Abstract

Várias atividades são atribuídas ao fator de necrose tumoral de citocinas (TNF) na saúde e na doença. Em particular, o TNF foi mostrada para afectar a carcinogénese em vários modos. Esta citocina actua através da activação de dois receptores de superfície celular, TNFR1, que está associada com a inflamação, e TNFR2, que foi mostrado para provocar a sinalização anti-inflamatória. Foram avaliados os efeitos de TNF e seus dois receptores na progressão do câncer de pâncreas em

in vivo

imagem de bioluminescência em um modelo ortotópico singênico rato tumor com células Panc02. Camundongos deficientes para TNFR1 não foram capazes de rejeitar espontaneamente tumores Panc02 e, além disso exibido progressão tumoral melhorada. Em contraste, uma fracção de tipo selvagem (37,5%), o TNF deficiente (12,5%), e murganhos deficientes em TNFR2 (22,2%) foram capazes de rejeitar totalmente o tumor no prazo de duas semanas. tumores pancreáticos em ratinhos deficientes TNFR1 mostraram aumento da densidade vascular, uma melhor infiltração de células CD4 +

T e CD4

+ forkhead caixa de P3 (FoxP3)

+ células T reguladoras (T

reg), mas reduziu os números de CD8

células + T. Estas alterações foram ainda acompanhada por sobre-regulação transcricional de IL4. Assim, o TNF e TNFR1 são necessários em carcinoma ductal do pâncreas óptima para assegurar CD8

+ T mediada por células de tumor e imunovigilância rejeição. A administração exógena de FNT sistémica humana, no entanto, que só interage com TNFR1 murino, acelerada a progressão do tumor. Isto sugere que TNFR1 tem basicamente a capacidade do modelo Panc02 para desencadear efeitos pró e anti-tumorais, mas a disponibilidade espaço-temporal de TNF parece determinar finalmente o resultado global

Citation:. Chopra M, Lang I, Salzmann S, Pachel C, Kraus S, Bauerlein CA, et ai. (2013) Factor de Necrose Tumoral Induz Tumor Promover e efeitos anti-tumorais no cancro do pâncreas através TNFR1. PLoS ONE 8 (9): e75737. doi: 10.1371 /journal.pone.0075737

editor: Dominik Hartl, da Universidade de Tübingen, Alemanha |

Recebido: 24 Julho, 2013; Aceito: 21 de agosto de 2013; Publicação: 30 de setembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Chopra et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Interdisziplinäre Zentrum für Klinische Forschung der Universität Würzburg [concede B-149, B-233], Deutsche José Carreras Leukämie-Stiftung eV (R /06/17), o Deutsche Forschungsgemeinschaft [subvenções SFBTR 52 Z2, Wa 1025 /18-1, KFO 216 TP8, e Ma 760 /19-1] eo Else-Kröner-Fresenius-Stiftung (2010_Kolleg.52) . Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

pâncreas ductal adenocarcinoma (PDA) é uma das neoplasias mais devastadores com as taxas de sobrevivência de 5 anos excepcionalmente pobres e opções terapêuticas muito limitadas [1] – [3]. Várias vias de sinalização são perturbadas no cancro pancreático e isto não só afecta as células do tumor directamente, mas também se aplica para as células estromais dentro e à volta do tumor [4] – [6]. Especialmente a sinalização de NF-kB é comumente desregulado no PDA [7] – [9]. Um importante activador de NF-kB é o factor de necrose tumoral citocina (TNF), que é produzida principalmente por células imunitárias activadas, especialmente macrófagos e células T, mas também pode ser expressa por células tumorais [10], [11].

TNF é uma proteína do tipo trimérico transmembranar II a partir do qual uma forma solúvel é liberado pelo processamento proteolítico. As duas formas de TNF interagem com dois receptores de TNFR1, TNFR2 e, mas diferem na sua capacidade para activar estes receptores. TNF ligada à membrana ativa fortemente ambos os receptores, enquanto TNF solúvel, apesar de se ligar a TNFR2, só ativa TNFR1 adequadamente [12]. Enquanto TNFR1 é um típico representante do subgrupo contendo o domínio de morte da família de proteínas de receptores de TNF, TNFR2 pertence ao subgrupo-interagindo TRAF. Mesmo apesar de ter um domínio de morte, TNFR1, em resposta ao TNF inicia principalmente as vias de sinalização pró-inflamatórias que conduzem à activação de factores de transcrição NF-kB e várias cinases MAP, mas normalmente não na indução de morte celular. É evidente a partir da análise de ratinhos knockout TNFR1 e TNFR2 que muitos processos imunorreguladores são controlados pelos dois receptores de TNF num antagonista, aditivo ou mesmo maneira sinérgica, mas também há evidências de funções autónomas de cada um dos dois receptores [11], [13]. Em particular, TNFR2 foi mostrado para jogar um papel importante na homeostase de células T reguladoras imunossupressores (t

regs) [14] – [16].

