Abstract

Fundo

Fomitopsis pinicola (Sw. Ex Fr.m) Karst

(FPK), que pertence à classe dos fungos Basidiomycota é um dos mais populares fungos médicos na China. Ele tem sido usado para muitas doenças: cancro, doenças cardiovasculares, diabetes e assim por diante. No entanto, pouco estudo sobre o efeito e migração inibição pró-apoptótica de FPK extrato de clorofórmio (FPKc) tem sido relatada e o possível mecanismo envolvido não foi iluminada.

Metodologia /Principais Achados

Chemical A análise foi realizada por HPLC mostrou que o ergosterol (ES) a concentração era de 105 ug /mg. ensaio MTT revelou que FPKc poderia inibir selectivamente SW-480 a viabilidade das células com o CI

50 de 190,28 ug /ml. A cicatrização de feridas e de ensaio Transwell FPKc indicou que podia inibir a migração de células SW-480, obviamente, também poderia FPKc diminuiu dramaticamente as metaloproteinases de matriz-2, 9 (MMP-2 e MMP-9) de expressão. nuclear Hoechst 33342 mancha e fragmentação do DNA análise de anexina V-FITC /PI coloração, revelou que FPKc e ES poderia induzir SW-480 células da apoptose. O processo de apoptose intimamente envolvido na acumulação de ROS e esgotamento de GSH, ativação de caspase 3, poli (ADP-ribose) polimerase (PARP) degradação. FPKc também pode up-regular a expressão P53 e, assim, levar a parada fase G1. Quando as células SW-480 foram pré-tratados com N-acetilcisteína (NAC), a geração de ROS, a viabilidade das células e proporção de apoptose foram parcialmente diminuiu, o que indica que as ROS foi vertical no processo de pro-apoptose induzida por FPKc. Além disso, em todo o processo, ES, que tenha sido previamente encontrado em FPKc teve o efeito semelhante ao FPKc. Assim, podemos concluir que a ES, como um dos maiores componentes abundantes em FPKc, pode também ser um dos componentes ativos.

Conclusão /Significado

FPKc poderia inibir a migração de SW-480 células, induzem células SW-480 prisão fase G1 e causa apoptose efeito ROS-mediada. E ES pode ser um dos constituintes eficazes em todo o processo

Citation:. Wang Y, Cheng X, Wang P, Wang L, Fan J, Wang X, et al. (2014) Investigando Migração Inibição e apoptóticos Efeitos da

Fomitopsis pinicola

clorofórmio Extrato em colorrectal humano Câncer SW-480 Cells. PLoS ONE 9 (7): e101303. doi: 10.1371 /journal.pone.0101303

editor: Masaru Katoh, National Cancer Center, Japão

Recebido: 19 de dezembro de 2013; Aceito: 03 de junho de 2014; Publicação: 03 de julho de 2014

Direitos de autor: © 2014 Wang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Os autores não têm apoio ou financiamento para relatar

Conflito de interesses:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

O câncer colorretal (CRC) é um tumor com fleetness aumentando em todo o mundo a cada ano. A cada ano, cerca de metade dos pacientes diagnosticados estaria morto da doença [1]. CRC é considerado como o terceiro tumor maligno mais comum e a terceira causa de morte por cancro nos EUA [2]. Embora a incidência de CRC é muito mais baixa em comparação Ásia para que, nos EUA, que tem vindo a aumentar rapidamente na China [3]. Embora o tratamento tradicional para CRC incluindo cirurgia, radioterapia e quimioterapia opções atuais estão fora da eficiência e têm muitos efeitos colaterais [4]. Todos estes problemas destacam a importância de descobrir um novo agente para CRC. Como a medicina tradicional chinesa tem sido cada vez mais popular, tem sido considerado como potencial agente terapêutico devido à sua alta eficiência e segurança [4].

