações nas células, tais como o aumento do estresse retículo endoplasmático e aumento do stress oxidativo [27] – [29]. No presente estudo, utilizou-se linhas de células de astrocitoma que identificamos com as variantes do gene HFE e resistência TMZ para rastrear compostos de DIVERSet biblioteca de compostos de Chembridge (San Diego, CA) e encontraram um número de compostos eficazes com um quimiotipo similar. Foram identificados um análogo de um composto de ácido tiobarbitúrico que tem forte efeito tóxico sobre as células de astrocitoma-resistentes TMZ. Relatamos aqui a caracterização do composto de chumbo no

in vitro

cultura de células e

in vivo

modelos de tumor cerebral.

Materiais e Métodos

Materiais

de Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM), soro fetal de bovino (FBS) e outros componentes de cultura celular foram adquiridos a Life Technologies (Grand Island, NY). Todos os ingredientes de matriz de PCR foram fornecidos a partir SABiosciences (Frederick, MD). TMZ foi comprado de Oakwood Products Inc. (West Columbia, SC) e foi dissolvido no meio de cultura celular ou 100% de DMSO. O composto I-quimiotipo de chumbo (CC-I) foi pedido de ChemBridge Corporation (San Diego, CA). O composto foi dissolvido em DMSO como uma solução mãe e dilui-se para a experiência. enzimas topoisomerase I e kits de ensaio IIα foram encomendados à TopoGen Inc. (Port Orange, FL). Merbarona foi obtido a partir de Calbiochem (San Diego, CA). Todos os outros químicos utilizados foram adquiridos da Sigma Co. (St. Louis, MO).

cultura de células de astrocitoma humano, tratamento e ensaio de citotoxicidade

células de astrocitoma humanas (SW1088 de grau III, U87-MG-grau IV,-STTG1 grau CCF IV, T98G de grau IV,-18-grau LN IV) foram encomendados a partir de American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) e mantidas em DMEM (Gibco por Life Technologies, catálogo 11885) suplementado com 100 U /mL de penicilina, 100 ug /ml de estreptomicina, 0,29 mg /ml de L-glutamina, e 10% de FBS. Todas as experiências foram realizadas a 37 ° C em 5% de CO condições de cultura de células

2 atmosfera. Para os ensaios de citotoxicidade, os compostos testados foram preparados primeiro por diluição los a partir da solução em meios de cultura celular. Os compostos foram expostas às células durante 3-6 dias. citotoxicidade celular foi realizada pela MTS [3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -5- (3-carboximetoxifenil) -2- (4-sulfofenil) -2H-tetrazólio] ensaio de proliferação celular (Promega, Madison, WI ) ou sulfo-rodamina B (SRB) ensaio no final do período de cultura de células.

toxicidade aguda determinação

toxicidade aguda de CC-I foi determinada em ratinhos nus atímicos (estirpe 088 ou 490, Charles River Laboratories, Wilmington, MA) de acordo com o procedimento de toxicidade aguda do programa de desenvolvimento de drogas NIH, com pequenas modificações. Para determinar a toxicidade aguda, um total de seis ratinhos fêmea (1-2 meses de idade) foram injectados por via intraperitoneal com 3 doses diferentes (por exemplo, 20 mg /kg, 37,5 mg /kg, 50 mg /kg) de CC-I ou veículo controle de uma vez por semana e, em seguida observados durante um período de 7-14 dias. Os ratos foram observados diariamente para alterações no peso corporal, infecção dérmica visível e /ou palpável, presença de ascite, o consumo de alimentos ou estado nutricional, e aliciamento ou prejudicada mobilidade ou morte para determinar a toxicidade aguda. Em 7-14 dias após o tratamento, 0,5-1 ml de sangue foi recolhido através de punção cardíaca do coração quando os ratos estavam sob anestesia (cetamina 100 mg /kg de peso corporal /xilazina 10 mg /kg de peso corporal, por via intraperitoneal) para exame toxicidade sangue . Todos os animais no estudo foram alojados em salas de ambiente livre de germes, e sistemas de bolha individuais. Todas as experiências com animais foram aprovados (IACUC # 2011-062) pelas comissões Institutional Animal Care e Uso Pennsylvania State University.