No câncer pancreático TNF desempenha um complexo ainda até agora papel pouco compreendido [17] – [23]. Aqui, nós discutimos como TNF e seus receptores impactar o controle imunológico de PDA em um modelo de camundongo ortotópico singênico. Perda de TNFR1 dentro do hospedeiro revogada controlo tumoral e resultou no crescimento do tumor. deficiência de TNFR1 causada desregulamentação da infiltração de células T e ativação. Propomos um papel anti-tumorigénica novela de acolhimento TNFR1 no PDA onde TNF-TNFR-interações regular a homeostase de ambas as células T reguladoras e citotóxicos decidir se PDA é controlado e acabou por ser rejeitada ou cresce progressivamente.

Materiais e Métodos

Ética Declaração

Todos os experimentos foram realizados de acordo com a legislação alemã para a experimentação animal. O estudo foi aprovado pelo Regierung von Unterfranken como autoridade responsável (Permissão Número 55.2-2531.01-76 /10). Todos cirurgia foi realizada sob anestesia esketamine /xilazina, e todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento.

Animais

C57BL /6 deficientes para TNF (B6.129S-TNF

tm1Gkl /J , short B6.TNF KO), TNFR1 (C57BL /6-TNFRSF1A

tm1Imx /J, short B6.TNFR1 KO), TNFR2 (B6.129S7-Tnfrsf1b

tm1Imx /J, short B6.TNFR2 KO), TNFR1R2 (B6.129S-TNFRSF1A

tm1ImxTnfrsf1b

tm1Imx /J, short B6.TNFR1R2 KO) foram inicialmente obtidos de Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME, EUA) e retrocruzado ao albino C57BL /6 fundo (C57BL /6J-Tyr camundongos c-2J, Jackson Laboratories) para melhor

in vivo

sensibilidade imagem de bioluminescência (reduzida absorção de luz devido à falta de melanina na pele), como descrito anteriormente [16]. Genótipos de camundongos KO foram rotineiramente verificada por PCR. ratinhos fêmea foram utilizados para experiências de entre 8 e 12 semanas de idade. Todos os ratos foram criados dentro do biotério livre de organismos patogénicos especificados do Centro de Medicina Experimental Molecular do Hospital Universitário, Würzburg receber ração para roedores e autoclavado beber água ad libitum.

Cultura de Células

Para transdução lentiviral de células Panc02 [24], 293 células T foram transfectadas transitoriamente com um protocolo de precipitação com fosfato de cálcio padrão em placas de 10 cm com 10 ug pMDL e 5 ug plasmídeos de empacotamento de RSV-Rev, 6 ug de VSV /L plasmídeo envelope e 20 ^ g de o eGFP e vaga-lume luciferase FUGLW plasmídeo. Dois dias mais tarde, o sobrenadante contendo as partículas lentivirais foi aspirado, filtrada através de um filtro de 0,45 mícrons, foram adicionados 8 ug de polibreno /ml e a mistura foi usada para transduzir as células de tumor. As células transduzidas foram fluxo ordenado duas vezes para eGFP-expressão, denominado a seguir Panc02-FUGLW. As células foram mantidas em meio de Dulbecco modificado de Eagle (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS), 1% de antibióticos (penicilina, estreptomicina), L-glutamina e 0,1% β-mercaptoetanol. As células foram tripsinizadas e passadas duas vezes por semana. meio de cultura de células e suplementos foram obtidos de Invitrogen (Darmstadt, Alemanha), todos os utensílios de plástico a partir de Greiner foi BioOne (Frickenhausen, Alemanha). células Panc02-FUGLW são singeneicos para ratinhos C57BL /6.