Fomitopsis pinicola (Sw. Ex Fr.) Karst

(FPK), que pertence à classe dos fungos Basidiomycota é um dos madeira enraizamento fungos mais comuns e amplamente distribuído em muitos países do mundo, como o Japão, Coreia, China e Suécia [5]. FPK foi tradicionalmente utilizado como uma fonte de alimento de saúde para a regulação do crescimento de plantas e a diabetes no Japão [6], [7]. FPK como um produto natural não tóxico tem sido cada vez mais atractiva para os estudiosos, e os seus extractos têm sido relatados para ter propriedades anti-inflamatórias, anti-microbianas, efeito anti-fúngica e anti-cancro [8], [9], [10]. Para efeito anticancerígeno da FPK, a pesquisa centrou-se principalmente em seu acetato de etilo e os extractos de etanol. Por exemplo, Ren L demonstrado tanto de éter e acetato de etilo extractos de gasolina FPK tem a citotoxicidade contra algumas linhas de células tumorais, tais como células HeLa e SMMC-7721 [11]. Hung-Tsung Wu de Taiwan demonstrou F. pinicola extrato etanólico tem um efeito anticancerígeno em células S180 in vitro e in vivo. Ele também prova que poderia desencadear Homo sapiens hepatoma (HepG2), cancro do pulmão (A549), o câncer colorretal (HCT-116) e câncer de mama (MDA-MB-231), as células da apoptose [12]. E para FPK extracto de clorofórmio (FPKc), há apenas um relatório para demonstrar o seu efeito anti-fúngico [10]. Para nosso melhor conhecimento, pouca informação sobre o efeito anticancerígeno de FPKc foi publicado. Portanto, o primeiro objetivo do nosso estudo foi avaliar se FPKc pode exercer o seu efeito anticancerígeno em nosso sistema experimental, em seguida, concentrar-se principalmente em investigar o efeito de inibição da migração e pró-apoptose de FPKc eo potencial mecanismos envolvidos.

Além disso, a análise química do FPK extrai, que principalmente apontar as n-hexano e metanol extractos de FPK conter alguns triterpenóides como o ergosterol, os derivados de ergosterol, triterpenos lanostane e assim por diante [13], [14]. Embora nunca foi estudada a análise química sobre FPKc. Porque ergosterol (ES, a Figura 1) foi avaliado para distribuir amplamente em vários tipos de fungos e mostrar algum efeito anticancerígeno [15], [16]. Assim, outro objetivo deste estudo foi explorar os componentes químicos da FPKc e investigar se ES funcionou quando FPKc realizado o seu efeito anticancerígeno.

Métodos e Materiais

Recolha e preparação de clorofórmio extrair

não há permissões específicas foram necessários para o local onde FPK foi recolhido e este estudo não envolvem risco ou protegidas espécies.

o fresco FPK foi coletado em julho de 2011 a partir Pingheliang, o sul de montanhas Qinling, na província de Shaanxi, China (latitude, 33 ° 27’N; longitude, 108 ° 30’E; altitude, 2.305 m). Ele foi autenticado pelo Prof. Yaping Xiao e depositados no Ministério da Educação, Laboratório Chave para Medicinal Resource Vegetal (MPR) e Natural Química Farmacêutica, Shaanxi Normal University, Xi’an, Shaanxi, República Popular da China

.

A extracto de etanol de FPK foi obtido através do método de extracção de ultra-sons e, em seguida, concentrou-se com um evaporador rotativo (ER-2000 a; pertencem, Xangai, China). Em terceiro lugar, foi seco com um liofilizador (ALPHA1-2, CHRIST, Alemanha) e, finalmente, liofilizada. O extracto de etanol foi então fraccionado por clorofórmio (CHCl

3). A fracção de clorofórmio foi homogeneizado em etanol a 70% e o sobrenadante foi filtrado utilizando filtros de 0,22 mm.

análise de HPLC

A determinação de FPKc e ES foi avaliada por meio da cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) método analítico. O sistema LC consistiu de Shimadzu LC-20AT (Shimadzu Corp., Kyoto, Japão) com uma bomba quaternária, um compartimento de colunas com termostato e software solução Shimadzu LC. Separação de fitoquímicos foi conseguida numa coluna Shim-pack VP-ODS C18 (Shimadzu, 1504,6 milímetros; 5 milímetros de tamanho de partícula). A fase móvel consistiu em acetonitrilo e água. Um programa de gradiente de eluição foi utilizado como 10-100% de acetonitrilo (v /v) em 0-80 min, 100% -85% em 80-90 min, mantendo 85% a 90-100 min. A temperatura da coluna foi mantida constante a 40 ° C, e a taxa de fluxo da fase móvel foi de 0,8 mL /min. O comprimento de onda de detecção foi de 254 nm e 20 ul de amostras foram injectadas. Re-equilíbrio duração foi de 15 min entre as execuções individuais.

