Abstract
microRNA anormal (miRNA) expressão tem sido ligado ao desenvolvimento e progressão de vários cancros humanos, e essa desregulação pode resultar de metilação de ADN aberrante. Embora um pequeno número de miARNs é conhecido por ser regulada por metilação do DNA, que postulado que tal regulação epigenética é mais prevalente. Ao combinar MBD-isolado Genome Sequencing (GAI) para avaliar os padrões de metilação do DNA do genoma e análise de microarray para determinar os níveis de expressão de miRNA, nós sistematicamente procurou miRNAs candidatos regulados por metilação do DNA em linhas celulares de cancro colorrectal. Encontrámos 64 miRNAs ser robustamente metilado em células HCT116; Dezoito deles foram localizados em regiões ou imprinting já relatado a ser regulado por metilação do DNA. Para os restantes 46 miRNAs, os níveis de 18 expressão foram compatíveis com o seu estado de metilação do DNA. Finalmente, 8 miARNs foram supra-regulados por tratamento com 5-aza-2′-desoxicitidina e identificado como sendo novos miARNs regulados por metilação do DNA. Além disso, foi demonstrada a importância funcional destes miARNs epigeneticamente silenciadas por ectopicamente candidatos que expressam seleccione, o que resultou na inibição do crescimento e migração de células cancerosas. Além de relatar estes resultados, o nosso estudo também fornece uma estratégia confiável e sistemática para identificar DNA miRNAs regulados-metilação pela combinação de perfis de metilação do DNA e dados de expressão
Citation:. Yan H, Choi Aj, Lee BH, Ting AH (2011) Identificação e Análise funcional do epigenetically Silenced MicroRNAs em células de cancro colo-rectal. PLoS ONE 6 (6): e20628. doi: 10.1371 /journal.pone.0020628
editor: Axel Imhof, Ludwig-Maximilians-Universität München, Alemanha |
Recebido: 24 Janeiro, 2011; Aceito: 06 de maio de 2011; Publicado: 16 Junho 2011 |
Direitos de autor: © 2011 Yan et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Esses autores não têm apoio ou financiamento para relatar
Conflito de interesses:. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
Os microRNAs (miRNAs) são pequenos, não-codificante. Os ARN que regulam a expressão de genes e desempenham um papel importante em processos celulares normais, incluindo a proliferação, a diferenciação e a apoptose [1]. Tanto a expressão aberrante e silenciamento de miARNs têm sido observadas em cancros humanos, o que sugere possíveis funções oncogénica e supressores do tumor para estes miARNs [2], [3]. A biogénese de miARN envolve a transcrição de um longo transcrito primário (pri-miARN) pela ARN-polimerase II, [4], a clivagem em um produto intermediário (pré-miARN) por Drosha [5], e o processamento final em miARN madura por Dicer [ ,,,0],6]. Cada passo do processo é altamente regulado, e em qualquer nível de desregulação pode resultar em inadequado miARN funções. De particular interesse para o nosso estudo é miARN regulação transcricional por metilação do DNA. Geralmente, a metilação do DNA promotor do gene está negativamente correlacionada com a expressão do gene e pode ser responsável por silenciamento do gene supressor de tumor aberrante numa variedade de cancros humanos [7]. Semelhantes a estes POLR2A proteína transcrita codificação de genes, miRNA transcrição também podem ser silenciados por metilação do DNA promotor.
miRNAs epigenetically silenciados foram descobertos em cancros com base na expressão diferencial entre tecidos e tumores normais ou entre base e DNA desmetilado câncer células. Por exemplo, Bandres
et al.
Identificado pela primeira vez 23 miRNAs que são regulados negativamente em câncer colorretal primário em comparação com o epitélio colorrectal normal de correspondência e, posteriormente, descobriu que miR-129-2, miR-9-1, e miR -137 são silenciados por metilação do DNA no câncer [8]. Toyota
et ai.
Células de cancro colo-rectal HCT116 tratados com o agente de desmetilação, 5-aza-2′-desoxicitidina (5-aza-dC), e os perfis de expressão de miARN comparação entre o das células tratadas e não tratadas para identificar silenciamento de miR-34b /c por hipermetilação do ADN do promotor [9]. Além disso, Lujambio
et al.