ortotópico PDA Modelo In Vivo e bioluminescência de imagem

células

Panc02-FUGLW foram tripsinizadas, recolhidas e lavadas duas vezes com PBS. Os ratinhos receptores foram anestesiados com injecção i.p. injecção de 80 mg /kg de peso corporal (pc) de cloridrato esketamine (Pfizer, Berlim, Alemanha) e 16 mg /kg de peso corporal de xilazina (CP Pharma, Burgdorf, Alemanha) e colocados sobre uma placa de aquecimento de 37 ° C. células Panc02-FUGLW ortotopicamente foram injectados como descrito noutro local [17], [25] com ligeiras modificações. Resumidamente, a cavidade abdominal foi aberta por uma laparotomia mínima transversal invasiva. A cabeça do pâncreas foi identificado e exteriorizado. 1 × 10

4 células Panc02-FUGLW viáveis ​​foram lentamente injetada em 30 mL PBS na cabeça do pâncreas usando um 710 RN 100 ul Hamilton seringa com uma calibre 28, 10 mm, Estilo do ponto 4 da agulha (Hamilton Seringa, Bonaduz , Suíça). O pâncreas foi colocado de volta na cavidade abdominal e peritônio ea pele foram fechados através da execução de uma única camada de 6-0 poliglactina (Johnson Johnson, Norderstedt, Alemanha).

Para o tratamento TNF, ratos foram injectados IP com 5 ug de TNF humano em 200 ul de PBS a cada dois dias a partir do dia da inoculação das células tumorais. Para

in vivo

bioluminescência imagem [26], os ratinhos foram anestesiados e co-injectados com 300 mg /kg de peso corporal D-luciferina (Biosynth, Staad, Suíça). Dez minutos mais tarde, os sinais de bioluminescência dos ratos anestesiados foram avaliados com um sistema de imagem IVIS Spectrum (Caliper Life Sciences, Mainz, Alemanha). Fotos foram tiradas a partir da visão lateral em modo automático, com um tempo máximo de exposição de cinco minutos por imagem. As fotografias foram avaliadas utilizando Imagem Viver software 4.0 (Caliper Life Sciences).

Ex vivo

imagem

No dia 23 ou 30 após a inoculação de células tumorais, os ratos foram injetados com D -luciferin e 10 minutos mais tarde sacrificados. Os órgãos internos foram removidos e submetidos a

ex vivo

bioluminescência imagiologia [26]. As amostras de tecido foram embebidas em Tissue Tek outubro (Sakura Finetek, Staufen, Alemanha), para posterior análise histológica.

Isolamento de Células imunes derivadas de tecido pancreático e os baços

Os tecidos foram picadas com uma lâmina cirúrgica e digeridos durante 45 minutos a 37 ° C com 2 mg /ml de colagenase D e 0,1 mg /ml de DNase I (ambos a partir de Roche, Mannheim, Alemanha). pedaços de tecido foram trituradas através de um filtro de células 70 mm e girou para baixo. O sedimento de células foi ressuspenso em tampão de lise de eritrócitos (168 mM NH

4Cl, KHCO 10 mM

3, ácido etilenodiaminotetra-acético 0,1 mM (EDTA)) e incubou-se durante 2 minutos. Em seguida, foram adicionados 10 volumes de PBS e as células foram centrifugadas novamente. O sedimento resultante foi ressuspenso em PBS e as células foram usadas para citometria de fluxo. Os baços foram removidos por filtração directamente através de um filtro de 70 | iM de células em tampão de lise de eritrócitos e lavadas uma vez com PBS.

Microscopia de imunofluorescência

Cryo-tecidos embebidos foram cortadas em 3 mm de espessura em um criostato Leica CM1900 (Leica Microsystems, Wetzlar, Alemanha) e montadas em lâminas de fosco. As lâminas foram fixadas com acetona e à temperatura ambiente durante 7 minutos, secou-se ao ar. As lâminas foram lavadas e bloqueadas com 2% de FBS em PBS durante 15 minutos. Quando foram utilizados anticorpos de biotina-conjugado, foi efectuado o bloqueio adicional usando um kit de Bloqueio de avidina /biotina (Vector Laboratories, Burlingame, CA, EUA). As lâminas foram então incubadas com os anticorpos apropriados durante 1 hora à temperatura ambiente. Entre o anticorpo-incubações, as lâminas foram lavadas três vezes com PBS. As lâminas foram contrastadas com DAPI e montadas com meio de montagem (Vector Laboratories). Os anticorpos utilizados foram: CD11b-Alexa 647 (M1 /70), CD31-Biotina (MEC13.3), CD4-Alexa 647 (GK1.5), CD8-Biotina (53-6,7), Foxp3-purificado (FJK-16) (eBioscience), burro anti-rato Cy3-(Dianova, Hamburgo, Alemanha), F4 /80-Alexa 488 (CI: A3-1), GR-1-Biotina (RB6-8C5), estreptavidina-Alexa 546 (Invitrogen ). As imagens foram obtidas com um microscópio de fluorescência Zeiss Imager.Z1m (Carl Zeiss, Gottingen, Alemanha) e avaliados utilizando o software AxioVision Zeiss (Carl Zeiss). Células imunes foram contadas e determinada como células /mm

2 ou como pixels /150 000? M

2 tal como avaliado pelo programa Image J (NIH, Bethesda, MD).

