Abstract
Fundo
tipo de receptor da proteína tirosina fosfatase D (PTPRD) é um supressor tumoral putativo em vários cancros, incluindo cabeça e pescoço carcinoma de células escamosas (CECP). STAT3 é um oncogene frequentemente hyperactivated para CECP. Como STAT3 é um substrato direta de PTPRD, buscou-se determinar as alterações genéticas ou epigenéticas de
PTPRD
que contribuem para STAT3 hiperactiva para CECP.
Métodos
Foram analisados dados de The Cancer Genome Atlas (TCGA) e nosso estudo anterior whole-exome sequenciamento e resumiu a mutação, metilação, e copiar o status número de
PTPRD
para CECP e outros cânceres.
In vitro
estudos envolveram transfecção padrão e protocolos de MTT, bem como PCR específicos de metilação.
Resultados
Nossas descobertas indicam que
PTPRD
mutação, em vez de metilação ou alteração do número de cópias, é o mecanismo principal pelo qual a função PTPRD é perdida em HNSCC. Nós demonstramos que sobreexpressão de tipo selvagem em células PTPRD CECP inibe significativamente o crescimento e a activação da STAT3 enquanto mutantes PTPRD não, o que sugere que a mutação pode conduzir a perda de função e subsequente hiper-fosforilação de substratos, especialmente PTPRD STAT3. Importante, determinou-se que as células CECP abrigando uma endógena
PTPRD
mutação são mais sensíveis ao bloqueio STAT3 de
PTPRD
células do tipo selvagem. Nós, adicionalmente, descobriu que
PTPRD
expressão de mRNA não se correlaciona com a expressão pSTAT3, sugerindo que as alterações que se manifestam através da expressão de mRNA alterada, incluindo hipermetilação e genes alterações no número de cópias, não contribuem significativamente para STAT3 overactivation para CECP.
Conclusão
PTPRD
mutação, mas não metilação ou copiar perda de número, pode servir como um biomarcador preditivo de sensibilidade aos inibidores da STAT3 em HNSCC
Citation.: Peyser ND, Du Y, Li H, Lui V, Xiao X, Chan TA, et al. (2015) Perda de função
PTPRD
Mutações levar ao aumento da STAT3 Activation e sensibilidade para STAT3 Inibição em Câncer de Cabeça e Pescoço. PLoS ONE 10 (8): e0135750. doi: 10.1371 /journal.pone.0135750
editor: Qian Tao, da Universidade Chinesa de Hong Kong, Hong Kong
Recebido: 26 Março, 2015; Aceito: 25 de julho de 2015; Publicação: 12 de agosto de 2015
Direitos de autor: © 2015 Peyser et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Data Availability: genômica e proteômica dados estão disponíveis a partir The Cancer Genome Atlas (https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/dataAccessMatrix.htm) e The Atlas Cancer Proteome (https://app1.bioinformatics.mdanderson.org/tcpa/_design /basic/index.html)
financiamento:. Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health (www.nih.gov) P50CA097190 financiamento e R01CA77308 a JRG, e F31DE024007 para NDP, a American Cancer Society (www .cancer.org) para JRG, a Bolsa Conselho China (https://en.csc.edu.cn) para YD, e do Fundo Geral de Pesquisa do Conselho de Bolsas de Investigação de Hong Kong (http: //www.ugc. edu.hk/) 17114814 e financiamento de sementes de Pesquisa básica de VL
Conflito de interesses:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
proteína tirosina fosfatase receptor de tipo D (PTPRD) é um membro da família do receptor de tipo de tirosina-fosfatase de proteína (PTPR). PTPRs são enzimas de membrana integral, que catalisam a remoção de grupos fosfato a partir de proteínas específicas, afectando desse modo a sinalização celular. A desregulação de PTPR sinalização por mecanismos genéticos e /ou epigenética pode, portanto, em última análise, levar a fenótipos cancerosos. [1] Vários membros da família, incluindo PTPR PTPRD, têm sido relatados para funcionar como supressores de tumores, onde a perda de função de alterações podem levar ao crescimento do tumor. [2,3] eventos genéticos, incluindo mutação, deleção do gene, ou silenciamento epigenético pode levar à diminuição da atividade da fosfatase de PTPRs e sinalização oncogénica reforçada. [1]
Recentemente, relatou o perfil de mutação cumulativa do
PTPR
família de genes no câncer com foco em
PTPRT
mutação que conduz à activação STAT3 em cabeça e pescoço escamoso carcinoma de células (carcinoma epidermóide). [4] A análise revelou que 15 tipos de tumores sólidos nutria mutações de pelo menos um
PTPR
gene.