Comparou o perfil de expressão de miRNA de células do tipo selvagem HCT116 com a da sua células derivado desmetilado isogênico, DNA metiltransferase -1 e -3b Duplo Knockout (NSO), e encontrou 18 miRNAs-regulada em DKO células [10]. Posteriormente, eles confirmaram que a metilação do DNA é responsável pela silenciamento de miR-124a no câncer de cólon.
Uma busca na literatura utilizando MEDLINE revelou que 16 miRNAs são conhecidos por ser epigenetically silenciados pela metilação do DNA [8], [9 ], [10], [11], [12], [13], [14], [15], [16], [17]. A metilação do DNA refere-se à adição covalente de um grupo metilo para a posição 5 de citosinas, geralmente num contexto dinucleótido CpG em células de mamífero diferenciadas [18]. regiões genómicas com uma elevada densidade de CpG são ilhas CpG denominado e muitas vezes são os sítios de metilação do DNA regulador. Considerando-se que 16% dos miRNAs humanos anotados estão localizados dentro de 1000 pb de uma ilha CpG [19], supomos que a regulação epigenética de miRNAs pode ser mais comum do que o relatado até agora. Estudos anteriores invocado expressão diferencial de miARNs para identificar candidatos para avaliação subsequente epigenética. Esta abordagem introduz viés que limita o número de miRNAs epigenetically regulamentadas que podem ser descobertos. Por exemplo, miARNs específicos de tecido que são regulados por metilação de ADN pode ser equivalentemente metilado em tumores e tecidos normais, o que resulta numa falta de expressão diferencial entre as amostras normais e cancerosos. Além disso, miARNs com baixos níveis de expressão não podem ser identificados de forma fiável porque as diferenças de expressão entre o normal e o cancro ou entre as condições da linha de base e desmetilados provavelmente irá cair abaixo de pontos de corte convencionais (entre 2 e 1,5 vezes). Finalmente, a metilação residual persiste em ambas as células e farmacologicamente geneticamente desmetilados [20]. Tal metilação pode ser crucial na manutenção da viabilidade celular, potencialmente através da repressão persistente de miRNAs chave. Isso resultaria em tais miRNAs não serem identificados por meio de estratégias com base em expressão.
Para superar o viés descoberta introduzida pela estratégia de identificação baseada em expressão, nós diretamente utilizados padrões globais de metilação do DNA para identificar miRNAs regulados por metilação do DNA em HCT116 e células cancerígenas do cólon NSO. Temos anteriormente mapeados metilação do DNA do genoma nestas linhas celulares que usam domínio de ligação metil CpG (MBD) -isolated Genome Sequencing (GAI) [21]. Nós identificado pela primeira vez miRNAs com a metilação do DNA proximal como candidatos. Em seguida, com referências cruzadas a lista de candidatos com dados de expressão de miRNA como elementos de prova. Usando essa abordagem, foram identificados com sucesso ambos os miRNAs regulados por metilação do DNA conhecidos e romance. Aqui nós fornecemos um catálogo mais abrangente de miRNAs epigenetically regulados em células cancerígenas do cólon, demonstrando que a regulação epigenética de miRNAs é predominante nestas linhas celulares de cancro. Além disso, estudos funcionais de escolha miRNAs fornecer relevância biológica para tal regulação epigenética no contexto do câncer de cólon.
Resultados
miRNAs candidatos regulados por metilação do DNA foram identificados por proximal metilação do DNA genômico e expressão de apoio dados
anteriormente Migs usado para construir perfis de metilação do DNA do genoma para a linha celular HCT116 e sua linha de células isogênico desmetilado, DKO [21]. As células NSO são células HCT116 eliminados por metiltransferase de ADN e -1 -3b e reter 5% de metilação de ADN genómico [20]. ADN fracções metilados do genoma foram isoladas por incubação com as proteínas recombinantes, MBD sequenciados num sequenciador Ilumina GAII, e mapeada para trás para o genoma de referência para gerar perfis methylome individuais. Para identificar DNA miRNAs regulados por metilação, que procurou miRNAs com evidência de metilação do DNA dentro de 500 bp de suas posições anotados em HCT116 e as células NSO. Usando essa abordagem, foram identificados 64 miRNAs candidatos para posterior análise (Figura 1).