As curvas de calibração

ES padrão foi trazido Sima, Tianjin, China. A pureza foi mostrado para ser maior do que 98%. As curvas de calibração foram construídos com diluições de 2000, 1000, 500, 250, 125 ug /ml em metanol. Um volume de 20 ul foi injectado por triplicado e de curvas de calibração foram baseadas nas áreas de pico médio de cada cromatograma. As curvas de calibração mostraram um R

2 de 0,993 para ES.

cultura celular

O SW-480, SW-620, Caco-2 e células HEK-293 foram comprados a partir do banco de células da Academia chinesa de Ciências, Xangai, China. O SW-480, SW-620 células Caco-2 e células HEK-293 linhas de células foram cultivadas em meio RPMI-1640, L-15 e meio DMEM, respectivamente. Todos eles foram cultivadas com 10% de soro fetal de bovino (FBS), 1% de penicilina-estreptomicina (/ml de penicilina e 100 ug /ml de estreptomicina 100 U) e 1% de glutamina em 100 cm

2 frascos de cultura de tecido sob um humidificada 5% de CO

2 e 95% de ar a 37 ° C.

a viabilidade celular

Para avaliar o efeito de FPKc em SW-480, SW-620 e células Caco-2 de células viabilidade, as células foram semeadas em placas de 96 poços (5 x 10

4, 1 × 10

5 e 1 × 10

5). Várias concentrações de FPKc foram usadas em SW-480 (120, 160, 200, 240 ug /ml, 70% de etanol foi usado como o controlo de solvente) e SW-620 (40, 80, 120, 160, 200, 240 ug /ml) e Caco-2 (40, 80, 120, 160, 200, 240, 280 ug /ml) células. Diferentes doses de ES (0, 12, 24 ug /ml; etanol a 100%) foram adicionados em células SW-480. Depois que todas as células foram incubadas durante 48 e 72 h, respectivamente. Rim embrionário humano

293

(HEK-293) As células foram utilizadas como células normais por contraste para avaliar a actividade anti-cancro citotóxica de FPKc. A viabilidade das quatro linhas celulares foi determinada usando ensaio de MTT [17]. A absorvância a 570 nm foi registada usando um leitor de microplacas (Bio-Tek ELX800, EUA). A viabilidade das células de ES FPKc e amostras tratadas foi então obtido por meio da comparação com o controlo. (Toda a concentração mencionado neste artigo refere-se ao peso seco).

celular motilidade

motilidade celular foi avaliada pela ferida zero e ensaio transpoço. Para o ensaio de zero ferida: As células SW-480 foram plaqueadas em placas de 24 poços durante 24 h, em seguida as células em poços individuais foram feridos por raspagem com uma ponta de pipeta e as células foram incubadas com a concentração indicada de FPKc e ES para 12 e 24 h. As células foram fotografadas por microscopia de contraste de fase (200 × de ampliação).

Para o ensaio Transwell, 5 × 10

5 as células foram semeadas em câmara de topo com meio isento de soro contendo 0,3% de BSA e médio contendo soro a 10% foi adicionada à câmara inferior da câmara de Corning (filtro de policarbonato com inserções de tamanho de poro de 8 mm, Corning Pharmingen, San Diego, CA). Após incubação durante 36 h, mudou-se células para a parte inferior da membrana foram detectados por limpar o lado de cima com cotonete e coloração das células inferior com solução a 0,1% de violeta de cristal. Células movidos para o lado inferior da membrana foram observadas ao microscópio, e o violeta de cristal adere nas células do lado de baixo foram dissolvidos em ácido acético a 33%, a proporção de DO da solução foi medida a 570 nm pelo leitor de microplacas.

imunofluorescência

Após FPKc incubação durante 24 h, as células foram eliminados como folowing: fixadas com 4% de paraformaldeído, permeabilizadas com 0,1% de Triton X-100 e bloqueadas com 5% de albumina de soro bovino (BSA), entre cada etapa As células foram lavadas por PBS durante três vezes. Depois as células foram bloqueadas, foram incubadas com anti-MMP-9 e -MMP 2-anticorpos (adquirido de Santa Cruz) durante a noite e tingido com o anticorpo secundário correspondente realizada por imunoglobulina FITC (Zhong Shan Golden Bridge Biotecnologia Co., Pequim, China ) a 37 ° C no escuro durante 1 h, e, em seguida, as células foram fotografadas com microscópio de fluorescência Nikon (e 600).