modelo de tumor subcutâneo

Para testar o efeito anti-tumoral de CC- Eu contra o tumor astrocitoma humano, um de dois meses imunodeficientes sexo feminino (

nu

/

nu

) ratos pelados (estirpe 088 de Charles River Laboratories, Wilmington, MA) foram implantados 10 × 10

6 células por via subcutânea rato com SW1088 sensível TMZ ou células astrocitoma TMZ resistentes CCF-STTG1. Quando o tumor atingiu aproximadamente 32-100 mm

3 em tamanho, os ratos (n = 10 ou 11) foram divididos aleatoriamente em dois grupos. O CC-I foi injectado por via intraperitoneal com uma concentração de 25 mg /kg de peso corporal, num volume de 200-300 uL em 12,5% de etanol, uma vez por semana durante 7 semanas. O grupo de controlo foi dada solução salina tamponada com fosfato (PBS) no mesmo volume e o regime. O tamanho do tumor foi medido semanalmente com um compasso de calibre de Vernier, durante 7 semanas por um investigador cego para condições experimentais. O volume do tumor (V) foi calculado de acordo com a fórmula V =

a

2/2 × b, onde

a

e

b Quais são os eixos maiores e menores dos focos de tumor, respectivamente. O tamanho do tumor, da saúde, e a sobrevivência dos ratinhos foram monitorizados diariamente e visivelmente o tamanho do tumor medido semanalmente. Nós não tirar fotos dos tumores. Vamos considerar a tirar fotografias para os próximos experimentos. Para controlar a toxicidade de compostos, os animais foram sacrificados com cetamina /xilazina 100/10 mg /kg de peso corporal, por via intraperitoneal, e toxicidade renal e hepática medido no final da experiência.

xenoenxerto intracraniana modelo

ratinhos nus imunodef icientes fêmea (estirpe 088, Charles River Laboratories, Wilmington, MA), pesando 20-30 g, foram anestesiados por injecção intraperitoneal de cetamina-xilazina 100 mg /kg-10 mg /kg de peso corporal. linhas de células de astrocitoma humano U87-MG e CCF-STTG1 foram implantados para criar o xenoenxerto de tumor cerebral. Em resumo, a cabeça foi mantida em posição horizontal e 1 milhão de células de astrocitoma num volume de 10 uL foram injectadas lentamente para a região do putâmen caudado animais utilizando um aparelho de estereotaxia pequena. As coordenadas estereotáxicas utilizadas para os xenoenxertos são P = 0,5, L = 1,7, H = 3,8 mm. As células de astrocitoma foram injectados lentamente durante 10 minutos para evitar a elevação da pressão intracraniana ou vazamento de suspensão de células para cima através da faixa da agulha. Os animais receberam buprenorfina (0,05-0,1 mg /kg de peso corporal por via subcutânea) para dor durante e após a cirurgia. Isto foi dado a cada 8-12 horas por 24-48 horas após a cirurgia. Os animais foram submetidos a T1 ponderada ressonância magnética (MRI) duas vezes; uma vez para determinar que o tumor é estabelecido no cérebro (~ 3 semanas de injecção de células de astrocitoma) e no final da experiência. Os animais foram monitorizados diariamente e o peso corporal foi registado semanalmente. Uma vez que foi observado um tumor, os ratos (n = 12 ou 15) foram divididos aleatoriamente em dois grupos. CC-I (25 mg /kg de peso corporal) ou PBS foi injectada por via intraperitoneal uma vez por semana. A sobrevivência global dos ratos foi realizada por meio de uma curva de sobrevivência de Kaplan-Meier. Os animais foram sacrificados de acordo com método aceitável da eutanásia, tal como definido pela American Veterinary Medical Association (AVMA) Orientações sobre a eutanásia – Aprovado métodos de eutanásia de 2013. Uma vez que os animais recebem um escore de condição corporal inferior a 2, os animais foram sacrificados com cetamina /xilazina 100/10 mg /kg de peso corporal, por via intraperitoneal, bem como um método secundário de deslocamento cervical. No final da experiência, o plasma foi coletado para análise de toxicidade hepática e renal após sacrificados com cetamina /xilazina 100/10 mg /kg de peso corporal por via intraperitoneal.