PTPRD
é um dos mais comumente mutado
PTPR
membros da família em CECP e PTPRD foi relatado para funcionar como um supressor tumoral nesta malignidade. [5]
PTPRD
também é mutado, suprimidos, ou hiper-metilado no glioblastoma (GBM), enquanto que o gene é não metilado e expresso em tecido cerebral normal. [6] Para além disso,
PTPRD
mutações foram encontradas para ser associada com a expressão aumentada de STAT3 fosforilado, um substrato PTPRD directa, no GBM. Além GBM, 13% e 25% dos tumores CECP analisados no estudo acima nutria
PTPRD
mutação ou metilação do promotor, respectivamente. deleção homozigótica do
PTPRD
foi adicionalmente notificadas em câncer de laringe, o que sugere que aberrações genéticas que afetam a função PTPRD pode ser um evento comum em muitos tipos de câncer. [5]
Estes resultados cumulativos leva à hipótese de que a alteração genética e /ou epigenética de
PTPRD
pode contribuir para a sinalização reforçada e crescimento na HNSCC onde os componentes chave da via pode servir como plausível alvos terapêuticos. Aqui, resumimos o perfil genético e epigenético da
PTPRD
em HNSCC de The Cancer Genome Atlas (TCGA) e nosso estudo paisagem mutacional antes HNSCC. [7] Em seguida, testamos as consequências da
PTPRD
alterações encontradas em tumores CECP humanos em modelos pré-clínicos relevantes para avaliar a atividade STAT3 e sensibilidade à inibição STAT3.
Materiais e Métodos
cultura celular, tratamento da toxicodependência, e transfecção
Todas as linhas de células de carcinoma epidermóide foram genotipicamente verificadas como anteriormente descrito. [4] Cal27 células foram obtidas de ATCC (Manassas, VA). As células PE /CA-PJ34clone12 e PE /CA-PJ49 foram obtidos a partir de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). 686LN células foram obtidas a partir de Georgia Chen no MD Anderson Cancer Center (Houston, TX). Cal27 células foram cultivadas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (Mediatech, Inc., Manassas, VA) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS) (Gemini Bio-Products, West Sacramento, CA). 686LN células foram cultivadas em DMEM /F12 (Life Technologies, Grand Island, NY) suplementado com 10% de FBS. PE /CA-PJ34clone12 e PE /CA-PJ49 foram cultivadas em Modificação de Iscove de DMEM (Mediatech Inc., Manassas, VA) suplementado com 10% de FBS e 2 mM de L-glutamina (Life Technologies, Grand Island, NY). Todas as células foram mantidas numa incubadora a 37 ° C e 5% de CO
2. JSI-124 (Calbiochem, Billerica, MA) foi dissolvida em DMSO. A transfecção foi realizada com Lipofectamine 2000 (Life Technologies, Grand Island, NY) ou FuGENE HD (Promega Corporation, Madison, WI) de acordo com as instruções do fabricante, com ADN de 4 ug diluído em Opti-MEM (Life Technologies, Grand Island, NY).
mutagénese dirigida ao local
PTPRD
mutações (K1502M, S384R, T1100M e L1147F) foram gerados a partir do plasmídeo do tipo selvagem usando o kit de mutagénese dirigida ao local Phusion ( Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) seguindo o protocolo do fabricante e confirmado por sequenciação de Sanger. amplificações de plasmídeo foram realizadas utilizando o QIAprep spin Miniprep Kit (Qiagen, Hilden, Alemanha) ou o kit Maxi Prep furacão (GerardBIOTECH, Oxford, OH) de acordo com as instruções do fabricante.
imunotransferência
primária anticorpos para pSTAT3 (Y705) e STAT3 foram obtidos a partir de Cell Signaling Technology (Danvers, MA). anticorpo primário p-tubulina foi comprado de Abcam (Cambridge, MA). Anticorpos secundários foram adquiridos à BioRad (Hercules, CA). As manchas foram quantificadas por densitometria utilizando o software ImageJ.