Citometria de Fluxo

As células foram bloqueadas com soro normal de rato (1:20 em PBS) e coradas com anticorpos apropriados a 4 ° C durante 30 min. Após coloração com o antigénio de superfície, as células foram lavadas uma vez com PBS e marcadas com iodeto de propídio. Para a coloração intracelular, as células foram coradas com o Live /Dead solucionáveis ​​kit mancha de células mortas violeta (Invitrogen) e processados ​​usando o mouse coloração de células T reguladoras kit # 2 (eBioscience, Frankfurt, Alemanha) de acordo com o protocolo do fabricante. Os anticorpos utilizados foram a partir BioLegend (Uithoorn, Holanda) se não for indicado de outro modo: α4β7-PE (DATK32), CCR4-APC (2G12), CCR5-PE (C34-3448), CCR7-APC (4B12), CD102-Biotina ( 3C4 (MIC2 /4)), azul CD103-Pacífico (2E7), CD106-Alexa 488 (429), CD107a-FITC (1D4B), CD107b-Alexa 647 (M3184), CD11a-PE (M17 /4) (BD) , CD11b-Alexa 647 (M1 /70), CD11b-PE /Cy7 (M1 /70), CD11c-Alexa 647 (N418), CD25-PE (PC61.5) (eBioscience), CD24-PE (LG.7F9) (eBioscience), CD29-PE (HMβ1-1), CD4-FITC (RM4-5) (eBioscience), CD4-APC (RM4-5), CD44-PE (IM7), CD45.1-PE (A20), CD45.2-APC (104), CD49d-Alexa 647 (RI-2), CD49f-Alexa 488 (GoH3), CD54-PE (YN1 /1.7.4), CD62E-PE (10E9.6) (BD), CD62L-APC /Cy7 (MEL-14), CD69-Pacific Blue (H1.2F3), CD8-PE /Cy7 (53-6,7), CXCR3-APC (CXCR3-173), CXCR4-Alexa 488 (2B11) (eBioscience ), proteína de fusão de e-selectina de IgG (R D Systems, Wiesbaden, Alemanha), F4 /80-Alexa 488 (C1: A3-1), Foxp3-APC (FJK-16) (eBioscience), Ly6G-PE (1A8 ) (BD), proteína de fusão P-selectina IgG (BD), TNFR1-APC (55R-286), TNFR2-PE (TR75-89), cabra anti-humana IgG-PE (Jackson), estreptavidina-Alexa 546 ( Invitrogen). Todos os experimentos foram realizados em um BD FACS Canto II (BD) e dados da amostra gravada utilizando software BD FACSDiva e analisados ​​utilizando software FlowJo (árvore da estrela, Ashland, OR, EUA).

Isolamento de RNA, transcrição reversa e qRT -PCR

O ARN foi isolado a partir de amostras de tecido utilizando Qiashredder e RNeasy mini-colunas de spin kit (Qiagen, Hilden, Alemanha). 1 ug ARN total foi transcrito de forma inversa utilizando o Kit de Transcrição Reversa QuantiTect (Qiagen). Expressão de genes de interesse (sequências dos iniciadores pode ser encontrada na Tabela 1) foi analisada num termociclador iCycler (Bio-Rad, Munique, Alemanha) utilizando um Universal iTaq SYBR Green Supermix (Bio-Rad) e β-actina como gene de referência. Os níveis de expressão foram calculados utilizando o

método ΔΔC T.

In vitro

TNF Tratamento e avaliação das capacidades metastáticos

1 × 10

5 Panc02 células por poço foram semeadas em placas de 6 cavidades e deixados durante a noite. As células foram tratadas com 1,67 nM de FNT humano ou 1,67 nM de murino de TNF durante 48 horas, colhidas por raspagem suave da monocamada de fora da superfície de plástico, lavadas duas vezes com PBS e avaliadas quanto à expressão de moléculas de adesão e os receptores de quimiocina por citometria de fluxo.

para testar a capacidade das células Panc02 para anexar a diferentes componentes da matriz extracelular, o CytoSelect de 48 poços de Adesão celular Ensaio (Cell Biolabs, San Diego, CA, EUA) foi utilizado de acordo com as instruções do fabricante. Para testar a capacidade das células para invadir Panc02 a membrana basal, o CytoSelect 24 poços celular Invasão Ensaio (Cell Biolabs) foi utilizado de acordo com as instruções do fabricante.

