Abstract

O cancro do pulmão (LC), com seus diferentes subtipos é geralmente conhecido como um cancro resistente ao tratamento com a maior taxa de morbidade em todo o mundo. Terapia resistência de um tumor é pensado para ser relacionada com cancro de células estaminais (CSCs), dentro dos tumores. Houve indicações de que o câncer de pulmão é propagado e mantido por uma pequena população de CSCs. Para estudar esta questão, estabelecemos um painel de 15 linhas celulares de cancro primário do pulmão (PLCCLs) de 20 tumores primários frescas utilizando um sistema de cultura isento de soro robusta. Nós posteriormente focado na identificação dos CSCs pulmonares estudando essas linhas celulares derivadas de 4 subtipos representativos de câncer de pulmão, como o cancro do pulmão de pequenas células (CPPC), carcinoma de grandes células (LCC), carcinoma espinocelular (CEC) e adenocarcinoma (AC). Identificamos uma pequena população de células fortemente positivas para CD44 (CD44

alto) e uma população principal, que era ou fracamente positivo ou negativo para CD44 (CD44

baixo /-). Co-expressão de CD90 ainda mais reduzida da população de células-tronco putativo na PLCCLs de SCLC e LCC como células esferóides-formação foram encontradas principalmente dentro do CD44

highCD90

+ sub-população. Além disso, estes CD44

highCD90

+ células morfologia mesenquimal revelado, o aumento da expressão de marcadores mesenquimais

N-caderina e

vimentina

, aumento dos níveis de mRNA dos genes em células estaminais embrionárias relacionados

Nanog

e

Oct4

e aumento da resistência à irradiação em comparação com outros sub-populações estudadas, sugerindo a CD44

highCD90

+ população um bom candidato para os CSCs pulmonares. Ambos CD44

highCD90

+ e CD44

highCD90

– células do PLCCL derivados do SCC formado esferóides, ao passo que os CD44

Baixa /- células foram sem este potencial. Estes resultados indicam que CD44

highCD90

+ sub-população pode representar CSCs em SCLC e LCC, enquanto que no SCC pulmão subtipo de câncer, os potenciais CSC foram encontrados dentro do CD44

alta sub-população.

Citation: Wang P, Gao Q, Suo Z, Munthe E, Solberg S, Ma L, et al. (2013) Identificação e caracterização de células com cancro da Stem Cell Properties em linhas celulares de cancro primário do pulmão humano. PLoS ONE 8 (3): e57020. doi: 10.1371 /journal.pone.0057020

editor: Dean G. Tang, da Universidade do Texas M.D Anderson Cancer Center, Estados Unidos da América

Recebido: 26 de junho de 2012; Aceito: 21 de janeiro de 2013; Publicação: 04 de março de 2013

Direitos de autor: © 2013 Wang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por uma concessão do Norwegian Research Council (SFI-CAST). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a teoria “de células-tronco do câncer” (CSC) implica uma organização hierárquica dentro do tumor em que CSCs representa o ápice da hierarquia. Semelhante a células estaminais normais, CSCs têm a capacidade de se submeter a auto-renovação, bem como a divisão celular assimétrica. Estas características-chave permitir CSCs para iniciar e manter tumores. Para além do termo clássico, isto é, CSC, vários termos têm sido utilizados na literatura científica recente descrever as características essenciais da CSCs tais como a auto-renovação e tumor de início /manutenção das propriedades. Entre outros, são termos como célula iniciar tumor (TIC), de células de câncer de iniciar (CIC) e tumor propagação de células (TPC). Neste relatório, vamos utilizar o termo CSC para caracterizar células que foram capazes de iniciar e sustentar a formação de tumores em animais e de cultura líquido de longo prazo.