T1 pesava imagens de ressonância magnética

T1 de contraste para IRM ponderada foi usada para visualizar o crescimento tumoral utilizando o sistema T7 ressonância magnética (Bruker, Biospec GmbH, Ettlingen, Alemanha). Os parâmetros de imagem da varredura T1 estão TR /TE = 540 ms /11 ms, 8 médias, 192 × 192, mm de espessura 0,5 fatia, e 3,2 cm

2 FOV. Os ratos foram anestesiados por inalação de 1-2% de isoflurano e colocado numa posição com o cérebro localizado no centro da bobina. volume do tumor intracraniano foi estimada utilizando gadolínio T1 pesava multislice axial imagens spin echo rápido. A partir dessas imagens o tamanho do tumor foi calculado usando a ferramenta Região de Interesse disponível no software Paravision (Bruker Biospec, Ettlingen, Alemanha).

toxicidade hepática e renal

O fígado e toxicidade renal (bilirrubina total, ureia no sangue de azoto (BUN), creatinina, aspartato aminotransferase (AST), alanina aminotransferase (ALT), e fosfatase alcalina) foi avaliada tanto para o modelo de tumor subcutâneo e modelo de xenoenxerto intracraniana usando um analisador químico automático (Roche Cobase MIRA) e kits fabricado pela Thermo Electron (Louisville, CO). O sangue foi obtido a partir do controle ou CC-I ratinhos injectados com células de astrocitoma ao término do experimento.

A apoptose ensaio

Para o ensaio de apoptose, a 3 × 10

6 de CCF células-STTG1 foram cultivadas durante 48 horas com várias concentrações (~36 uM) de CC-I ou actinomicina D (~ 80 nM) como um controlo positivo. As células foram colhidas após a exposição de tripsina-EDTA e lavadas em PBS frio. Em seguida, 100 ul da suspensão de células (~ 1 x 10

6 células) foi incubada com 1 mL de 100 ug /mL de iodeto de propídio corante vermelho fluorescente ácido nucleico de ligação e 5 uL de Anexina V-FITC (Molecular Probes, Carlsbad, CA) durante 15 minutos à temperatura ambiente no escuro. As células foram analisadas por citometria de fluxo (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) de emissão a 530 nm (por exemplo FL1) e 575 nm (por exemplo FL3). As células que estão vinculados por anexina V ilustram células início apoptóticos. As células que são reativos tanto para anexina V e iodeto de propídio são células necróticas.

perfil de expressão gênica

Nós usamos matriz apoptose PCR (SABiosciences, Frederick, MD) para determinar quais genes são alterados por CC -I em células resistentes CCF-STTG1 TMZ. A matriz de PCR foi realizada de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, ARN total foi extraído a partir de veículo (0,1% DMSO) ou tratados CC-I tratado linhas celulares de CCF-STTG1 usando qPCR-Grau kit de isolamento de ARN. Um? G de ARN foi utilizado para a síntese da primeira cadeia de cDNA por transcrição reversa com transcriptase reversa de MMLV. Em seguida, PCR em tempo real foi realizada com cDNA diluído e master mix com filtro de ROX. Para a detecção do sinal, o sistema 7900 Sequence Detector ABI Prism foi programado com um passo de esterilização inicial de 2 minutos a 50 ° C, seguido de 10 minutos de desnaturação a 95 ° C e em seguida 40 ciclos de 15 segundo a 95 ° C, 1 minuto a 60 ° C e 30 segundo a 72 ° C. Cada amostra de reacção foi realizada em triplicado. dados de matriz de PCR foi calculado pelo limiar ΔΔcycle (ΔΔ

Ct

) método, então normalizada contra vários genes de limpeza e expressos em média dobre mudanças no CC-I amostras tratadas em relação a amostras de controlo tratados com veículo.