Dos 64 miRNAs candidatos, 13 foram relatados para ser regulada por metilação do DNA (Tabela S1). Outra 5 pertence a um conjunto de miARN grande localizado no humano DLK1-GTL2 imprimido domínio em 14q32 e são silenciados no cromossoma paterno por metilação de ADN [22]. Portanto, nós nos concentramos sobre os restantes 46 miRNAs que não foram relatados a ser regulado por metilação do DNA para validação detalhado. Primeiro, foram selecionados aleatoriamente 6 miRNAs para análise seqüenciamento bissulfito para verificar o estado de metilação do DNA detectado pelo GAI (Figura 2 e Figura S1). Os dados de seqüenciamento bissulfito corroborou os dados MiGs em tudo 6 loci.
seqüenciamento bissulfito foi realizado para miR-941, (B) miR-1237, e (C) miR-1247 em células HCT116 (A) parentais , células HCT-116 tratadas com 5 uM de 5-aza-dC durante 48 h, e as células NSO. A captura de tela do navegador do genoma UCSC mostra o sinal de metilação do DNA em cada amostra. Os rectângulos marcar as regiões validados pelo seqüenciamento bissulfito. Cada círculo representa um dinucleótido CpG. círculos a preto representam citosinas metiladas, enquanto os círculos a branco representam as citosinas não metiladas.
Em seguida, nós concluímos que a perda de metilação do DNA em células NSO, quando comparado com as células HCT116 deve resultar num aumento da expressão dos miARNs candidatos, enquanto a retenção de a metilação do DNA deve correlacionar-se com silenciamento persistente dos miARNs candidatos. Portanto, foi examinada a expressão de dados de microarray para os 46 candidatos em HCT116 e células NSO (Tabela S2). Usando mudança de 1,5 vezes como o nosso limite, identificamos 18 miRNAs como tendo dados de expressão compatíveis com o seu estado de metilação de DNA em HCT116 e as células NSO (Tabela S1). Foram realizadas análises específicas de miARN quantitativo em tempo real de RT-PCR (miR-qRT-PCR) para 6 seleccione miARNs para verificar os dados de expressão determinados por o micro-arranjo (Figura S2). Os resultados miR-qRT-PCR confirmou os dados de microarranjos para os 6 miRNAs, que incluíram ambos os miRNAs conhecidos e DNA candidato metilação regulamentados. Portanto, com base empírica metilação de ADN genómico e de suporte de dados de expressão de micromatriz, identificou-se 18 novos candidatos miARNs que pode ser regulado transcricionalmente por metilação do DNA.
miARNs candidatos re-expresso após tratamento com 5-aza-2′-desoxicitidina
para validar que os miARNs candidatos foram efectivamente regulada por metilação do DNA, que tratada HCT116, RKO, e células cancerígenas do cólon DLD1 com o agente de desmetilação 5-aza-2′-desoxicitidina (5-aza-dC) a determinar se estes miARNs são re-expressos após o tratamento com 5-aza-dC. Como metilação de ADN regula a expressão do gene ao nível da transcrição, que ensaiado quanto à expressão dos miARNs primárias (Pri-miARN) por tempo real de RT-PCR [23]. incluído Pri-miR-193a, -9-3, e -375, que eram conhecidas por ser regulado transcricionalmente por metilação do DNA em células HCT116 [8], como controlos positivos e Pri-miR-1224, que foi desmetilado mas permaneceu silenciados em células NSO neste estudo, como um controlo negativo. Testamos 17 dos 18 novos candidatos porque nenhum dos iniciadores concebidos para miR-1234 produziu produtos de PCR bem sucedidas. Em células HCT116, descobrimos 11 de 17 miARNs ser significativamente regulada para cima depois de tratamento com 5-aza-dC (Figura 3A). Nós ainda confirmado independentemente todos os 11 candidatos nas células RKO (Figura 3B) e 10 dos 11 candidatos nas células DLD1 (Figura 3C). Para verificar que a sobre-regulação destes miARNs foi consequente a desmetilao do ADN após 5-aza-dC tratamento, avaliou-se as alterações no estado de metilação do DNA nas regiões proximais de miR-941-1/3, miR-1237 e miR-1247 por sequenciação genómica bissulfito (Figura 2). A desmetilação foi observada nestes loci em células HCT116 tratados com 5-aza-dC, apoiando que a re-expressão observada foi devida a desmetilao do ADN.