Os estudos atuais no campo da investigação em células estaminais câncer forneceram evidências crescentes para a existência e identificação de CSCs usando vários biomarcadores específicos, como o CD44, CD133 e CD90. Estes marcadores têm sido amplamente aceites para o isolamento de CSCs em malignidades hematológicas humanos [1], [2], assim como em tumores sólidos [3] – [11]. Além disso, os CSCs foram encontrados para ser mais resistentes à quimioterapia e radioterapia convencional que a maior população de células de cancro mais diferenciados, o que indica que o CSCs podem permanecer em tumores residuais após o tratamento e contribuem para a recorrência de cancro e espalhamento. CSCs Portanto, novos tratamentos visando podem potencialmente prevenir a recorrência do tumor e prolongar a sobrevida dos pacientes. A transição epitelial-mesenquimal (EMT) desempenha um papel importante no desenvolvimento embrionário [12]. Isso faz com que as células epiteliais a perder o seu comportamento epitelial, alterando a sua morfologia e propriedades celulares a assemelhar-se células mesenquimais [13]. EMT tem sido sugerido para contribuir para o crescimento invasivo e metastático de diversos tipos de cancros [14] – [17]. estudo recente mostrou que as células semelhantes a células-tronco de cancros epiteliais ter um fenótipo mesenquimal marcadores expressas associadas a EMT [15].

O cancro do pulmão é a principal causa de mortalidade relacionada ao câncer em todo o mundo, e tem um prognóstico ruim, com as taxas de sobrevida em 5 anos de aproximadamente 15%. De acordo com a heterogeneidade histológica, carcinomas pulmonares são classificados em quatro subtipos principais: cancro do pulmão de pequenas células (CPPC), carcinoma de células escamosas (SCC), carcinoma de grandes células (LCC) e adenocarcinoma (AC). Neste estudo, seguindo a hipótese “Cancer Stem Cell”, enfocamos a identificação e caracterização de CSCs em subtipos mencionados acima de câncer de pulmão.

O marcador da superfície celular CD133 foi previamente identificado como um marcador confiável para CSCs em alguns dos subtipos de câncer de pulmão [18]. No entanto, a confiabilidade deste marcador como um marcador CSC para câncer de pulmão foi recentemente contestada [19]. Portanto, voltada para outro marcador, isto é, CD44, o qual tem sido sugerido para caracterizar CSCs em mama, próstata, cabeça e pescoço, colo-rectal, pancreático e cancros gástricos [3], [4], [9] – [11], [ ,,,0],20].

neste estudo, aproveitamos os tecidos de câncer de pulmão primário removidas durante a ressecção e focado em estabelecer de PLCCLs de tumores recentemente isolados. Assumiu-se que PLCCL pode proporcionar uma fonte mais representativas e adequadas de células de cancro que podem ser utilizados para a identificação de células ou populações de células com propriedades semelhantes a células estaminais. Em primeiro lugar, estabelecida com sucesso um painel de linhas celulares de cancro primário do pulmão de espécimes obtidos de fresco de os principais subtipos de cancro do pulmão. Baseado em fenotípica detalhada e análise funcional de linhas celulares representativas de SCLC, LCC e SCC, nós fornecemos evidências que indicam que CD44

elevada população pode abrigar CSCs nestes subtipos de câncer. Além disso, a co-expressão de CD90 ainda mais reduzida população de CSCs em SCLC e LCC. A imagem para AC, no entanto, continua a ser menos clara, e na atualidade não temos nenhuma evidência convincente de que qualquer um dos marcadores, ou seja, CD44 e CD90, é característica para CSCs neste subtipo de câncer particular.

Materiais e Métodos

Recolha de amostras tumorais e estabelecimento de linhas celulares de cancro de pulmão primário

Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética Regional e do Conselho de Oslo University Hospital de revisão Institucional e realizada de acordo com as diretrizes da Convenção de Helsínquia. Mediante consentimento informado assinado, tecidos de câncer de pulmão humano foram obtidos de 20 pacientes com câncer de pulmão primário (faixa etária 55-81 anos) submetidos a lobectomia ou pneumonectomia no Hospital Universitário de Oslo de julho de 2007 a outubro de 2009. O diagnóstico histológico foi determinado com base em características microscópicas de células de carcinoma (Tabela 1).

tecido tumoral obtidos de fresco (dentro de 1-2 horas após a remoção cirúrgica) lavou-se em meio RPMI-1640 (Invitrogen, EUA) contendo penicilina-estreptomicina (PS, penicilina 100 U /ml e estreptomicina 100 ug /ml; Lonza, Bélgica). Os vasos sanguíneos e do tecido conjuntivo foram removidos cuidadosamente e a parte cancerosas foi, em seguida, triturada em pequenos pedaços, em seguida, menos de 1 mm