Panc02 células não tratadas e tratadas com TNF foram ainda avaliadas para a actividade de metaloproteinases de matriz MMP-2 e MMP-9, por zimografia em gelatina. Para o isolamento de proteínas, tecido do miocárdio do coração de um rato com enfarte, bem como os sedimentos celulares Panc02-FUGLW foram homogeneizados com tampão RIPA e PMSF (Cell Signaling, Frankfurt, Alemanha). As amostras foram separadas num gel de poliacrilamida a 10% contendo 2,5 mg /ml de gelatina a uma voltagem constante de 120 V durante 2 h a 4 ° C. Após a electroforese, as proteínas foram renaturated por incubação dos geles em 2,5% de Triton X-100 durante 90 min à temperatura ambiente. Os géis foram então incubadas em tampão de activação (50 mM de Tris-HCl, pH 7,5, 5 mM de CaCl2, 0,2 M de NaCl, e 0,02% de Brij-35) durante 12 h a 37 ° C. Finalmente, os géis foram corados durante 1 hora com solução de coloração de azul de Coomassie a 0,5% e em seguida descoradas em 40% v /v de metanol, 10% v de ácido acético /v para revelar bandas de compensação que indicam actividade proteolítica. A intensidade da banda foi quantificada usando ImageJ (Versão 1.44p)

Estatísticas

Todos os gráficos mostrados são dados de pelo menos duas experiências independentes combinados.; o número de animais está indicado nas legendas das figuras. Todos os dados são apresentados como média ± erro padrão da média. As figuras foram preparadas utilizando o software GraphPad Prism 5 (La Jolla, CA, EUA) e Adobe Photoshop 7 (San José, CA, EUA). Todos os grupos foram comparados com o tipo selvagem ou um grupo de controlo não tratado, respectivamente pelo teste t bicaudal de Student não pareado usando GraphPad InStat 3 software. Dados atingindo significância estatística são indicados como: * p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01

Resultados

Perda de anfitrião TNFR1 revoga A rejeição espontânea de Ortotópico Panc02 Tumores

Na. para acompanhar o crescimento do tumor não-invasiva em um modelo de camundongo singênico de PDA, geramos células Panc02 expressando eGFP e luciferase de pirilampo (Panc02-FUGLW) e injetou 1 × 10

4 destas células tumorais ortotopicamente em tipo selvagem albino C57BL /6 e ratinhos Albino C57Bl 6 ratinhos /deficientes em FNT, TNFR1, TNFR2 ou ambos os TNFR. Em todos os genótipos avaliados, tumores Panc02-FUGLW inicialmente cresceu durante os primeiros 7 dias após a inoculação do tumor (Figura 1A e B). 3/8 ratinhos B6 tipo selvagem, 1/8 ratos B6.TNF KO e 2/9 ratos B6.TNFR2 KO espontaneamente rejeitou o tumor no prazo de 14 dias. Em contraste 13/13 camundongos deficientes para TNFR1 ou TNFR1 e TNFR2 não podia rejeitar o tumor.

In vivo

BLI (Figura 1A e B) e

ex vivo

BLI um mês após a inoculação do tumor (Figura 1C e D) também revelou a carga do tumor significativamente mais elevada em ratinhos deficientes para TNFR1 (ou TNFR1 e TNFR2) do que em ratinhos de tipo selvagem. Assim, TNFR1 apareceu como um fator importante para o controle e rejeição de tumores Panc02.