Hoechst 33342 coloração

Hoechst 33342 coloração foi realizada para detectar alterações de morfologia núcleos de células SW-480 após FPKc e ES tratamento. As células tratadas foram coradas por 10 uM Hoechst 33342 durante 15 min a 37 ° C, em seguida, as células marcadas foram lavadas três vezes com PBS e observadas utilizando um microscópio de fluorescência com filtros de excitação padrão (Nikon, Japão). Excitação comprimento de onda era 346 nm e emissão de comprimentos de onda era de 460 nm

A citometria de fluxo análise do DNA fragmentação

O método para analisar a fragmentação do DNA foi fluxo de detecção fluorocytometric de hypoploidy DNA após a adição de iodeto de propídio (PI.; Sigma, St. Louis, EUA) para as células que morrem e permeabilização-los por congelação-descongelação [18]. Para investigar o efeito de FPKc ES e em danos no ADN de SW-480 e as células de HEK-293, foi realizada por fragmentação de ADN oligonucleosomal fluorocytometry fluxo. As células em placas de 24 poços foram tratadas com várias concentrações de FPKc e ES durante 12 h, respectivamente. As células foram então coradas com 5 ug /ml de PI e analisadas quanto ao teor de ADN por citometria de fluxo.

ciclo celular análise

SW-480 foram semeadas em placas de 24 poços, e, em seguida, tratada com FPKc e ES (0, 240, e 24 ug /ml) durante 24 h. Em seguida, as células foram colhidas e disposta como seguintes passos: lavadas duas vezes com PBS frio contendo 1% de BSA (Sigma, St. Louis, EUA), fixadas com etanol a 70% arrefecido em gelo a -20 ° C durante a noite, depois lavou-se duas vezes com PBS frio , incubadas com 100 ug /ml de RNase a (Sigma, St. Louis, EUA) durante 30 min a 37 ° C, após o que coradas com 50 ug /ml de PI durante 30 min no escuro e, finalmente, analisadas por citometria de fluxo (Millipore, EUA).

Anexina V-FITC /PI experimento coloração

fosfatidilserina serve como um marcador sensível de células que sofrem apoptose quando é exteriorizada no folheto exterior [19]. Assim, a proporção de células em apoptose foi medida com um V-FITC Apoptosis Detection Kit Anexina (Invitrogen, EUA), de acordo com o protocolo do fabricante. Resumidamente, SW-480, SW-620 e as células HEK-293 foram tratadas com várias concentrações de FPKc e ES durante 24 h a 37 ° C, e depois as células tratadas foram recolhidas e re-suspensas em 200 ul de tampão de ligação. Após a adição de 2 ul de anexina V-FITC e PI em 2 uL da suspensão de células, as amostras foram incubadas durante 15 min à temperatura ambiente no escuro. O índice apoptótico foi imediatamente determinada por citometria de fluxo.

Detecção de geração intracelular espécies reactivas de oxigénio (ROS)

Alguns fungos comestíveis, como Pleurotus abalonus, poderia provocar a apoptose ROS mediada [20] . No presente estudo, também medido mudanças do nível de ROS celular através da conversão oxidativa da sonda fluorescente sensível 2 ‘, 7′-diclorofluoresceína-diacetato (DCFH-DA) para fluorescente 2′, 7’-diclorofluoresceína (DCF). DCFH-DA facilmente se difunde através da membrana da célula e é hidrolisada enzimaticamente por esterases intracelulares para formar DCFH não fluorescente, o qual é, em seguida, rapidamente oxidado para formar DCF altamente fluorescente na presença de ROS, e a intensidade de fluorescência é proporcional a produção de ROS. células SW-480 e HEK-293 em placas de 24 poços foram tratadas com a concentração do mencionado FPKc e ES por 3 e 6 h (células HEK-293 unicamente durante 6 h). As células foram colhidas e lavadas duas vezes com PBS, ressuspensas em 500 ul de 10 mM DCFH-DA (adquirido a partir de Molecular Probes Inc., Invitrogen, CA, EUA) e incubou-se a 37 ° C durante 30 min no escuro. As amostras foram, então, imediatamente detectada por citometria de fluxo. Os histogramas foram analisados ​​usando FCS expresso V3.

determinação Glutationa

SW-480 células foram incubadas em placas de 24 poços, e, em seguida, eles foram tratados com ES FPKc e durante 3 h e 5 h. Depois disso, as células tratadas foram recolhidas e lavadas duas vezes com PBS. As concentrações totais de glutationa foram conduzidas por Kit glutationa (Nanjing instituto Jiancheng bioengenharia, China) de acordo com o protocolo do fabricante. Por fim, as amostras foram medidas a 405 nm com leitor de microplacas (Bio-Tek ELX 800, EUA).