3 usando bisturi, seguido por extensa lavagem em meio RPMI-1640 e centrifugação a 300 g durante 5 min. Finalmente, as células foram re-suspensas em RPMI-1640 contendo colagenase II (Invitrogen, EUA), na concentração de 200 U /ml e digerida durante 2-4 horas a 37 ° C numa incubadora humidif içada. A digestão enzimática foi parada quando a maioria das células eram células na suspensão única. Após a lavagem em meio RPMI-1640 e 3x centrifugação a 300 g durante 5 minutos, as células foram transferidas para frascos de cultura de tecido padrão revestidos (Corning Life Sciences, USA) e cultivadas na Definido de queratinócitos-soro Free Medium (DK-SFM) complementado com L -glutamina (Invitrogen, EUA), EGF 20 ng /ml, FGF básico-10 ng /mL (PeproTech Inc., USA), 2% B27 (Invitrogen, EUA), PS e anfotericina B (0,25 ug /mL; Invitrogen, EUA). As culturas de todas as PLCCLs foram mantidas a 37 ° C numa incubadora humidificada com 5% de CO

2. O meio de cultura foi mudado a cada 2-3 dias. As células foram passadas depois da separação com TrypLE ™ Express (Invitrogen, EUA), quando as células atingiram 80-90% de confluência. Todos os estudos foram realizados com os primeiros cinco passagens de PLCCLs estabelecidos.

Isolamento de ácido nucleico e DNA fingerprinting ensaio

Para estabelecer uma impressão digital genética para cada uma das novas linhas de células, o ensaio de DNA fingerprinting foi realizada nos PLCCLs representativos (LC004, LC006, LC007 e LC021), bem como sobre uma linha de células estabelecida a partir de re-xenoenxerto de LC021. O ADN genómico foi isolado a partir de solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS, Invitrogen) peletes de células lavadas. O ADN genómico total foi obtido usando o kit de tecido NucleoSpin (Macherey-Nagel, Alemanha) de acordo com o protocolo do fabricante. A identidade dos perfis de ADN foi determinada pelo perfil STR usando PowerPlex 16 Sistema (Promega, Madison, WI). Este kit amplifica loci STR 15 e amelogenina para identificação de gênero: Penta E, D18S51, D21S11, TH01, D3S1358, FGA, TPOX, D8S1179, SVA, Amelogenina, Penta D, CSF1PO, D16S539, D7S820, D13S317 e D5S818. Os produtos de PCR foram tamanho determinado em MegaBACE 1000 (Applied Biosystems, EUA) utilizando o software Fragmento Profiler (GE Healthcare). Estas impressões digitais foram então comparados aos perfis de ADN em um banco de dados de impressões digitais de linhas celulares de cancro do pulmão previamente estabelecido para garantir a sua singularidade.

Imunohistoquímica

As linhas de cultura principal de células de câncer de pulmão foram incluídos em blocos de parafina por o seguinte método: as células a partir da cultura líquida foram separadas e lavadas com DPBS e, subsequentemente, centrifugado a 300 g durante 5 minutos. O sobrenadante foi cuidadosamente removido antes de 3 gotas de plasma e 2 gotas de trombina foram adicionados e misturados por rotação do tubo. formalina tamponada (4%) foi adicionado, depois a mistura foi coagulada. A massa coagulada foi então colocada em papel de linho antes de ser incorporado em blocos de parafina por procedimento padrão. Algumas seções foram coradas com hematoxilina e eosina (H E) para avaliar a morfologia celular, enquanto outras secções foram utilizados para análise imuno-histoquímica (IHQ). Quatro seções espessas micrômetro foram desparafinados e hidratadas em etanol graduado. Para desmascarar os epítopos, os cortes foram, em seguida, microondas em diferentes tampões otimizados para diferentes anticorpos. baixo pH 10 mM foi utilizado tampão citrato (pH = 6.0) para P53 anticorpos, Ber-EP4 e CD44. Para inibir a peroxidase endógena, as secções foram incubadas com 3% de peróxido de hidrogénio (DakoCytomation, EUA) durante 5 minutos à temperatura ambiente (RT). As secções foram então incubadas com o primário do rato anti-humano p53, CD44 e Ber-EP4 (Dako, 1:1000, 1:100 e 1:300 diluições, respectivamente) e (/1 diluição 1:40 Miltenyi Biotec, AC133 clone) CD133 anticorpos durante 30 minutos à t.a., seguido por incubação com anticorpos secundários correspondentes durante 30 minutos à temperatura ambiente e coradas com tetracloridrato de 3,3′-diaminobenzidina (Dako EnVision + ™ Sistema de peroxidase (DAB) (K4007, DakoCytomation, EUA)) antes de eles foram contrastadas com hematoxilina, desidratadas e montadas em DIATEX. Todas as secções foram enxaguadas exaustivamente com tampão de lavagem TBS-Tween (Dako Cytomation, EUA) após cada passo de incubação. Secções de blocos de parafina contendo seminoma e câncer de mama espécime humano foram usados ​​como controles positivos para anticorpos p53, Ber-EP4 e CD44, respectivamente; As seções do bloco de parafina contendo linha de células de cancro do cólon Caco-2 foram usados ​​como controle positivo para anticorpos CD133. Os anticorpos de controlo de isotipo na mesma concentração foram usadas como controlos negativos. Todos os controles foram realizados ea reatividade do anticorpo foi verificada antes de aplicações experimentais de anticorpos. Cada seção manchado foi avaliada de forma independente por dois patologistas.