análise em tempo real de RT-PCR foi realizada para avaliar primária candidato miARNs (Pri-miARNs) níveis em (a) HCT116, (B) RKO, e células (C) DLD1 antes e após o tratamento com 5? M de 5-aza-dC durante 48 h. miR-1224 foi incluído como um controlo negativo. miR-193a, o miR-375 e miR-9-3 foram incluídos como controlos positivos. * Indica aumento significativo na expressão de Pri-miARN após o tratamento com 5-aza-dC (p 0,05). Expressões de miRNAs foram internamente normalizada para os níveis de expressão de
GAPDH
e expressão normalizada para cada miRNA antes dos 5-aza-DC tratamentos foi definido como 1.
Finalmente, miRNAs intr�icas pode ser co-transcrito a partir de promotores de genes de hospedeiro e, portanto, não são regulados independentemente ao nível da transcrição [24], [25]. Assim, para compreender plenamente o significado da metilação do DNA foi observado para os nossos 10 miRNAs candidatos, examinamos os contextos genômicos dos 10 candidatos mais de perto (Tabela 1). miR-1247, miR-1826, e miR-219-2 estão localizados em regiões intergênicas e, portanto, não são susceptíveis de ser co-regulado por um promotor do gene host. Os restantes 7 candidatos estão localizados em íntrons de RefSeq ou EST transcrições e foram mais estudada. Com base nos perfis de metilação do genoma, nenhum dos putativos genes do hospedeiro, excepto para o ARN não codificadora
ANKRD30BL
, tem a metilação do DNA significativa os seus promotores (Tabela 1 e Figura S3), o que sugere que estes putativos genes do hospedeiro não estão regulamentados por metilação do DNA promotor.
no entanto, postulamos que se a transcrição do gene putativo hospedeiro determina a expressão dos miARNs candidatos embutidos, que deve detectar um aumento da expressão génica do hospedeiro após 5- tratamento aza-dC em células HCT116, RKO e DLD1. Tais aumentos na expressão do gene hospedeiro corresponderiam aos aumentos observados para os miARNs incorporados nestas mesmas células após o tratamento com 5-aza-dC. Por outro lado, se os genes do hospedeiro putativos não respondem a 5-aza-dC tratamento do mesmo modo que os miARNs incorporados, os miARNs são provavelmente transcritos de forma independente a partir dos genes putativos hospedeiras. Neste último cenário, a metilação do DNA descobrimos perto dos miRNAs seriam mais significativas em sua regulação da transcrição. Com base nos resultados de qRT-PCR, determinou-se que o miR-1237, o miR-602, miR-941-1, miR-941-3, e miR-663b são transcricionalmente independente dos respectivos genes do hospedeiro putativos (Figura 4). A expressão de
ANKRD30BL
, o gene putativo de acolhimento para miR-663b, não era detectável, antes ou depois de experiências de 5-aza-dC e, portanto, não representados na Figura 4. Para o miR-24-1 e miR- 27b, os dados são menos conclusivos, e nós não podia excluir que estes dois mi-RNAs podem ser co-sintetizado com o gene hospedeiro,
C9orf3
[26]. No total, foram identificados e confirmados pelo menos 8 novos miARNs que são transcricionalmente regulados pela metilação do DNA.
análise em tempo real de RT-PCR foi realizada para avaliar a expressão do gene putativo hospedeiro em resposta a 5-aza-dC tratamentos em HCT116 (azul), RKO (rosa escuro) e DLD1 (amarelo). As alterações na expressão de miARN incorporado também foram representados graficamente para comparação lado-a-lado. Todas as expressões foram internamente normalizada para os níveis de expressão de
GAPDH
e expressão normalizada para cada gene hospedeiro e miRNA antes dos tratamentos 5-aza-DC foi definido como 1.
miR- crescimento 941 e miR-1247 celular Repressão e migração em células de cancro do cólon
Nós procedemos para testar as funções biológicas destes miRNAs epigenetically regulamentados para obter insights sobre a relevância da sua metilação do DNA em células de câncer de cólon. Para determinar se a expressão destas miARNs epigeneticamente silenciados iria afectar o crescimento de células de cancro e migração, as células transfectadas com HCT116 imita miARN de miR-941 (a forma madura de miR-941-1 e -3), miR-1237, miR-1247 , e um controlo negativo não codificante (AllStars Neg.).