coloração Western blotting

de SDS-PAGE e imunotransferência foram realizadas de acordo com procedimentos padrão. Resumidamente, depois tratou-se com FPKc (240 ug /ml) e ES (24 ug /ml) durante 0 h, 12 h, 24 h e 48 h, as células foram lisadas por tampão RIPA em gelo. As amostras de proteínas foram separadas num gel de poliacrilamida SDS a 10%, e, em seguida, o gel foi transferido para membranas de nitrocelulose (Millipore, MA, EUA) e colocados a hibridar com anticorpos primários (caspase-3 clivada,-RARP, Bcl-2, p53 foram adquiridos a partir de Cell Signaling Technology, EUA) durante a noite a 4 ° C. Os anticorpos primários ligados foram então marcadas com IRDye 680 conjugado IgG (LI-COR, Biosciences) à temperatura ambiente durante 1 h. E a fluorescência de infravermelho foi detectado com o sistema de imageamento infravermelho Odyssey (Li-Cor Bioscience, Lincoln, NE).

A análise estatística

Todos os experimentos foram realizados em triplicado, e os dados foram expressos como significa SD ±. Os valores de IC50 foram calculados por análise de regressão. Os dados foram submetidos a uma análise pelo teste de gama múltipla de Duncan (SPSS, versão 18.0). Uma diferença significativa foi julgada a existir a um nível de ** p . 0,01

Resultados

HPLC

ensaio de HPLC foi acedida para identificar ES e os componentes químicos de FPKc. Os dados são apresentados na Figura 2, nas mesmas condições experimentais, padrão ES mostrou o seu tempo de retenção de 83,8 minutos (figura 2B); FPKc exibida seis picos principais e inclui um pico com o mesmo tempo de retenção de ES, implicando ES pode ser um dos principais componentes de FPKc (Figura 2A); A partir da área dos picos, que revelou ES classificados segundo em FPKc; A partir da determinação quantitativa de ES em FPKc com HPLC, especulamos ES possuía 105 ug /mg (cerca de 10% no total de FPKc).

e FPKc padrão ES foram identificados por HPLC-PDA a 254 nm como descrito na secção experimental.

efeitos citotóxicos de FPKc e ES

Figura 3A-C mostrou a citotoxicidade de FPKc no SW-480, SW-620 e células Caco-2, respectivamente, que estava em uma dose e tempo-modo dependente. Quando SW-480 células foram tratadas com 120 e 240 ug /ml FPKc durante 48 h, a perda de viabilidade celular foi 34,99 ± 1,08% e 65,20 ± 2,34%, o IC

50 valor foi calculado como 190,28 ug /ml; Para SW-620 células, a viabilidade celular diminuiu de 74,61 ± 0,99% e 29,52 ± 1,28% na concentração de 80 e 160 ug /ml, respectivamente, do IC

50 valor foi calculado como 143,26 ug /ml. Caco-2 realizados menos sensível do que as linhas de células de 2 acima. Após 72 h de incubação com FPKc, Caco-2 começaram a executar a perda de viabilidade, a viabilidade celular foi de 71,65 ± 0,003% com 200 ug /ml FPKc, e quando a dose aumentada para 280 ug /ml a viabilidade celular diminuiu para 47,16 ± 0,011% , e o IC

50 era 371,5 mg /ml.

SW-480, SW-620, Caco-2 e células HEK-293 células de viabilidade após FPKc (a, B, C, D) e ES tratamento (E) foi medida pelo ensaio de MTT. Cada valor foi expresso como média ± S. D. de, pelo menos, três determinações independentes. One-way ANOVA foi utilizado para comparações de grupo múltipla significa seguido pelo teste t de Dunnett. * P 0,05 e ** P 0,01 versus o controlo. (barras de erro = S. D., n = 3).

Figura 3D mostrou a actividade citotóxica de ES, e danos células foi 34,52 ± 0,58% quando a dose foi ES 24 ug /ml após 48 horas de incubação. A título de comparação, sob as mesmas condições experimentais, 240 ug /ml FPKc causada 65,20 ± 2,34% de perda de viabilidade celular, indicando que alguns outros componentes citotóxicos existentes em FPKc.