Experiências com animais

Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo e realizado de acordo com as diretrizes estabelecidas pelo Conselho de Ética em Pesquisa Animal da Universidade de Oslo. Feminino NOD /SCID (NODSC-M-F /M-M NOD Homozigoto /mrkBOMTac-Prkdcscid; Taconic, Dinamarca) foram adquiridos. Depois de ser mantidos em quarentena durante uma semana de monitorização no ambiente esterilizado da instalação para animais no Hospital da Universidade de Oslo, Rikshospitalet, 4-5 semanas de idade NOD /SCID foram usadas em todas as experiências. Para avaliar a tumorigenicidade de PLCCLs estabelecidos, 3 × 10

6 células de cada linha de células em suspensão em DK-SFM foram inoculadas subcutaneamente no flanco direito de ratinhos NOD /SCID (3 ratos em cada grupo) a um volume máximo de 100 ul. Os ratinhos foram inspeccionados duas vezes por semana, e o tamanho do tumor foi medido com compassos de calibre. Os ratinhos foram sacrificados por deslocamento cervical quando o tamanho do tumor atingiu um diâmetro de 15 mm. Os xenoenxertos foram então removidos e utilizados para análise histológica e estabelecimento de culturas de células liquidas. Serial xeno-transplantes foram realizados com a linha de células LCC LC006 por implantação subcutânea peças do xenoenxerto primário em ratinhos NOD receptor secundário /SCID. Os xenoenxertos derivadas de cada passagem foram retirados e fixados em 4% de formalina tamponada para análise histológica.

A citometria de fluxo e análise de células activadas por fluorescência (FACS)

análise de citometria de fluxo foi realizada no PLCCLs na fase de crescimento logarítmica. As células foram primeiro isolada com TrypLE ™ Express e lavadas com DPBS. Re-suspendeu as células foram contadas e transferido para 75 milímetros de poliestireno tubos de ensaio de fundo redondo (BD Falcon, EUA) a uma concentração celular 1 × 10

6 células /ml, e subsequentemente corados com anticorpos a diluições determinados por titulação anterior. tampão de coloração de imunoglobulina humana (DPBS + 0,1% de albumina de soro humano (Octapharma, Estocolmo, Suécia)) e 5 uL de 10 mg /gamaglobulina ml (Gammagard, Baxter, Reino Unido) foi adicionado às células para bloquear a FcR e minimizar a ligação inespecífica de anticorpos. Fluorocromo anticorpos monoclonais acoplados (mAbs) foram adicionados aos tubos de ensaio a concentrações de saturação e as células foram incubadas durante 20 minutos em gelo, evitando a exposição à luz. Um rastreio de marcadores foi realizada com um painel de mAbs (ver dados detalhados na Tabela 2) em quatro PLCCLs representando cada subtipo do cancro do pulmão. Células coradas com mAbs do mesmo isotipo (BD Pharmingen, EUA) serviram como controlos negativos. Diferentes populações de células foram classificadas com base na expressão de CD44 por si só, ou em combinação com CD90 usando um classificador de células FACSAria II (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). dados de fluxo foram adquiridos na FACSAria II ou LSR II citômetro (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). Os resultados foram analisados ​​usando o software BD FACSDiva (versão 6.1.3). A viabilidade das células ordenadas foi rotineiramente verificada utilizando Trypan azul (Invitrogen, EUA), coloração e normalmente era 70%