primeiro, foi realizada análise da curva de crescimento (Figura 5A) e o ensaio de MTT (Figura 5B) para avaliar o crescimento das células e a aptidão metabólica. Descobrimos que a expressão ectópica de miR-1247 resultou numa redução significativa no crescimento celular HCT116 e actividade metabólica, como medido pelos dois ensaios, respectivamente. ensaio de incorporação de BrdU verificadas independentemente que o crescimento diminuiu o metabolismo e é provavelmente uma consequência da diminuição da proliferação nestas células (Figura 5C). Observou-se uma redução semelhante na proliferação celular e função metabólica em células cancerígenas do cólon DLD1 transfectadas com miR-1247 mímica (Figura S4A e B). Por outro lado, em células NSO, onde miR-1247 já é desmetilado e re-expressas, transfecção com imita miR-1247 adicionais não tem quaisquer efeitos sobre o crescimento celular e metabolismo (Figura S5A e B). Estas observações sugeriram que o miR-1247 podem ser do tumor-supressor no cancro do cólon e do seu silenciamento epigenético é, por conseguinte, benéfico para o crescimento do cancro.
As curvas de crescimento (A) e (B) Ensaios de MTT de células HCT116 e HCT 116 falsamente transfectadas As células transfectadas com não-codificante controle negativo miRNA (AllStars Neg.), miR-941, miR-1237, ou imita miR-1247. ensaio de incorporação (C) BrdU de células HCT116 falsamente transfectadas e células HCT116 transfectadas com não-codificante controle negativo miRNA (AllStars Neg.), miR-941 ou miR-1247. Um campo de representante para cada condição experimental é mostrado. O gráfico de barras que representa a percentagem média (%) de células positivas para BrdU. (D) ensaio de cicatrização de feridas para simulados transfectadas células HCT116 e células transfectadas com controle negativo (AllStars Neg.), MiR-941, miR-1237, ou imita miR-1247. As fotografias foram tiradas imediatamente após o ferimento e 16 horas mais tarde. Os resultados foram quantificadas e normalizadas para as células falsamente transfectadas. ensaios (E) Transwell de migração para simulados transfectadas células HCT116 e células transfectadas com controle negativo (AllStars Neg.), miR-941, ou imita miR-1247. campos representativos de células invasivas sobre a membrana são mostrados. O gráfico de barras que representa o número médio de células na parte inferior das membranas em cada tratamento normalizadas para zombar células transfectadas.
Além disso, os alvos computacionalmente previstos de miR-941 e miR-1247 incluídos vários genes envolvidos na migração celular e invasão. Por exemplo, o ADAM metalopeptidase domínio 15 (
ADAM15
) é um alvo previsto de miR-1247 e codifica uma glicoproteína transmembranar importante para a adesão de células [27]. Nós postulado que a sub-regulação destes objectivos previstos pela expressão ectópica de miR-941 e miR-1247 teria um impacto negativo da migração celular. Por isso, testámos os efeitos de expressão ectópica de miR-941, miR-1237, e miR-1247 sobre a mobilidade celular em células HCT116. Em ensaios de cicatrização de feridas, as células HCT116 transfectadas com miR-941 e miR-imita 1247 foram significativamente prejudicados na sua capacidade de repovoar áreas feridos quando comparado a simulação, controle negativo, ou miR-1237 células transfectadas (Figura 5D). Estas observações foram ainda confirmada utilizando o ensaio de migração Transwell (Figura 5E). Finalmente, os efeitos supressivos semelhantes sobre migração celular foram observadas de forma independente em células DLD1 (Figura S4C) e as células NSO (Figura S5C) transfectadas com miR-941 e miR-imita 1247. No seu conjunto, estas observações sugerem que o silenciamento epigenético de miR-941 e miR-1247 pode facilitar a migração de células de cancro do cólon e invasão.