ensaio MTT
ensaios MTT foram realizados por incubação das células em 5 mg /ml de 3- [4,5-dimetiltiazol-2-il] -2 , brometo de tetrazólio 5 difenil em PBS a durante 30 min a 37 ° C e 5% de CO
2. Após a incubação, a solução foi aspirada e substituída por DMSO. Absorvância desta solução foi medida a 570 nm em espectrofotômetro.
metilação específicas de PCR
Tumor e tecido normal foram obtidos sob os auspícios de um protocolo Institutional Review Board-aprovado na Universidade de Pittsburgh. O ADN foi isolado a partir de tecido embebido em parafina fixado em formalina utilizando o kit de tecido FFPE QIAamp DNA, e a linha celular de ADN foi o isolamento utilizando o Kit QIAamp DNA Mini. bissulfito de conversão foi realizada utilizando o kit de EpiTect bissulfito e reacção em cadeia da polimerase-metilação específico (MSP) ter sido realizada utilizando o kit EpiTect MSP. Todos os kits foram usadas de acordo com as instruções do fabricante (Qiagen, Hilden, Alemanha). primers MSP foram projetados usando software MethPrimer. [8] Por metilação, as sequências de iniciadores directo e inverso foram GTTTTATTTTGGATTTTTGGAATC e TACCTAACGCGACCTAAACG, respectivamente. Para unmethylation, as sequências dos iniciadores directo e inverso foram TATTTTGGATTTTTGGAATTGT e AACTACCTAACACAACCTAAACAAA, respectivamente. Os iniciadores eram específicos para o estado de metilação pretendido conforme determinado utilizando o EpiTect Controlo Conjunto de ADN (Qiagen, Hilden, Alemanha).
descarregar dados e análise
Mutation, alteração do número de cópias, e RNA-Seq dados foram agregados a partir do Portal CBio [9,10] e relatórios publicados. [6,7,9] Dados de metilação do DNA foram obtidos por meio da matriz de dados TCGA (https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/dataAccessMatrix.htm). sequências de DNA e proteínas e anotações de domínio foram obtidos a partir do Centro Nacional de Informações sobre Biotecnologia (https://www.ncbi.nlm.nih.gov). dados da matriz de proteínas de fase inversa foram obtidos de The Cancer Proteome Atlas (https://app1.bioinformatics.mdanderson.org/tcpa/_design/basic/index.html). Os testes estatísticos foram realizados utilizando GraphPad Prism 5 software (GraphPad, La Jolla, CA).
Trypan Blue exclusão
/células CA-PJ34clone12 PE foram semeadas em placas de 6 poços a 100.000 células por bem. Após 24 horas, as células foram transfectadas com controlo de vector, de tipo selvagem PTPRD, ou mutantes PTPRD em triplicado utilizando 4 ug de ADN do plasmídeo, 12 uL FuGENE HD (Promega Corporation, Madison, WI), e 200 uL de Opti-MEM (Life Technologies , Grand Island, NY, EUA) por poço adicionado directamente às cavidades contendo 3 mL de meio completo. Após 72 horas, as células foram tripsinizadas e ressuspensas em PBS contendo 0,2% de azul de tripano (MP Biomedicals, LLC, Santa Ana, CA). Cada suspensão de células foi contado em quatro campos em um hemocitômetro ea média foi utilizada para calcular o número total de células presentes.
Resultados
mutações PTPRD ocorrem frequentemente em CECP e outros cânceres
mutação somática é um evento comum levando a gene alterado e função da proteína no cancro. Dezoito não sinónima
PTPRD
mutações foram identificados até à data em tumores CECP. [6,7,9,10] Estas mutações parecem espalhadas por toda a sequência do gene e proteína. (Fig 1A) Eles são todos para não-recorrente, com cada ocorrendo em um único tumor HNSCC, sugerindo que estes são provavelmente mutações de perda de função. Destes 18 mutações, 12 ocorrem no domínio extracelular, um está localizado para o domínio catalítico, e 5 estão na região transmembranar que foi identificado nenhum domínio conservado. Além de CECP,
PTPRD
mutações também são amplamente observado em outros tipos de câncer. (Fig 1B) na coleção do Cancer Genome Atlas (TCGA),
PTPRD
é mais frequentemente mutado em melanoma cutâneo (59/344 casos, 17,2%), seguido pelo adenocarcinoma de pulmão (33/230 casos, 14,3% ), e adenocarcinoma do estômago (30/289 casos, 10,4%). [9,10] Como em CECP,
PTPRD
mutações nestes cancros não parecem se agrupar em regiões hotspot ou resíduos, sugerindo que a perda da função PTPRD por mutação somática é um evento comum em vários sites cancerosas.