Para comparação, a Figura 3E reflectida a citotoxicidade de FPKc em humana células de rim embrionário normal, 293 (HEK-293), um dano celular relativamente mais fraca foi observada em células HEK-293 em comparação com SW-480 células com a mesma dose de FPKc, sugerindo FPKc tem algum efeito de morte celular tumoral selectiva.

de inibição da migração de FPKc e ES em SW-480 células in vitro

Para determinar se FPKc afectou a capacidade de migração de células SW-480, a cicatrização de feridas e Transwell ensaio foram realizados (Figura 4A). A ferida capacidade das células de cicatrização de reflectir o seu movimento e migração sobre a superfície na qual eles foram ancoradas para o crescimento. Em SW-480 células, em comparação com 0 h após o ferimento, após 12 h de incubação, cada células densas no controle cresceu gradualmente ao espaço intercalar da ferida; células em 120 ug /ml FPKc grupo tratado mostrou ligeira diferença com o controle; enquanto que as células em 240 ug /ml FPKc e 24 ug /ml de ES grupos tratados raramente cresceu para o espaço intermédio da ferida. Quando o tempo de incubação aumentada para 24 h, a capacidade das células de migração foi diminuída com cada dose de FPKc. E o número de células com 120 ng /ml FPKc e 24 ug /ml de ES não se alterou muito em comparação com o controlo, enquanto que o grupo de 240 ug /ml tratado diminuiu visivelmente.

SW-480 células em 24- bem placas foram feridos por raspagem com uma ponta de pipeta e as células foram incubadas com FPKc e ES durante 12, 24 horas. As células foram fotografados sob microscopia de contraste de fase (200x de ampliação). Figura 4B, Análise de mudança de migração no SW-480 células por transpoço ensaio. As células em cada grupo de movimento para a superfície inferior do filtro foram coradas com violeta de cristal e fotografadas sob um microscópio de luz em × 200. b) O índice de OD de violeta de cristal foi medido. As barras de erro representam DP de os meios de três experiências independentes. * P 0,05 e ** P . 0,01 versus controlo não tratado

ensaio

Transwell foi empregue para confirmar ainda mais a inibição de migração induzida por FPKc em células SW-480. E a Figura 4B indicam que após 24 h de incubação com FPKc, a capacidade de migração celular diminuiu para 28,28 ± 0,07% em comparação com o controlo; e para o grupo ES, a migração foi 51,92 ± 0,85%, o que confirmou a ferida cura ensaio. Os resultados indicaram ambas FPKc e ES poderia inibir a migração celular, obviamente.

Imunofluorescência

MMPs são verticais na migração celular e movimento. MMP-2 e MMP-9 foram detectados por imunofluorescência experiência neste estudo. Figura 5 revelou a MMP-2 e MMP-9 foram alta expresso com fluorescência verde brilhante no grupo de controlo. E para os grupos ES e FPKc, ambas as enzimas diminuiu acentuadamente em comparação com o controlo.

células SW-480 foram fixadas e processadas para imunof luorescência, MMP-9 e MMP-2 foram visualizadas utilizando anticorpo FITC-segundo rótulo ( verde). As barras de escala, de 100? M.

alterações morfológicas induzidas pela FPKc e ES em células SW-480

O exame morfológico foi realizada pela Hoechst 33342. Tal como mostrado na Figura 6, os núcleos de as células de controlo foram uniformemente coradas, ea fase de contraste indicou a morfologia das células SW-480 normal com pequenas ilhas de células epiteliais. No entanto as células após FPKc ES e tratamento durante 48 h mostrou alterações morfológicas significativas: cromatina condensada e fragmentada pontuar fluorescência nuclear azul foram vistos de uma forma dependente da dose. Quando a dose foi FPKc 240 ug /ml, a coloração nuclear era, obviamente, e as imagens de fase revelou que as células transformadas em tipo redondo anormal, e o número de células foi reduzido nitidamente.

SW-480 células tratadas durante 48 h foram coradas com Hoechst 33342. as alterações morfológicas foram observadas ao microscópio fluorescente.

a fragmentação do DNA induzido por FPKc e ES

coloração PI por citometria de fluxo foi utilizada para avaliar os danos no DNA causada por FPKc e ES. Como apresentado na Figura 7A, FPKc em 120 ug /ml desencadeou um aumento de 1,8 vezes em danos no DNA em SW-480 células, e 240 ug /ml de FPKc conduziu a um aumento dependente da concentração da fragmentação de ADN em 7,2 vezes, comparativamente com células não tratadas (p 0,01). Um aumento similar de 4,2 vezes na intensidade da fluorescência vermelha de SW-480 células foi também obtido através da incubação com PE (24 ug /ml). A Figura 7B mostrou 240 ug /ml FPKc induzida 18,26 ± 0,28% de danos ao DNA em células HEK-293 (cerca de 1,6 vezes de controlo) que indicou HEK-293 realizada muito menos danos no ADN (p 0,01) do que a de células SW-480 (p .. 0,01) na mesma dose de tratamento FPKc