análise do ciclo celular

Para a análise do ciclo celular, as células-CCF STTG1 foram cultivadas durante a noite a uma densidade de 2-5 x 10

6 células por frasco. No dia seguinte, as células foram tratadas com diferentes concentrações de CC-I no meio de cultura de células fresco. Após 24-48 horas mais tarde, as células aderentes foram colhidas e separação (1 × 10

6 células por tubo) para a lavagem com tampão de Hank, depois fixadas em gelo frio de 70% de etanol durante a noite a -20 ° C. Para a coloração de ADN dias, as células foram incubadas com iodeto de propídio (100 ug /mL) e RNase A (20 ug /ml) durante 15 min a 4 ° C (protegido da luz). As amostras foram analisadas usando BD FACS Calibur Citometria de Fluxo Analyzer.

Topoisomerase relaxamento e decatenation ensaio

DNA relaxamento e DNA do cinetoplasto ensaio decatenation (kDNA) foi realizada utilizando topoisomerase I ou II kit de despistagem de drogas ou Topopoisomerase kit de ensaio II (TopoGEN, Inc., Port Orange, FL), de acordo com as instruções do fabricante [30]. A topoisomerase IIα decatenates kDNA que consiste de redes altamente catenated de DNA circular, numa reacção dependente de ATP para produzir minicirculos individuais de ADN. Em resumo, para o ensaio kDNA decatenation topoisomerase IIα mediada, a mistura de reacção 20 uL contém os seguintes componentes; 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 150 mM de NaCl, 10 mM de MgCl

2, ditiotreitol 0,5 mM, 30 ug /mL de albumina de soro de bovino, ATP 2 mM, 260 ng de kDNA, várias concentrações de compostos, e 4 L de topoisomerase I humana IIα. A concentração final de 0,5% (v /v) de DMSO foi usado porque esta concentração não afecta a actividade da topoisomerase IIα. A incubação da mistura de ensaio foi realizada a 37 ° C durante 30 minutos e terminada pela adição de 4 mL de paragem carga de corante. Os produtos kDNA decatenation a partir da mistura de reacção foi resolvida num gel de agarose a 1% a 100 V durante 40 minutos, depois coradas com 0,5 ug /ml de brometo de etidio no tampão TAE (4 base de Tris ácido acético glacial /[0,11% (v /v)] /2 mM de na

2EDTA).

a modelagem molecular estudo

os estudos de modelação molecular foram com base na estrutura de cristal de raios-X de topoisomerase I humana IIα ligado a L-péptido de 1,50 Å de resolução (PDB código de identificação: 2q5a) [31]. A posição da L-péptido foi usado para indicar as dimensões do local de ligação CC-I para o estudo de ancoragem. Docking entre a proteína IIα topoisomerase e CC-I foi realizada utilizando o programa GLIDE (Grid Based Ligand Docking de Energetics, de Schrödinger, L.L.C.) [32], [33]. O campo de força Jorgensen OPLS-2005 foi empregue no programa de deslizamento. O ideal geometria para cada modelo de ligação foi obtida com GLIDE, que se baseia em técnicas de amostragem de Monte Carlo, juntamente com a minimização de energia. GLIDE SP (modo de precisão padrão) foi utilizado para acoplar o composto CC-I seguido por GLIDE XP (modo Precision Extra). LigPrep de Schrödinger foi usado para gerar as conformações 3D de CC-I

Análise Estatística

Todos os dados foram submetidos à análise estatística pelo aluno

t

-test quando se comparam dois grupos. Utilizou-se um ANOVA de uma via seguido pelo teste de Tukey-Kramer por mais de duas comparações de grupo para determinar se as diferenças são significativas. Para comparações de curso de tempo ou dos dados de concentração que realizada medidas repetidas ANOVA de duas vias seguido pelo teste de Tukey-Kramer. As diferenças entre as médias são consideradas estatisticamente significativas quando o

valor p

é inferior a 0,05. A LC

50 (50% da concentração letal) dos compostos foi determinada usando o software de estatística (GraphPad Prism 6) como um indicador geral da toxicidade do produto químico. Na

in vivo

modelo de tumor cerebral, os dados do volume do tumor foi resumido como os valores médios com erros padrão. A sobrevivência ratos foi comparada entre os grupos usando análise de sobrevivência de Kaplan-Meier com o teste logrank.