(a) a localização de mutações de proteínas PTPRD relatados em tumores CECP. tumores TCGA [9,10];: Vermelho Verde: a partir de [6]; Azul: a partir de [7]. IG, Imunoglobulina; IG2, Segunda imunoglobulina (Ig) do domínio do receptor de proteína tirosina fosfatase (RPTP) -F; FN3, fibronectina tipo 3 domínios; PTPC, proteína tirosina fosfatase, do domínio catalítico. (B) Freqüência de
PTPRD
mutações em cancros humanos, conforme determinado pelo TCGA, com HNSCC mostrado em vermelho.
A única mutação detectada em HNSCC que tenha sido previamente identificado em outro câncer é T1100M, que foi relatada na leucemia linfocítica crónica. [11] Curiosamente, vários outros locais de mutação encontrados em HNSCC ter uma substituição de aminoácido diferente relatado em outros tipos de câncer. Por exemplo, enquanto que K204E é observada em HNSCC, K204Q tem sido relatada em cancro do esófago. [12] Além disso, uma revisão da base de dados COSMIC (https://cancer.sanger.ac.uk/cancergenome/projects/cosmic/) demonstra a detecção de L503V em câncer de fígado (em comparação com L503I para CECP) e L1036M no cólon adenocarcinoma (em comparação com L1036P para CECP). Ding
et al
adicionalmente, informou uma mutação neste local (L1036Q) em adenocarcinoma de pulmão. [13] É interessante notar que enquanto K1502M é o único domínio catalítico mutação identificados até à data em HNSCC, TCGA identificou uma mutação sem sentido K1502 * no adenocarcinoma de pulmão. Juntos, estes resultados sugerem que, embora a específica
PTPRD
mutações encontradas até agora em HNSCC são únicos, as posições de aminoácidos em que ocorrem podem representar resíduos importantes que são susceptíveis a alterações genéticas. Com efeito, a análise de alinhamento de sequências múltiplo indica que estes resíduos são altamente conservadas entre espécies, sugerindo que podem ter um papel fundamental na função PTPRD adequada (análise não mostrado).
PTPRD mutantes derivadas de CECP levar a um crescimento celular aumentado
PTPRD foi reportado para servir como um supressor tumoral no cancro humano. [3,5,6] Para determinar as consequências funcionais de
PTPRD
mutação no HNSCC, geramos várias derivadas de mutantes CECP PTPRD representativos por mutagénese dirigida ao local, incluindo uma mutação no domínio extracelular (S384R), um no domínio catalítico (K1502M), e duas na região transmembranar (T1100M e L1147F). sobreexpressão transitória destas construções em uma linha de células de carcinoma epidermóide sem endógena
PTPR
mutações da família (PE /CA-PJ34clone12) revelou que todos os mutantes testados PTPRD levou a um aumento do crescimento, conforme determinado pelo ensaio MTT em relação ao PTPRD selvagem As células transfectadas com -tipo. (Figura 2A) Os resultados do ensaio de MTT foram posteriormente confirmados com mutantes representativas por ensaio de exclusão de azul de tripano em células PE /CA-PJ34clone12 (Fig 2B). Colectivamente, estes resultados sugerem que
PTPRD
mutações inactivar a função supressora de tumores de PTPRD independentemente da sua localização ao longo do gene, conduzindo a um aumento do crescimento /proliferação de células CECP.