Ambas as células foram tratadas com FPKc e ES para 12 (PI) e analisadas por citometria de fluxo

paragem do ciclo celular induzida por FPKc e ES

Para o tratamento de câncer, parada do ciclo celular tem sido considerada como uma das metas mais importantes. Como todos sabemos, as células cancerosas sempre manter a proliferação celular descontrolada porque a sua mutação genética que controlava a divisão celular [21]. Para avaliar o efeito do tratamento FPKc sobre a distribuição das células no ciclo celular, foi realizada a análise do ciclo celular de ADN por citometria de fluxo. Figura 8 mostram os efeitos de FPKc ES e na fase do ciclo celular (G1, S, e G2 /M), a distribuição de células SW-480. Após FPKc tratamento de 24 h, a acumulação de células SW-480 no G1 aumentou de 39,27 ± 0,56% para 56,77 ± 0,5%; enquanto que para o tratamento ES, a acumulação foi de até 65,22 ± 0,54%. Os resultados mostraram que FPKc e ES poderia induzir a paragem do ciclo-SW 480 células de células na fase G1.

SW-480 células foram recolhidas e fixadas em álcool a 70% e, em seguida, coradas com PI. Finalmente, as células coradas foram analisadas utilizando um citómetro de fluxo.

A apoptose induzida por efeito FPKc e ES

paragem do ciclo celular está intimamente relacionado com a apoptose, e a interrupção da progressão do ciclo celular pode, eventualmente levar à morte necrótica /apoptótica [22]. Para melhor avaliar o índice de apoptose que FPKc e ES poderia provocar, a dupla marcação anexina V-FITC /PI foi utilizado. A partir da figura 9A, ficou claro para ver FPKc poderia desencadear SW-480 células de apoptose de um modo dependente da dose após incubação durante 24 h. O rácio de apoptose tardia (superior direito) aumentou de 15,40 ± 0,53% para 31,82 ± 0,93%, acompanhado pelo aumento da concentração FPKc de 120 a 240 ug /ml, enquanto que o controlo foi de apenas 6,42 ± 0,5%. Curiosamente, ES (24 ug /ml) também pode induzir a externalização de fosfatidilserina, a proporção de apoptose fago tarde e início foi de 28,90 ± 0,63% (superior e inferior direito).

As células foram double-coradas com anexina V- FITC e PI, e, em seguida, analisadas por citometria de fluxo. Todos os experimentos foram realizados de forma independente em triplicado por ponto experimental e resultados representativos foram mostrados. Os resultados representados a média ± DP de três experiências independentes. * P 0,05 e ** p 0,01 indicaram diferenças estatisticamente significativas em comparação com grupo controle

Figura 9B mostrou a apoptose liderado por FPKc em células HEK-293.. Após incubação com 240 ug /ml FPKc durante 24 h, a taxa de apoptose das células tratadas foi de 11,83 ± 3,2% e grupo de controlo foi de 9,63 ± 3,7%, o que revelou que não havia grande diferença nos dois grupos.

Relata células SW-620 também foram testados por ensaio /PI AnnexinV, e a Figura 9C revelou que FPKc podia induzir células SW-620 apoptose apoptose especialmente no início. Após 24 h de incubação com FPKc, a proporção de apoptose das células iniciais foram de 3,13 ± 0,40% para 12,23 ± 0,51% e 15,20 ± 0,40%, como o FPKc dose aumentada de 0 a 80 e 160 ug /ml.

acumulação de ROS induzidos por FPKc e ES em células SW480

A produção intracelular ROS foi analisada por citometria de fluxo com coloração DCF. Os dados apresentados na Figura 10A sugeriram que os níveis de ROS intracelulares foram aumentadas após FPKc ES e tratamento. Em 3 horas, a cerca de 34,33 ± 0,45%, 82,77 ± 1,05% e 50,33 ± 0,53% das células em 120 e 240 ug /ml FPKc e 24 ug /ml ES grupos tratados mostraram brilhante fluorescência DCF, enquanto apenas 5,40 ± 0,45% das células no grupo controle foram muito brilhante fluorescência DCF. Quando o tempo de incubação foi aumentada para 6 h, a percentagem de células com fluorescência brilhante DCF não se alterou muito em FPKc células tratadas, células tratadas ES aumentada para 71,10 ± 1,7%. E a Figura 10B mostram após o tratamento FPKc, HEK-293 mostrou pouca acumulação de ROS em comparação com o controlo.