Resultados

A identificação de uma substância citotóxica contra células de astrocitoma resistentes TMZ

A nossa abordagem de triagem identificado um análogo do ácido tiobarbitúrico e determinado o tag de composto quimiotipo-I (CC-i) identificação. A estrutura do CC-I é mostrado na Figura 1A. CC-I foi citotóxico para ambos o resistente TMZ linhas de células de astrocitoma humano CCF-STTG1 e SW1088 TMZ-sensível (Figura 1B). A LC

50 de CC-I a SW1088, as linhas celulares de CCF-STTG1 U87-MG e é 13,6 uM, 23,6 uM e 25,4 uM, respectivamente.

(a) a estrutura do CC-I. (B) citotoxicidade do CC-I em

in vitro

. linhas de células de astrocitoma humano foram cultivadas com diferentes doses de CC-I durante 3 dias e, em seguida, a citotoxicidade foi determinada pelo ensaio de SRB. A LC

50 de CC-I para SW1088 linhas celulares (13,6 uM) são significativamente diferentes com a LC

50 de CC-I para U87-MG e linhas de células-STTG1 CCF (23,6 mM e 25,4 mM) ( p . 0.001)

toxicidade aguda da CC-I em ratos nus

As injecções de CC-me uma vez por semana em 50 ou 75 mg /kg de peso corporal foram letais dentro de 7 dias. Uma vez por semana a injecção de 35 mg /kg de peso corporal foi tolerada. Portanto, nós utilizamos aproximadamente 70% da dose tolerada (25 mg /kg de peso corporal) da concentração de CC-I para o

in vivo

estudo modelo de tumor.

Efeito

Anti-tumoral de CC -I no modelo de tumor do rato subcutânea

Para estabelecer o efeito anti-tumoral de CC-I em células de astrocitoma, utilizou-se o modelo de tumor subcutâneo do rato nu imunodeficientes injectados quer com SW1088 TMZ sensível ou resistente CCF-STTG1 TMZ linhas de celular. Os ratinhos com tumores da linhagem celular de CCF-STTG1 não mostraram nenhuma evidência de progressão tumoral após injecções CC-I, mesmo após as injecções terminou (Figura 2A), enquanto que no grupo de controlo não tratado o volume tumoral aumentou dramaticamente ao longo de 7 semanas (p 0,0001) . Os tumores em ratinhos a partir da linha celular SW1088 também não progrediu durante o período de injecção, mas o tumor progrediu quando as injecções CC-I foram interrompidas (Figura 2A). Nós não tirar fotos dos tumores. Vamos considerar a tirar fotografias para os próximos experimentos. O peso do corpo para o controle ou CC-I ratos tratados não diminuiu durante o curso do estudo (Figura 2B).

Mice (A) foram implantados com dez milhões de células com o SW1088 ou células CCF-STTG1. O tamanho do tumor inicial para as células CCF-STTG1 variou de 80-100 mm

3. As células SW1088 cresceu mais lentamente, de modo CC-I o tratamento foi iniciado quando os tumores atingiram 30 mm

3. CC-I foi injectado por via intraperitoneal com uma concentração de 25 mg /kg de peso corporal, uma vez por semana durante 7 semanas (n = 7~10). O grupo de controlo foi dado PBS no mesmo volume e regime (n = 3-8). O tumor lentamente reoccurred na SW1088 astrocitoma TMZ-sensível injetaram em ratos nus, mas não reaparecer no TMZ resistentes CCF-STTG1 injetaram em ratos nu quando CC-I foi descontinuada (além de 7 semanas). CC-I inibiu o crescimento do tumor e não era letal em qualquer dos grupos de tratamento. Algumas barras de erro são demasiado pequena para ser visível. (B) Média do peso corporal de ratos é apresentada em gramas. Algumas barras de erro são pequenas demais para ser visível.