A proliferação celular ensaio

FACS classificadas CD44

alta. e CD44

baixo /- células com uma densidade de 150 ou 500 células por poço foram plaqueadas em triplicado em 200 ul DK-SFM com suplementos em placas de 96 poços revestidas padrão. Os poços contendo apenas meio foram usadas como um controlo negativo de fundo. As células foram deixadas aderir a 37 ° C em 5% de CO

2 incubadora humidificada durante um dia antes de serem usadas no ensaio de proliferação. A proliferação celular foi medida durante os 8 dias seguintes utilizando CellTiter 96® Aqueous One Solution celular kit de Ensaio de Proliferação (Promega, Madison, WI) de acordo com o protocolo fornecido pelo fabricante. A absorvância a 490 nm foi medida num leitor de placas Wallac Victor2 (Perkin Elmer, Waltham, MA). As curvas de crescimento foram desenhadas de acordo com o valor médio de absorção, relacionado com o fundo.

2 dimensões (2D) colónia única célula formação ea heterogeneidade ensaio

CD44high e CD44

baixo /- as células do LC004 linha de células SCLC e a linha celular LCC LC006 foram classificados e semeadas a uma única célula por poço em padrão revestidas placas de 96 poços contendo 200 ul DK-SFM suplementado com EGF 20 ng /ml, de base-FGF 10 ng /ml, e 2% B27. chapeamento única célula foi validado por microscópio de contraste de fase (Nikon, Alemanha). As culturas foram mantidas a 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO2, incubadora humidificada. Após 2 semanas o número de poços positivos que continham colónias foi contado e características morfológicas das colónias foram avaliadas. Para estudar auto-renovação e diferenciação de células individuais, as colónias de diferentes tipos ou seja holoclones, meroclones e paraclones, foram submetidos a passagens em série, escolhendo e re-semeadura-los pela primeira vez em 24 poços, em seguida, placas de 6 poços (Corning Life Science , EUA), e, eventualmente, para os frascos (Corning das ciências da vida, EUA) onde foram ainda mais expandidas. o crescimento da colônia em 2D colónia única célula formação de ensaio e as culturas líquidas de longo prazo derivadas destas colónias foram observadas utilizando de contraste de fase microscópio (Nikon, Alemanha).

2D colônia formação de ensaio de eficiência

FACS classificadas CD44

alto, CD44

baixo /- e CD44

highCD90

+ e CD44

highCD90

– células de linhas de células SCLC LC004 e LCC LC006 foram semeadas em triplicado em uma densidade de 200 células por poço em placa de 6 bem revestido padrão (Corning Life Science, EUA) contendo 5 ml de DK-SFM com suplementos por poço. As células separadas foram mantidas em cultura a 37 ° C em 5% de CO

2 incubadora humidificada para ~ 10 dias. Quando as colónias geradas eram visíveis e continham 100 células, o sobrenadante foi aspirado e os poços foram lavados duas vezes com DPBS, fixadas em 4% de formalina tamponada durante 15 minutos à TA, seguido por coloração com violeta de cristal durante mais 15 min à TA. Depois de se enxaguar o corante de distância, o número de colónias foi contado e a eficiência de formação de colónias (CFE), ou seja, o número de colónias por células plaqueadas, foi calculado e comparado entre diferentes sub-populações.

esferoidal ensaio de formação de

FACS células separadas foram semeadas a uma densidade de 100 células por poço em ultra baixa fixação (ULA) placa de 96 poços (Corning Incorporated) contendo 200 ul DK-SFM com suplementos e cultivadas a 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO

2 incubadora humidificada até que as células começaram a formar esferóides. O meio foi mudado a cada 2 dias, removendo cuidadosamente 50 mL da camada superior do meio e substituindo-o com um volume igual de meio fresco. Os poços foram inspecionados a cada 2 dias usam o microscópio de contraste de fase. Quando os esferóides foram suficientemente grande (mais dos esferóides de células eram 200 mm)., Que foram contadas e fotografadas (Nikon, Alemanha)