Discussão
Os microRNAs são importantes moléculas reguladoras que modulam a expressão de genes em ambos os processos de desenvolvimento e doenças. A sua regulação é, por conseguinte, um componente crítico para a compreensão de cada contexto biológico. A metilação do DNA genómico foi demonstrado que regulam a transcrição de um punhado de miARN no cancro. Estes estudos anteriores voltados para a identificação de DNA miRNAs regulados por metilação contou com triagem para miRNAs diferencialmente expressos de câncer e comparações normais ou re-expressão de miRNAs em DNA desmetilado condições. Uma abordagem baseada em expressão introduz um viés descoberta contra miRNAs equivalentemente metilados, portanto, equivalente silenciados, nos grupos de comparação. Este tipo de miRNA epigenetically regulamentado poderia ainda ser importante para o desenvolvimento do câncer. Por exemplo, miARNs equivalentemente silenciados em normal e cancro pode ser significativa para o cancro de um modo específico do tecido. Além disso, a metilação do DNA residual em condições desmetilação induzidas poderiam sustentar silenciamento dos miRNAs críticos, resultando em falta de expressão diferencial detectável e não identificação dessas miRNAs epigenetically regulamentados. Finalmente, miRNAs com expressão diferencial marginal abaixo dos limites típicos também seriam perdidos quando a seleção se baseia unicamente na expressão diferencial.
Para superar os preconceitos acima e identificar de forma mais abrangente de DNA miRNAs regulados por metilação no câncer de cólon, nós analisamos para miRNAs candidatos com base na evidência empírica de metilação do DNA genômico em células HCT116 e câncer de cólon DKO. Nós sistematicamente procurou o DNA methylome mapas gerados por Migs nessas células para miRNAs localizados dentro de 500pb de sinais de metilação do DNA. Encontrámos 64 candidatos, dos quais 5 miRNAs conhecidos impressos, 13 de ADN conhecidos miRNAs regulados por metilação, e 46 novos candidatos. Posteriormente, confirmou-se que 8 novos candidatos foram efectivamente regulados por metilação do DNA em HCT116, NSO, RKO e células cancerígenas do cólon DLD1. Juntamente com a detecção de miRNAs DNA-metilação regulados conhecidos, nosso estudo identificou um total de 26 miRNAs epigenetically regulamentados, o que demonstra que a nossa abordagem é eficaz e eficiente.
É importante notar que nós ainda pode estar faltando DNA miARNs regulada à metilação de derivados transcritos primários longos. Estudos anteriores focados em miRNAs com as suas sequências de haste-laçada incorporados em ou perto de ilhas CpG, e nosso estudo incidiu sobre miRNAs com DNA metilação proximal com as sequências de haste-laço. Embora estas estratégias semelhantes para permitir que o rastreio sistemático, eles provavelmente subestimam o número total de miARNs regulados por metilação do DNA, porque de iniciação da transcrição para os miARNs primárias pode ser medida a montante da sequência em ansa pedunculada. Por exemplo, o transcrito primário de miR-21 é 3433 nucleótidos de comprimento enquanto que o miR-21 madura é codificada pelos resíduos 2516 até +2445 em células HeLa [28]. . Recentemente, Chim
et al
informou que miR-34a foi regulamentado pela metilação do promotor CpG DNA ilha localizada 30 kb a montante do maduro miR-34a [29]. Portanto, mais miRNAs pode ser regulamentada por metilação do DNA promotor, mas não vai ser facilmente identificados utilizando uma abordagem sistemática que depende do genoma anotação atual.
Foram examinados ainda mais a relevância biológica do silenciamento epigenético do DNA recém-identificado miARNs regulada por metilação. Estamos focados em dois aspectos importantes do desenvolvimento do câncer, o crescimento ea migração, e selecionou miR-941, miR-1237, e miR-1247 para estudos funcionais. A expressão ectópica de miR-1247 reduziu significativamente a proliferação de células de cancro e de migração em HCT116 e células DLD1, sugerindo que o miR-1247 pode funcionar como um supressor do tumor. Estas observações são consistentes com as funções de vários alvos previstos de miR-1247 (https://www.microrna.org). Por exemplo, Citron (CIT), uma serina /treonina quinase, está presente no sulco de clivagem e o meio do corpo durante a citocinese e é essencial para abscisão celular [30], [31]. O CIT também regula a /M transição G2 em hepatócitos de rato [32], e derrubar CIT inibiu a proliferação de células de carcinoma hepatocelular [33]. Um outro alvo potencial para o miR-1247 é FosB, que dimeriza com a proteína Jun a activar a transcrição de proteases envolvidas na migração e invasão do tumor [34]. Finalmente, a glicoproteína transmembranar, ADAM15, também pode ser alvo de miR-1247, para facilitar a metástase do cancro da próstata [35]. Estes objectivos computacionalmente previstas terão de ser empiricamente validado no futuro.