(A) o crescimento celular foi avaliada por um ensaio MTT de 48 horas após a transfecção e normalizados para os controlos transfectados com vector. One-way ANOVA P = 0,0007. Os valores de P descritos representam os resultados de pares bicaudal testes t não pareado. O experimento foi realizado três vezes com resultados semelhantes. proliferação (B) celular foi avaliada por ensaio de exclusão de azul de tripano 72 horas após a transfecção. One-way ANOVA P 0,0001. Os valores de P descritos representam os resultados de pares bicaudal testes t não pareado.
mutação PTPRD está associada com aumento da expressão pSTAT3
STAT3 é hiper-activado por fosforilação constitutiva da tirosina 705 ( Y705) em muitos tipos de cancro, incluindo o CECP. [14,15] Importante, pSTAT3 (Y705) é um substrato direta conhecida de PTPRD. [6] Para determinar o efeito de
PTPRD
mutação na fosforilação STAT3 em CECP, examinamos primeiro 200 tumores CECP com toda sequenciação exome e RPPA análises realizadas por TCGA e proteoma Atlas Câncer (TCPA). tumores CECP com não-sinónimo
PTPRD
mutações expressam níveis significativamente mais elevados de pSTAT3 (Y705) em relação aos tumores com o tipo selvagem
PTPRD
(Fig 3A). Notavelmente,
PTPRD
é o único
PTPR
membro da família para a qual se observa essa correlação. Para testar a associação entre o
PTPRD
mutação e expressão pSTAT3 diretamente, nós transfectados numa linha celular HNSCC com conhecidos endógena
PTPRD (mutação Cal27 abrigar S387L)
mutação com o tipo selvagem
PTPRD
ou vector de controlo e constatou que a sobre-expressão do tipo selvagem PTPRD leva à diminuição da expressão pSTAT3 significativamente (P ≤ 0,05). (Fig 3B e 3C) Além disso, a sobre-expressão de PTPRD mutante em células de CECP sem endógena
PTPR
mutações familiares (PE /CA-PJ34clone12) leva ao aumento da pSTAT3 (Y705) expressão em relação ao PTPRD células wild-superexpressão do tipo por quase todas as mutações testadas. (Fig 3D e 3E) Juntos, estes resultados demonstram que
PTPRD
mutação leva ao aumento da sinalização STAT3 em células de CECP e tumores.
(A) tumores CECP abrigar
PTPRD
mutações expresso aumentou pSTAT3 relativa (Y705) para
PTPRD
do tipo selvagem tumores, como determinado por toda a sequenciação exome e array de proteínas de fase inversa (RPPA). Bicaudal teste t não pareado. (B) A superexpressão do tipo selvagem PTPRD em um
PTPRD
linha de células -mutant (Cal27) leva à diminuição da pSTAT3 (Y705) expressão (C) A determinação quantitativa de três experiências em replicado como mostrado na B. bicaudal não pareado teste t. (D)
PTPRD
células-tipo -wild CECP (PE /CA-PJ34clone12) que sobre-expressam transitoriamente mutante exibem PTPRD aumento pSTAT3 (Y705) em relação à expressão de células que expressam o tipo selvagem. (E) A determinação quantitativa de três experiências em replicado como mostrado na D. Dois-atado teste t não pareado.
células CECP com mutação PTPRD endógena são mais sensíveis à inibição da via STAT3
Desde
PTPRD
mutações aumentam a ativação STAT3 em CECP, próxima procuraram determinar se
PTPRD
mutação leva a um aumento da sensibilidade à inibição da via STAT3. Para testar a nossa hipótese, utilizou células CECP que abrigam uma endógena
PTPRD
mutação (PE /CA-PJ49). O tratamento com o inibidor JAK /STAT JSI-124 revela que estes
PTPRD
células mutantes exibem maior sensibilidade em relação ao
PTPR
células família de tipo selvagem (PE /CA-PJ34clone12), sugerindo que
PTPRD
mutação pode servir como um biomarcador preditivo de resposta para inibidores da via da STAT3 (Figura 4).
As células foram tratadas com concentrações crescentes de JSI-124 durante 24 horas, seguido de um ensaio MTT. O experimento foi realizado três vezes com resultados semelhantes.