Murino adenocarcinoma ductal pancreático células (Panc02) foram transduzidas para expressar de forma estável eGFP e luciferase de pirilampo e 10

4 células tumorais foram injectadas ortotopicamente em albinos camundongos C57BL /6. O crescimento do tumor em ratinhos de tipo selvagem (B6.WT) e ratos que eram deficientes para o TNF ou de seus receptores foi determinada por

in vivo

BLI. A: O crescimento do tumor exibido como radiância total (B6.WT n = 8, B6.TNF KO n = 8, B6.TNFR1 KO n = 6, B6.TNFR2 KO n = 9, B6.TNFR1R2 KO n = 7). B: imagens exemplificativas do curso de tempo de imagem de um rato que espontaneamente rejeitou o tumor (esquerda) e um rato que não podia controlar a progressão do tumor (direita). C:

Ex vivo

imagem de um mês após a inoculação de células tumorais. Os órgãos internos foram fotografadas para a presença de células tumorais. imagens exemplificativas de um rato que espontaneamente rejeitou o tumor (I), um rato com baixa carga tumoral (II), e um rato com elevada carga tumoral (III). D: o tamanho do tumor do pâncreas, um mês após a inoculação Panc02 é exibido como radiância total (B6.WT n = 8, B6.TNF KO n = 8, B6.TNFR1 KO n = 6, B6.TNFR2 KO n = 9, B6.TNFR1R2 KO n = 5). * P ≤ 0,05, ** p≤0.01. dados combinados de quatro experiências independentes.

Panc02 Tumores Mostrar Altered infiltração de células T em camundongos B6.TNFR1 KO

Em seguida, analisamos a infiltração de células imunes em tumores Panc02-FUGLW crescido em qualquer C57BL /6 de tipo selvagem ou ratinhos C57BL /6 deficientes para o TNF, TNFR1 ou TNFR2 (Figura 2 e Tabela 2) para abordar se a perda de controlo do tumor pode ser relacionada com alterações no infiltrado de células imunitárias do tumor. Perda de TNFR1 correlacionada com a diminuição do número de infiltração CD8

células + T e aumento do número de infiltrar CD4

+ Foxp3

+ T

regs. deficiência de TNFR1, além disso, aumentou significativamente a densidade vascular, avaliada pela CD31-expressão, mas não alterou significativamente a infiltração com células inatas imunes da linhagem mielóide (CD11b

+, F4 /80

+, Gr1

+ células). Os padrões de infiltração de células T alterados de tumores Panc02-FUGLW de B6.TNFR1 KO um mês após a inoculação levaram-nos a avaliar o fenótipo de células T na fase inicial de expansão tumoral. Portanto, foi analisada a expressão de marcadores de activação em células CD4

+ e CD8

+ T 7 e 15 dias após injecção de células de tumor (Figura 3). marcadores de ativação de células T única sutilmente diferente. No entanto, observou-se uma tendência para maior ativação com o tempo de CD8

células + T (expressão de CD25 e CD69) e menor ativação de CD4

+ células T (expressão CD27, CD54 e CD69). O crescimento do tumor foi fortemente associado com a inflamação mielóide. Fluxo aumento percentagens citometria reveladas de CD11b

+ e Ly6G

+ células no pâncreas ao longo do tempo independente do fundo genético de camundongos portadores de tumor. Curiosamente, a um nível sistémico, perda de TNFR1 resultou no diminuiu significativamente CD11b

+ e Ly6G números

+ das células nos baços de ratinhos portadores de tumor. crescimento do tumor aumentou em pâncreas de ratinhos KO TNFR1 foi confirmada por números significativamente elevados de células eGFP

+ Panc02-FUGLW nestes ratinhos duas semanas após a inoculação do tumor (Figura 3).

um

Panc02-tumores foram explantados mês após a inoculação de células tumorais, cortes histológicos consecutivos foram coradas para populações indicados celulares imunológico e vasos sanguíneos (CD31). tumores pancreáticos resultou um influxo de populações de células imunes do sistema imune inato e adaptativo que não foram observados em tecido de pâncreas saudável sob condições de estado estacionário. De nota, deficiência de TNFR1 resultou em uma citotóxico CD8 reduzida

+ infiltração de células T, mas aumentou T

infiltração de células reg. fotomicrografias exemplares são mostrados. A barra de escala indica 100 um.

pancreata e baços de ratinhos ingénuos e portadores de tumor uma e duas semanas após a inoculação de células de tumor foram explantados e preparados como suspensões de células individuais. As células T foram analisadas para a expressão de receptores de superfície associada à activação por citometria de fluxo. Além disso, a percentagem de t

regs, células mielóides e células tumorais foi determinada por citometria de fluxo (w /o tumor: B6.WT n = 8, B6.TNFR1 KO n = 6; d + 7: N B6.WT = 7, B6.TNFR1 KO n = 6; d + 15: B6.WT n = 7, B6.TNFR1 KO n = 7). * P ≤ 0,05, ** p≤0.01. dados combinados de quatro experiências independentes.