Interessantemente, em células NSO, em que o miR-1247 é desmetilado e expressos em níveis mais elevados do que as células HCT-116, a exposição adicional a imita o miR-1247 não resultam em diminuições de crescimento celular, mas causou migração prejudicada. As discrepâncias entre os fenótipos de expressão de miR-1247 ectópica em HCT116, as células DLD1 e NSO pode refletir as diferentes concentrações em que as funções celulares distintas são modulados por miR-1247. Alternativamente, pode ser devido à presença de diferentes metas para miR-1247 em HCT116 e células NSO. Estas duas possibilidades vai exigir estudos adicionais para esclarecer.
Enquanto miRNAs diferencialmente metilados e expressas são importantes para o desenvolvimento do câncer, propusemos que a metilação do DNA residual em condições desmetilados, como em células NSO, também pode ser crítica. Nosso estudo funcional do miR-941 fundamentado esta hipótese. Verificou-se que a sobre-expressão de miR-941 foi capaz de inibir significativamente a migração celular em ambas as células NSO e HCT116 e, adicionalmente, em células DLD1. Este resultado é razoável considerando vários alvos prioritários previstos de miR-941 estão relacionadas com a migração celular. Por exemplo, a matriz da metalopeptidase 24 (MMP24) é um alvo prevista para miR-941, e que facilita a remodelação de tecidos e a migração de células do endométrio em pacientes de endometriose [36]. Semelhante tipo de DNA miRNAs regulados por metilação seria perdida por abordagem baseada na expressão anterior, mas poderia ser facilmente capturado por nosso desenho do estudo. Seis dos 8 romance miRNAs epigenetically regulamentados identificados em nosso estudo manteve a metilação do DNA proximal em células NSO, onde . 5% metilação do DNA genômico é deixado em comparação com as suas células HCT116 parentais
Em resumo, a nossa abordagem à DNA Descubra miRNAs regulados por metilação rendeu um número de candidatos previamente desconhecidas. Mostrámos através da expressão ectópica e ensaios funcionais que, pelo menos, dois destes miARN pode ser particularmente importante na progressão tumoral. Nosso método é um complemento útil para a abordagem tradicional de usar um esquema baseado em expressão para identificar novos miRNAs silenciados por metilação do DNA.
Materiais e Métodos
Cultura celular e tratamento medicamentoso
colorrectal linhas celulares de cancro HCT116, DLD1, RKO e NSO células [25] foram cultivadas em meio de McCoy 5A (Invitrogen, San Diego, CA) contendo soro de bovino fetal a 10% (Gibco, Grand Island, NY) a 37 ° C em 5% de CO
2 atmosfera. As células foram colhidas por raspagem, e os sedimentos celulares foram lavados duas vezes com PBS (Gibco, Grand Island, NY). O ARN total foi isolado utilizando Trizol (Invitrogen, San Diego, CA) de extracção de acordo com as instruções do fabricante. O RNA total foi igualmente tratado com ADNase I (Roche, Indianapolis, IN) para remover quantidades vestigiais de DNA genómico residual. O ADN genómico foi extraído a partir de sedimentos de células por incubação das pelotas em soluções contendo 0,5 mg /ml de proteinase K, SDS a 2%, e Tris-HCl a 20 durante a noite a 55
oC, com agitação, seguido por extracção com fenol-clorofórmio e precipitação com etanol. Para 5-aza-2′-desoxicitidina (5-aza-dC) tratamentos, as células foram semeadas a 5 x 10
5 células por 100 mm de prato de 24 h antes da adição de 5-aza-dC (Sigma, St Louis, MO). As células foram tratadas com 5? M de 5-aza-dC durante 48 horas antes da colheita.