O efeito anti-tumoral de CC-I no tumor cerebral intracraniana modelo

Depois de estabelecer a

in vivo

eficácia e segurança de CC-I contra ambas as linhas de células sensíveis e resistentes TMZ no modelo de tumor cerebral por via subcutânea, examinou-se o modelo de tumor de xenoenxerto de cérebro intracraniana. células de astrocitoma U87-MG ou CCF-STTG1 foram injectados no cérebro do rato e os tumores (verificado por ressonância magnética) formada ~ 3 semanas após a implantação (Figura 3A). Nenhum dos ratinhos de controlo não tratados sobreviveram mais de 30 dias, e a sobrevivência média foi de 20 dias. Se os ratinhos eram tratados com CC-I, no entanto, 64% (7/11) do tumor U87-MG rolamento ratinhos ainda estavam vivos no dia 60 e 89% (8/9) do tumor CCF-STTG1 ratinhos portadores eram ainda vivem em 60 dias (p 0,0001) (Figura 3B) e nenhum tumor era visível na ressonância magnética (Figura 3A). Cinco ratinhos no grupo de tumores U87-MG e seis no grupo de tumores CCF-STTG1 receberam injecções CC-I estavam vivos 200 dias após a injecção do tumor (137 dias após a última injecção CC-I). Tal como acontece com o modelo de tumor sistémica, não havia qualquer indicação de toxicidade hepática ou renal de CC-I em ratos de xenoenxertos intracranianos (Figura 3C). O peso corporal dos animais não diminuiu nos animais que receberam CC-I (Figura 3D).

imagens (A) Representante de ressonância magnética tomado com T1 MRI contraste (sistema de imagem 7T MR) após a formação do tumor intracraniano (um-três semanas pós-implantação de células de astrocitoma) ou depois da formação do tumor, seguido por injecção de CC-I (25 mg /kg de peso corporal) durante 7 semanas. CC-I de crescimento do tumor inibido completamente em ambas as linhas de células de astrocitoma. gráfico de sobrevivência (B) de Kaplan-Meier de ratinhos com tumor cerebral intracranial após a administração de CC-I. CC-I aumenta a sobrevivência dos ratos quando comparada com os ratinhos não tratados (n = 9 ou 11) (p 0,0001). Nenhum dos ratinhos que receberam PBS (controlo) sobreviveu após 30 dias e a sobrevivência mediana de todos os animais foi de 20 dias (n = 3 ou 4). (C) fígado e rim toxicidade do CC-I. A toxicidade hepática e renal (bilirrubina total, uréia (BUN), creatinina, aspartato aminotransferase (AST), alanina aminotransferase (ALT) e fosfatase alcalina) foram determinados utilizando uma máquina automatizada analisador químico (Roche Cobase MIRA) e kits fabricados pela Thermo Electron. Estes dados indicam que não há hepática ou toxicidade renal por CC-I em ratinhos nus. Dados de toxicidade exibida como médias ± SEM. (D) Média de peso corporal de ratos em gramas.

apoptose das CC-I nas células astrocitoma resistentes TMZ

Em seguida, perguntou se a morte celular por CC-I do células astrocitoma resistentes CCF-STTG1 TMZ é mediada através de uma via apoptótica. CC-I induzida apoptose de um modo dependente da dose em linhas celulares de CCF-STTG1 (Figura 4A). A quantidade de morte celular por apoptose CCF-STTG1 a 36 pM foi comparável ao indutor de apoptose controlo positivo, actinomicina D. Há evidências de morte celular por necrose em CCF-STTG1 após exposição a CC-I, mas poucas células foram marcadas com significância não conseguido até duas vezes a concentração para a qual a apoptose foi observada pela primeira vez (Figura 4B).