Para avaliar ainda mais as diferenças mecanicistas de controle do tumor entre o tipo selvagem e camundongos TNFR1 KO, avaliamos a expressão de genes imunossupressores e várias citocinas em Panc02-FUGLW tumores (Figura 4). Aqui, observou-se em um nível de transcrição aumentou significativamente a expressão da galectina-9 e IL-4 enquanto que a expressão de iNOS foi significativamente reduzida.

Panc02-tumores foram explantadas de um mês após a inoculação das células de tumor e o ARN total foi isolado a partir do tecido tumoral. O ARN foi transcrito reversamente e amplificados por qRT-PCR. Os dados são apresentados como a expressão relativa dentro de tumores derivados de ratinhos KO B6.TNFR1 em comparação com os tumores derivados de ratinhos de tipo selvagem (WT) (B6.WT n = 3, B6.TNFR1 KO n = 4). * P ≤ 0,05.

O exógena TNF não induz Metástase Apesar de reforçar o crescimento do tumor e influenciando T

reg homeostase

TNF foi mostrado para melhorar a metástase das células tumorais em vários

in vivo

modelos de ratos [27] – [29], incluindo um modelo de xenotransplante ortotópico de PDA com metástases induzida por pancreatectomia [17]. Para testar se o TNF também influencia o crescimento do tumor Panc02-FUGLW e metástase, tratámos ratinhos portadores de tumor com TNF humano recombinante, a qual só se liga a murinas TNFR1, todos os outros dias durante três semanas após a inoculação das células tumorais. Esta aumentou significativamente o crescimento global tumor dentro pancreata e ablação de rejeição de tumores espontâneos como avaliado com

in vivo

e

ex vivo

BLI (Figura 5A e B), mas não induziu a metástase para o fígado, o rins, ou o mesentério (dados não mostrados). Analisamos também a infiltração de CD8

+ e células CD4 +

T e T

regs em tumores de animais não tratados e tratados com TNF e, de fato observado que o tratamento TNF humano aumentar significativamente

Números reg T dentro dos tumores (Tabela 3). Desde que nós e outros descobriram anteriormente que TNFR2 em vez de TNFR1 em T

regs é necessária para conduzir sua expansão [14] – [16], isso aponta para um mecanismo indireto pelo qual a administração de TNF humano desencadeia T

reg expansão no nosso modelo de PDA.

10

4 células tumorais foram injectadas no baço de ratos albinos B6.WT. Os ratos foram quer deixados sem tratamento ou foram tratados todos os outros dias com 5 ug de TNF humano recombinante. O crescimento do tumor foi determinada por

in vivo

BLI. A: O crescimento do tumor exibido como radiância total (n = 11 sem tratamento, o TNF n = 10). B:

Ex vivo

imaging 23 dias após a inoculação de células tumorais. Os órgãos internos foram fotografadas para a presença de células tumorais. o tamanho do tumor do pâncreas é exibido como radiância total (n = 11 sem tratamento, o TNF n = 10). ** P≤0.01. combinou dados de dois experimentos independentes.

Células Panc02 mostram pouca In Vitro Capacidades para Metástase

Devido à actividade metastática limitado de células Panc02

In vivo

, analisamos as capacidades metastáticos dessas células

in vitro

particularmente também com a estimulação de TNF. Panc02 células aderidas às proteínas da matriz extracelular fibronectina, laminina I e fibrinogênio, mas nem ao colágeno I, nem IV. Nem o TNF humano ou murino a adesão de células Panc02 a componentes da matriz extracelular (Figura 6A) modificado, apesar da forte desencadear da via clássica do NF-kB (dados não mostrados). Em seguida, analisou-se as células Panc02 para a sua expressão de proteínas envolvidas na adesão e migração de células (Figura 6B). Descobrimos que as células tumorais de PDA para expressar CD29 (integrina β1), CD49f (integrina α6), e CD107a e b, a expressão de que não foi modulado por TNF. CD106 (VCAM-1) expressão, no entanto, foi induzida por TNF. Nós também avaliou a capacidade invasiva de células Panc02 usando um

in vitro

ensaio de invasão e medir atividades gelatinolíticas (Figura 6c). TNF não induziu significativamente a invasão e que miocárdio infartado rato mostrou MMP-9 e -2 atividades, as células Panc02 não, independentemente da estimulação TNF. Em suma, os resultados do

in vitro

análise dos factores relacionados com a metástase confirmou a atividade metastática limitada observado com células Pan02

in vivo

.