expressão de mRNA PTPRD não se correlaciona com a expressão pSTAT3
hipermetilação promotor e do gene perda de número de cópias representam dois mecanismos adicionais que podem levar à perda da função de
PTPRD
via regulação negativa da expressão de mRNA. Importante,
PTPRD
expressão de mRNA não se correlaciona com a expressão pSTAT3 em amostras TCGA CECP, sugerindo que a metilação e copiar perda número não contribuem significativamente para STAT3 overactivation para CECP (S1A Fig). Com efeito, uma análise mais pormenorizada revela que enquanto
PTPRD
metilação se correlaciona com a expressão de ARNm como seria de esperar para qualquer gene (Fig S1B), observamos nenhuma correlação entre a metilação e expressão pSTAT3 (Fig S1C), nem observamos quaisquer casos de hipermetilação do promotor aberrante (definido aqui como um nível de metilação maior do que três desvios padrão acima da média de metilação no mesmo locus genético em amostras normais de correspondência de órgãos). Para validar esses achados, foi realizada PCR específicos de metilação em uma coorte independente de tumores CECP e encontrou evidências de
PTPRD
metilação do promotor em 75% dos tumores analisados (30/40) (análise de representação em S2 Fig ). Importante, também observamos
PTPRD
metilação do promotor em cada cinco amostras duplas de mucosa oral normal a partir destes pacientes com CECP (S3 FIG), sugerindo ainda que o
PTPRD
metilação observada em HNSCC não é específico de tumor .
PTPRD
copiar alterações numéricas ocorrer a um grau substancial de CECP e outros tipos de câncer (Fig 5a), onde a perda de cópias do gene, particularmente a perda de heterozigotos, ocorre com mais frequência do que o ganho em CECP e todos cancros analisados com a excepção de colo-rectal e os cancros cervicais. Importante, não observamos uma correlação significativa entre as alterações no número de cópias e expressão de mRNA em CECP (Fig 5B). Juntos, estes resultados sugerem que a hipermetilação do promotor e perda de número de cópias do gene não contribuem significativamente para STAT3 overactivation para CECP.
(A) Copiar número de alteração de
PTPRD
em cancros humanos, conforme determinado pelo TCGA . (B)
PTPRD C Número
opy alterações não se correlacionam com PTPRD
expressão de mRNA alterada
para CECP. Um teste de Jonckheere-Terpstra foi realizada utilizando software StatXact (Cytel, Cambridge, MA).
Discussão
STAT3 é um oncogene que está hiper-ativado em muitos tipos de câncer, incluindo CECP, onde STAT3 hiper-ativação está associada à diminuição sobrevivência e resistência emergente a terapia direcionada-EGFR. [9,16,17] Os mecanismos potenciais que podem resultar em aumento da ativação da STAT3 no câncer incluem o aumento da sinalização através do receptor ou não do receptor tirosina-quinases a montante, tais como EGFR e JAK, e /ou inactivação de reguladores negativos da STAT3, incluindo tirosina fosfatases de proteína . [18,19] Recentemente, relatou que o receptor de tipo de tirosina-fosfatase de proteína (PTPR) família é frequentemente mutado em HNSCC e outros cancros e demonstraram que as mutações derivadas de CECP PTPRT de induzir a fosforilação da STAT3 e conduzir a sobrevivência das células de carcinoma epidermóide. [4] Como PTPRD representa uma fosfatase receptor-like adicional que visa diretamente STAT3, procurou-se determinar se a perda genética ou epigenética da função PTPRD pode contribuir para STAT3 overactivation para CECP.
No presente estudo, primeiro identificou 18 anteriormente descaracterizados
PTPRD
mutações em tumores CECP. Estas mutações são todos não recorrente e estão localizados ao longo do gene, um padrão que é consistente com o que se observa geralmente em genes supressores de tumor. Nós mostramos que a superexpressão do tipo selvagem PTPRD leva à supressão do crescimento em células de CECP, enquanto que a sobre-expressão de mutantes representativos não, estabelecendo assim uma consequência funcional do
PTPRD
mutação em modelos CECP. Estes achados são consistentes com os do anterior
in vitro através de estudos
vários tipos de cancro, incluindo o glioblastoma, melanoma, cancro colorectal, e o neuroblastoma, onde PTPRD de tipo selvagem foi observado para suprimir a formação de colónias e ao crescimento celular, bem como melhorar a apoptose, enquanto os mutantes PTPRD derivadas de câncer não. [3,6,20] Estes resultados cumulativos sugerem que
PTPRD
mutações em chumbo câncer para perda de sua função supressora de tumor.