SW-480 (A) e células HEK-293 (B) As células foram tratadas com FPKc e ES, e a ROS níveis foram medidos por citometria de fluxo, após coloração com DCFH-DA. SW-480 células foram pré-tratados com NAC (5 mM) durante 1 h, em seguida intracelular ROS geração (C), de danos no DNA (D), a viabilidade celular (E) e apoptose (f) foram detectados.

Para validar ainda que ROS foi envolvido em FPKc efeito apoptose induzida de SW-480 células, ROS scavengers-NAC foi pré-tratado com células SW-480. Como esperado, na presença de 5 mM de antioxidante NAC, a acumulação de ROS diminuiu para 4,26 vezes em relação ao controlo, enquanto o grupo FPKc era 10,15 vezes em relação ao controlo (Figura 10C).

Tem sido relatado que a excessiva quantidades de ROS pode causar danos oxidativos a lípidos, proteínas e ADN, levando a tumorigénese ou a morte das células [23]. No presente estudo, nós medimos danos no DNA após co-tratamento com NAC. E os resultados mostraram que os danos do ADN podem ser, obviamente, revertida por NAC: índice de dano de ADN foi 38,85 ± 2,7%, quando as células foram tratadas com 240 ug /ml FPKc durante 24 h, o grupo de co-tratamento NAC foi apenas de 8,20 ± 0,71%, enquanto o controlo foi de apenas 6,50 ± 0,5% (Figura 10D). Os resultados revelaram que o dano ao DNA induzido FPKc pode ser associado ao acúmulo de ROS

O efeito citotoxicidade de FPKc no SW-480 células foi em grande parte revertida pelo NAC (p 0,01, Figura 10E).. As células viáveis ​​foi de cerca de 85,73 ± 0,14% e 69,62 ± 0,21% em pré-tratamento com NAC, em comparação com cerca de 55,42 ± 2,00% e 39,44 ± 0,64% por tratamento com 120 e 240 ug /ml FPKc, respectivamente.

anexina V-FITC /PI ensaio de dupla marcação também revelou que o pré-tratamento com NAC poderia parcialmente proteger as células SW-480 de apoptose induzida FPKc (Figura 10F). Estes resultados indicam que a acumulação de ROS intracelular participou na apoptose induzida por FPKc de células SW480.

Alterações da concentração de glutationa intracelular causadas por FPKc

Como a depleção de GSH tem sido considerada como um dos importantes factor que causa a acumulação de espécies de oxigénio reactivas (ROS) [24], a concentração de GSH em SW-480 células foi avaliada após o tratamento FPKc e ES (Figura 11). Quando as células foram tratadas durante 3 h, a concentração de GSH intracelular diminuiu de 70,38 ± 1,50%, 29,23% ± 1,00 e 50,14 ± 1,70% do controlo com 120, 240 ug /ml FPKc e 24 ug /ml de ES, respectivamente. E quando o tempo de incubação aumentada para 5 h, o conteúdo de GSH nas células SW-480 não se alterou muito após o tratamento FPKc; enquanto que para os ES tratados amostras, GSH celular diminuiu para 42,18 ± 1,00%, o que estava de acordo com a geração de ROS.

A concentração intracelular de GSH de SW-480 células após os tratamentos FPKc e ES foi medida a 405 nm com microplacas leitor.

Exame dos níveis de proteínas associadas com o ciclo celular e apoptose

o mecanismo subjacente da alteração induzida FPKc da expressão de proteínas envolvidas no ciclo celular e apoptose na células SW-480 foi adicionalmente elucidada por ensaio de transferência de Western (Figura 12). Os níveis de actina serviu como um controlo interno. Verificou-se que a expressão da proteína anti-apoptótica de Bcl-2 foi reduzida quando as células foram tratadas com 240 ug /ml FPKc durante 48 h; e para o ES (24 ug /ml) o tratamento de células, o nível de Bcl-2 foi diminuída quando incubadas durante 24 e 48 h. Neste estudo, caspase-3 clivada e PARP clivada foram avaliadas, e os resultados mostraram ambos foram depois incubadas com upregulated FPKc e ES durante 24 h e 48 h.