a morte celular foi monitorizada com marcadores de células apoptóticas e necróticas após 48 horas de exposição CC-I em células de CCF-STTG1. A morte celular foi determinada com o recombinante anexina V conjugada com f luoresceina, seguida por análise de citometria de fluxo. A morte celular apoptótica é mostrado no painel A. Painel B é a morte celular por necrose. Actinomicina D foi utilizado como um controlo positivo para induzir a morte celular por apoptose. A percentagem de células apoptóticas após o tratamento CC-I foi aumentada de uma maneira dependente da dose em células CCF-STTG1. Não houve um aumento dependente da dose pronunciados na morte celular por necrose nas células CCF-STTG1 até que a concentração mais elevada. Dados avaliada usando Student

t

teste e exibido como meios ± SEM. Algumas barras de erro são demasiado pequena para ser visível. Os símbolos indicam uma diferença significativa em comparação com o controlo. (*** P 0,001)

array gene apoptose no CC-me trataram células resistentes CCF-STTG1 TMZ

Para determinar qual via apoptótica foi ativado pelo CC-I tratamento. , foi realizada perfis de expressão gênica usando matrizes direcionados para a apoptose. A apoptose Microarray humano revelou que o factor de necrose tumoral (TNF) genes de vias tem as maiores alterações na expressão de genes no CC-I tratado células em comparação com as células tratados com veículo. CC-I (36 | iM) aumentaram TNF membro da superfamília 1, 2, 5, 6, e 9, bem como de receptores de TNF superfamília 5, 9, 10-A entre 30 e 700 vezes. Entre os genes de vias de caspase, apenas a caspase 10 e caspase 14 foram induzidas. A proporção de dobragem dos genes alterados está resumida na Tabela 1.

Efeito do CC-I sobre o ciclo celular de células de astrocitoma resistente

TMZ

Para compreender melhor o efeito citotóxico de CC -I, foi realizada uma análise do ciclo celular em células CCF-STTG1 após o tratamento CC-I. CC-I tratamento de células CCF-STTG1 resultou numa diminuição significativa na fase G0 /G1, e um aumento na fase S e G2 /M, em comparação com células não tratadas (Figura 5 A B).

as células CFC-STTG1 foram tratadas com 18 ou 36? M de CC-I durante 24 ou 48 horas. As células foram coradas com iodeto de propídio e, em seguida, analisadas para a distribuição do ciclo celular utilizando um analisador FACScan. CC-I tratamento aumentou significativamente o S e população de células G2 /M, mas diminuiu na fase G0 /G1. Os símbolos indicam uma diferença significativa em comparação com o controlo. (* P 0,05; ** p 0,01; *** p 0,001).

inibição da topoisomerase IIα pelo CC-I

Nós determinado se CC-I pode vincular IIα topoisomerase I humana num estudo de modelação molecular. Os dados de modelação molecular entre topoisomerase I humana IIα e CC-I sugerem que CC-I se encaixa na cavidade de IIα topoisomerase I humana em que poderia funcionar como um inibidor (Figura 6A). Por conseguinte, foram realizados ensaios de ADN relaxamento e decatenation kDNA para determinar a capacidade de CC-I para inibir a actividade da enzima topoisomerase IIα. CC-I inibiu a actividade da topoisomerase IIα de uma forma dependente da dose. Em concentrações superiores a 23 uM, CC-I inibiu a topoisomerase IIα catalisada kDNA decatenation (Figura 6B). O etoposido (VP16), um conhecido inibidor da topoisomerase II, topoisomerase IIα inibida a 1 mM, mas não a uma concentração de 0,1 mM (Figura 6B). Em seguida, determinou-se a CC-I é um inibidor específico da topoisomerase IIα utilizando um ensaio de ADN super-enrolado relaxamento. CC-I não aumentou a topoisomerase relaxamento mediado-I de DNA pHOT1 supercoiled (Figura 6C). A camptotecina, um inibidor da topoisomerase I, foi utilizado como um controlo positivo para o ensaio e mostraram a inibição esperada da topoisomerase I mediada relaxamento do ADN. Em contraste, CC-I apresentaram um efeito inibidor forte sobre o relaxamento da topoisomerase IIα-mediada de ADN super-enrolado pHOT1 (Figura 6D). A concentração eficaz de CC-I na topoisomerase IIα DNA mediada relaxamento foi visto pela primeira vez em 11? M.

(A) Estrutura do CC-I ancorado em topoisomerase IIα (1ZXM código PDB). Topoisomerase é mostrado como a fita de cor castanha com resíduos no local de ligação.