A fim de determinar se
PTPRD
mutação afeta a atividade de STAT3, um substrato PTPRD, analisamos dados TCGA e TCPA e descobriram que os tumores CECP com
PTPRD
mutações expressar significativamente elevados pSTAT3 (Y705) em relação ao
PTPRD
tipo -wild tumores. Nós relatado anteriormente uma associação semelhante entre pSTAT3 expressão (Y705) e mutação de um grupo de putativa
genes supressores tumorais PTPR
, incluindo
PTPRD
. [4] Quando cada gene é considerado individualmente, e não como um grupo,
PTPRD
é o único
PTPR
membro da família para a qual mutação é significativamente associada com pSTAT3 expressão (Y705) (S4 Fig) . Este resultado sugere que, embora o número de tumores portadora de uma mutação num único
PTPR
membro da família pode não ser suficiente para detectar uma diferença significativa na expressão pSTAT3 (Y705),
PTPRD
mutação em particular, é unicamente associado com um aumento na pSTAT3 (Y705) expressão que é suficientemente grande para detectar significância estatística. Futhermore, superexpressão de tipo selvagem PTPRD em linhas de células de carcinoma epidermóide abrigar endógena
PTPRD
mutações leva a regulação negativa da pSTAT3 (Y705), confirmando assim que PTPRD regula a ativação STAT3 em modelos CECP. Enquanto de tipo selvagem PTPRD conduz a regulação negativa da pSTAT3 (Y705) em células CECP, a superexpressão da maioria dos mutantes derivados de CECP não altera pSTAT3 (Y705) expressão relativa ao controlo do vector, o que sugere que estas mutações levam a uma perda de função, mas não em uma forma negativa dominante. No caso da mutação L1147F aqui testado, a sobre-expressão em células de CECP leva a um aumento do crescimento, mas não aumentou pSTAT3 (Y705) expressão (ver Figuras 2A e 3D), o que indica que algumas mutações podem levar a fenótipos cancerosos de um modo independente de STAT3 . Estas mutações podem se manifestar através de mecanismos alternativos que podem incluir interações extracelulares ou alteração das afinidades relativas para substratos enzimáticos alternativos.
As
PTPRD
mutação leva a uma maior ativação STAT3 em CECP, próxima testado se as células abrigando um
PTPRD
mutação pode ser mais sensível à inibição da via da STAT3. Aqui demonstramos que as células CECP com uma endógena
PTPRD
mutação são mais sensíveis ao inibidor JAK /STAT JSI-124 do que as células CECP abrigar nenhum
PTPR
mutações familiares, sugerindo que os tumores CECP com
PTPRD
mutações podem ser extremamente sensíveis aos inibidores da STAT3 que estão atualmente em desenvolvimento pré-clínico e clínico. A fim de elaborar uma estratégia de tratamento ideal para pacientes com CECP com
PTPRD
mutações, um estudo mais aprofundado de proteínas adicionais-interagindo PTPRD que podem servir como alvos terapêuticos pode ser justificado. Em particular,
PTPRD
mutação pode, adicionalmente, confere sensibilidade a inibidores de quinase Aurora A actualmente em desenvolvimento clínico, onde Aurora cinase A fosforilação e a estabilidade são normalmente regulados por PTPRD. [3]
Um mecanismo adicional pelo qual
PTPRD
função pode ser perdida é através da regulação negativa do mRNA, inclusive por hipermetilação do promotor ou perda do número de cópias do gene. Primeiro, determinamos que
PTPRD
expressão de mRNA não se correlaciona com a expressão pSTAT3 para CECP, sugerindo que esses mecanismos não são susceptíveis de contribuir significativamente para STAT3 overactivation para CECP. Deve ser notado que esta análise pode ser complicada por vários casos em que pouco ou nenhum
PTPRD
ARNm foi detectada. De facto, os nossos estudos sobre-expressão em células CECP sugerem que a expressão de PTPRD seria esperado para impactar expressão pSTAT3 (Y705). No entanto, essa correlação não surgiu nos tumores CECP analisados até o momento.