MBD-isolado Genome Sequencing dados análise
Genome-wide metilação do DNA de dados para células HCT116 e NSO foram obtidos anteriormente através da realização de MBD-isolado Genome Sequencing (GAI) [21]. O sequenciamento cru lê pode ser baixado a partir do NCBI Curto Leia Archive (SRA # SRP001414). O número mínimo de sequenciação lê os sinais que indicam a metilação do DNA significativa foram determinadas como anteriormente descrito. miRNAs anotados (Hg18, NCBI Construir 36,1), localizado a cerca de 500 pb de metilação do DNA significativa foram identificados como candidatos para análises subsequentes.
miRNA análise microarray
perfil de expressão miRNA-base Microarray foi realizada utilizando o Illumina expressão MicroRNA humana profiling painel V2 de acordo com as instruções do fabricante. O ser humano v2 painel miRNA contém 1.146 ensaios, para a detecção de ~97% dos miRNAs descritos no banco de dados miRBase (Sanger miRBase, v9.1, libertação fevereiro de 2007). O processamento de dados foi realizada em GenomeStudio v2009.1 (Illumina, San Diego, CA). experiências em triplicado foram realizadas para cada linha celular. Os dados de cada experiência foram normalizados utilizando o método descrito anteriormente [37]. Para a comparação HCT116 contra DKO,
t
teste de Welch foi realizada com um
p
de corte de 0,05 e correcção de testes múltiplos -valor pela taxa de detecção falso (FDR). Os dados da matriz microRNA (GEO # GSE26819) pode ser acessado a partir do site do Gene Expression Omnibus.
seqüenciamento bissulfito
1 mg de DNA genômico de cada amostra foi bisulfite convertido utilizando o kit EpiTect (Qiagen , GmbH, Hilden) seguindo o protocolo do fabricante. As condições de PCR e sequências iniciadoras são fornecidos na Tabela S3. Os amplicons de PCR foram purificados em gel e subclonado em pCRII-TOPO vector (Invitrogen, Carlsbad, CA). Pelo menos oito clones foram selecionados aleatoriamente e sequenciados em um analisador de DNA ABI3730xl para averiguar os padrões de metilação de cada locus.
Detecção de expressão madura e miRNAs primários por RT-PCR quantitativo
A expressão de maturidade miARNs foi determinada utilizando o kit de QuantiTect SYBR Green RT-PCR (Qiagen, GmbH, Hilden) e foi normalizado para a expressão snoRNA U6 endógena utilizando o 2
-ΔΔCt método de [38]. Resumidamente, 100 de ARN tratado com ADNase ng de cada amostra foi adicionado a 10 ul da 2 × SYBR Green PCR Master Mix, 0,2 ul de RT-mistura, 200 nM de cada iniciador, e água isenta de RNase para um total de 20 ul. Para a expressão de miARN primária, GAPDH foi usada como o controlo de normalização. A expressão de cada miARN primário em relação ao GAPDH também foi determinada usando o 2
-ΔΔCt método. As sequências iniciadoras para a detecção de miARNs maduros e primários foram desenhados como descrito anteriormente [23], [39] e listados na Tabela S3. A média de experiências em triplicado foi representada graficamente com desvios padrão representados por barras de erro.
Detecção da expressão do gene putativo hospedeiro por
A expressão de genes do hospedeiro putativos RT-PCR quantitativo
foi determinada utilizando RT QuantiTect SYBR Green -PCR kit (Qiagen, GmbH, Hilden) e foi normalizado para GAPDH internamente. A expressão relativa, após tratamento com 5-aza-dC foi calculada utilizando a 2
-ΔΔCt método. O ARN foi extraído da mesma maneira como descrito acima. As sequências dos iniciadores estão listadas na Tabela S3. A média de experiências em triplicado foi representada graficamente com desvios padrão representados por barras de erro.
A expressão ectópica de miARNs
A sobre-expressão de miR-941, miR-1237, e miR-1247 em HCT116, NSO, e DLD1 células foi obtida por transfecção das células com 20 duplexes nM miRNA que imitavam os maduros miR-941 (MSY0004984, Qiagen), miR-1237 (MSY0005592, Qiagen) e miR-1247 (MSY0005899, Qiagen). O AllStars Negativo ARNsi de controlo (1027281, Qiagen) foi incluído como um controlo negativo.