Panc02 células foram tratadas com 1,67: Adesão de diferentes proteínas da matriz extracelular (n = 4). Determinação por citometria de fluxo a expressão de proteínas envolvidas na adesão e migração (n = 3): B. C: capacidades invasivo das células Panc02. Painel esquerdo:

In vitro

invasão da membrana basal (n = 3). Painel direito: zimografia de amostras de células tumorais. Infartada lisado coração de rato foi usado como um controle positivo (n = 4).

Discussão

Aqui demonstramos que TNFR1 é um receptor importante para o controle imunológico do PDA. Perda deste receptor dentro dos resultados de acolhimento em perturbações de infiltração de células imunes para o tumor e ablates mecanismos de vigilância imunológica. No entanto, a ativação exógena de TNFR1 com TNF recombinante em animais portadores de tumor resultou na progressão tumoral melhorada, falando para um papel de dois gumes de TNF-TNFR1-interações no controle do tumor PDA.

Um estudo recente analisou antígeno T carcinogénese induzida por múltiplos estágios em ilhéus pancreáticos e descobriram que, enquanto em ratinhos de tipo selvagem CD4 infiltrantes

+ células T induzidas dormência tumor, perda de TNFR1 nestas células comutada-los a um fenótipo de promoção do tumor, estimulando a angiogénese [18]. Estas observações estão em linha com os nossos resultados, isto é, a perda de TNFR1 aumento da densidade vascular no interior dos tumores. Enquanto TNFR1-deficiência não consistentemente modificar o fenótipo de activação das células T que se infiltram no tumor, encontramos mais células CD4

+ T que se infiltram os tumores em TNFR1-deficiente do que em ratinhos de tipo selvagem. Além disso, observamos um decréscimo no número de infiltrar células CD8

+ T e aumento do número de t

regs. Chee e colaboradores descobriram a perda de TNFR1 em ratinhos NOD para protegê-los de diabetes afetando o homing de células T convencionais em ilhéus pancreáticos, enquanto o aumento do número de t

reg células [30]. No nosso modelo, a deficiência de TNFR1 resultou em alterações na expressão de IL-4, galectina-9, e iNOS. De acordo com isto, a IL-4 tem sido descrito como um potente t

H2 citocinas [31], que foi proposto para promover o crescimento de células de tumor de PDA e, assim, desempenhar um papel activo na progressão tumoral desta malignidade [32], [33 ]. Galectina-9 suprime T

funções imunes H1 [34] e induz t

registros [35]. O papel desta proteína em PDA não está bem estabelecido, no entanto, o aumento da expressão de IL-4 e galectina-9 pode sugerir para um mecanismo que explica o aumento de células CD4

+ de células T e T

reg infiltração em tumores Panc02 crescido em ratinhos deficientes em TNFR1. iNOS foi descrito para ser regulada positivamente em tumores pancreáticos [36], [37].

O papel do TNF na progressão do tumor pancreático é controversa. Embora alguns estudos demonstraram propriedades anti-tumorigénica de TNF [19], [21], outros têm mostrado resultados opostos [17], [20]. Nós demonstramos aqui uma função pró-tumorigénica de TNF sistemicamente activo como o tratamento de ratinhos portadores de tumor com esta citocina aumentou significativamente o crescimento do tumor. Isto vai junto com números elevados de T

regs dentro dos tumores. Mostrámos recentemente um mecanismo semelhante no modelo de metástase pulmonar B16F10 [16] em que o tratamento melhorado do crescimento tumoral TNF exógeno em uma T

forma dependente da Reg.

O TNF é conhecido por desempenhar um papel na promoção do cancro metástase [16] – [17], [27] – [29]. Apesar disso, não observamos aumento da metástase do tumor Panc02 primário para o fígado após tratamento TNF exógeno. Considerando PDA metastasizes facilmente em outros modelos [17], [38] e em pacientes humanos [39], [40], o tumor Panc02 não parecem ter a capacidade de metástase espontaneamente. As células tumorais mostrou muito pouca capacidade gelatinolítica e

in vitro

nem a sua invasivo nem as suas capacidades adesivas foram modulados pela estimulação de TNF.

Em resumo, propomos um papel de TNFR1 na vigilância imunológica tumor de PDA . Embora nossos dados falam por um imune mediada efeito anti-tumorigénico do TNF via TNFR1, como resultado de advertência também observamos que o tratamento exógeno de camundongos portadores de tumor com TNF aumentado o crescimento do tumor em vez de controlado-lo.