Uma análise mais detalhada destes mecanismos próxima revelou que o
PTPRD
promotor não é hipermetilado em CECP em relação ao órgão de correspondência tecido normal, uma descoberta que validado em uma coorte independente do tumor HNSCC e pares normais pareados por PCR específicos de metilação. A disparidade entre os nossos resultados presentes e relatórios anteriores de
PTPRD
metilação do promotor em HNSCC é provavelmente devido à falta antes da comparação entre o tumor e tecido normal. [6] O baixo nível de
PTPRD
metilação do promotor observada em CECP, adicionalmente, não está associada a expressão alterada pSTAT3 (Y705), sugerindo ainda que este evento não contribui de forma significativa para o fenótipo de câncer em CECP. A mesma falta de aberrante
PTPRD
hipermetilação do promotor também tem sido relatada em carcinoma de células escamosas cutâneo, sugerindo que este pode ser um evento raro em várias doenças malignas epiteliais. [21]
A nossa análise dos dados TCGA indica que quase metade dos tumores CECP abrigar uma alteração do número de cópias de
PTPRD
e que a perda do número de cópias é mais frequente do que cópia ganho número na HNSCC e em frente quase todos os cancros analisados.
PTPRD
deleção homozigótica ou heterozigótica também tem sido relatada em carcinoma de células escamosas cutâneo [21,22], GBM [6,20,23,24], câncer de pulmão [25,26], neuroblastoma [27], melanoma metastático [28,29], carcinoma de células escamosas da vulva [30], carcinoma hepatocelular [31], e carcinoma de células escamosas da laringe [5]. É importante ressaltar que nenhuma associação significativa foi detectada entre
PTPRD
copiar o número de alteração e
PTPRD
expressão de mRNA em CECP, sugerindo que a perda do número de cópias não é o principal mecanismo de perda de função PTPRD para CECP.
em conclusão, demonstramos aqui que a mutação somática de
PTPRD
é o principal mecanismo pelo qual a perda PTPRD da função ocorre em CECP. Propõe-se que quase todas estas mutações levam a uma perda de actividade catalítica e, portanto, reduzida a desfosforilação da pSTAT3 substrato (Y705). Enquanto metilação do promotor e copiar perda número são detectáveis no
PTPRD
lugar, esses eventos não são associados com a regulação positiva de pSTAT3 expressão (Y705). Em contraste, a mutação somática de
PTPRD
leva ao aumento da ativação do STAT3 em tumores CECP e linhas celulares, concomitante com o crescimento celular aumentado e sensibilidade à inibição da via STAT3. Estes achados sugerem que
PTPRD
mutação pode representar um biomarcador preditivo de resposta requintado para STAT3 terapia-alvo para CECP.
Informações de Apoio
S1 Fig.
PTPRD
metilação do promotor correlaciona-se com
PTPRD
expressão de mRNA, mas não se correlaciona com pSTAT3 (Y705) expressão em CECP.
(A)
expressão PTPRD
mRNA não é significativamente associada com pSTAT3 expressão (Y705). n = 172, Pearson r = 0,05157, P = 0,5017, R
2 = 0,002659. (B)
PTPRD
metilação do promotor correlaciona-se com
PTPRD
expressão de mRNA. n = 172, Pearson r = -0,5242, P 0,0001, R
2 = 0,2747. (C)
PTPRD
metilação do promotor não está significativamente associado com pSTAT3 expressão (Y705). n = 211, Pearson r = 0,0008795, P = 0,9899, R
2 = 7.735e-007
doi:. 10.1371 /journal.pone.0135750.s001
(TIF)
S2 Fig. MSP análise de amostras tumorais de carcinoma epidermóide representativos.
metilação foi observada em 30/40 tumores (75%) do CECP analisados. M denota primers que amplificam sequências metiladas, enquanto U denota primers amplificar sequências metiladas
doi:. 10.1371 /journal.pone.0135750.s002
(TIF)
S3 Fig. O
PTPRD
promotor não é hiper-metilados em tumores CECP em comparação com a mucosa normal adjacente.
Cinco tumores de CECP e mucosa normal combinado dos mesmos pacientes foram coletadas e analisadas pelo MSP. M denota primers que amplificam sequências metiladas, enquanto U denota primers amplificar sequências metiladas
doi:. 10.1371 /journal.pone.0135750.s003
(TIF)
S4 Fig.
PTPRD
é o único membro da família para a qual mutação está associada à expressão pSTAT3 (Y705) para CECP.
Sequenciamento exome inteiro e de fase reversa dados de matriz de proteínas revelam que nenhum outro
PTPR
mutações familiares estão significativamente associados com pSTAT3 (Y705).