Abstract
pâncreas ductal adenocarcinoma (PDAC) é uma doença altamente letal caracterizada por diagnóstico tardio e resistência ao tratamento. alterações genéticas recorrentes em genes definidos em associação com perturbações das vias de sinalização de células de desenvolvimento têm sido associados com o desenvolvimento e progressão PDAC. Aqui, mostramos que GATA6 contribui para carcinogênese pancreática durante a evolução temporal das neoplasias intra-epiteliais pancreáticas em virtude da ativação da via Wnt.
GATA6
é recorrentemente amplificado por tanto quantitativa-PCR e fluorescente de hibridização in-situ em neoplasia intraepitelial pancreáticas humanas e em tecidos PDAC, e
GATA6
copiar número é significativamente correlacionada com a sobrevida global dos pacientes. superexpressão forçada de GATA6 em linhas celulares de cancro reforçada a proliferação celular ea formação de colónias em agar mole
in vitro
e crescimento
in vivo
, bem como o aumento da sinalização de Wnt. Em contraste siRNA knockdown mediada de GATA6 conduziu a diminuições correspondentes em estes mesmos parâmetros. foram encontrados os efeitos da GATA6 ser devido à sua capacidade de se ligar DNA, como superexpressão forçada de um mutante de ligação ao DNA de GATA6 não teve nenhum efeito sobre o crescimento celular
in vitro
ou
in vivo,
nem eles afetam os níveis de sinalização Wnt nestas mesmas células. A análise revelou a micromatriz de Wnt antagonista Dickopf-1 (DKK1) como um gene desregulada em associação com knockdown GATA6, e de ligação directa de GATA6 ao promotor DKK1 foi confirmada pela imunoprecipitação da cromatina e ensaios de deslocamento da mobilidade electroforética. transfecção transiente de GATA6, mas não GATA6 mutante, em linhas de células de cancro levou a uma diminuição da expressão de ARNm de DKK1 e a secreção da proteína DKK1 em meios de cultura. superexpressão forçada de DKK1 antagonizou os efeitos de GATA6 na sinalização Wnt em células de câncer de pâncreas. Estas descobertas ilustram que um mecanismo pelo qual
GATA6
promove carcinogênese pancreática é em virtude de sua ativação da via de sinalização Wnt canônica através da regulação da DKK1
Citation:. Zhong Y, Wang Z, Fu B, Pan-F, Yachida S, Dhara M, et al. (2011) GATA6 Ativa Wnt Signaling no cancro do pâncreas por Negativamente Regulação do Wnt Antagonist Dickkopf-1. PLoS ONE 6 (7): e22129. doi: 10.1371 /journal.pone.0022129
editor: Irene Oi Lin Ng, da Universidade de Hong Kong, Hong Kong
Recebido: 31 de janeiro de 2011; Aceito: 16 de junho de 2011; Publicação: 19 de julho de 2011
Direitos de autor: © 2011 Zhong et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Apoiado por NIH concede CA106610, CA62924 e CA140599, The George Rubis Endowment for Research O cancro do pâncreas, a Fundação Michael Rolfe cancro do pâncreas, Sigma Beta Sorority, The Monastra Fundação Joseph C., The Alfredo Scatena Memorial, a Fundação do Câncer Patty Boshell pâncreas, e Grants SAF2007 -60.860 e ONCOBIO Consolider do Ministerio de Ciencia e Innovación, Madrid, Espanha (FR). Os autores não têm conflitos de interesses financeiros relacionados a este trabalho. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
GATA6 é membro do GATA fator de transcrição da família que desempenha papéis reguladores críticos no desenvolvimento de tecidos [1]. GATA proteínas partilham uma sequência de dedo de zinco conservado que se liga ao motivo de DNA canónica (G /A) GATA (A /T) [2], e estão divididos em dois subgrupos baseados em padrões de expressão espaciais e temporais. GATA1 /2/3 são expressas em linhagens de células hematopoiéticas, e GATA4 /5/6 em mesoderme e endoderme órgãos derivado [1], [3]. GATA6 em particular, é essencial para o desenvolvimento do coração, trato gastrointestinal, pâncreas e outros tecidos [4], [5]. A importância da GATA6 é sublinhada pela observação de que alvo inativação do
GATA6
gene em ratos provoca letalidade embrionária precoce, em resultado de uma falta de diferenciação endoderme [5] – [7].
recorrente ganho do número de cópias de
GATA6
foi recentemente identificado no pâncreas conduta de adenocarcinoma linhas celulares (PDAC) e xenoenxertos de [8], [9]. Embora o seu papel na carcinogénese PDAC é desconhecida, evidência crescente que indica GATA6 está associada com tumorigénese em uma variedade de tipos de tecidos [10] – [14]. Em tumores de ovário, expressão GATA6 ectópica está correlacionada com a desdiferenciação de células [15] enquanto que no cancro colo-rectal, a proliferação de células influências GATA6 e apoptose afectando a expressão de 15-lipoxigenase-1 que desempenha um papel na captura celular dependente de p53 [16]. GATA6 expressão aberrante de também tem sido implicada em tumores supra-renais humanos, bem como em um alfa /SV40 modelo de ratinho transgénico T-antigénio que se desenvolve tumores adrenal de um modo dependente da gonadotropina [17], [18]. Por outro lado,
GATA6
tem sido implicado como um gene supressor de tumor nos astrocitomas [14].
Este estudo procurou esclarecer os mecanismos pelos quais GATA6 contribui para carcinogênese pancreática. Vamos agora mostrar que
GATA6
amplificação ocorre durante os últimos estágios da neoplasia intra-epitelial de pâncreas, é significativamente correlacionada com o resultado do paciente, e promove a carcinogênese pancreática pela ativação da via de sinalização Wnt canônico devido à sua repressão da transcrição directa do Wnt secretados antagonista Dickkopf-1.
Métodos
Declaração de Ética
Todas as amostras de tecido humano foram coletadas com a aprovação do Johns Hopkins Hospital Institutional Review Board (IRB protocolos # NA_00036610 e NA_00001584) após consentimento informado e por escrito. Para experiências com animais, estudos foram realizados em estrita conformidade com as recomendações do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório do National Institutes of Health. O protocolo foi aprovado pela Comissão de Ética de Experimentação Animal da Universidade de Minnesota (ACUC protocolo # MO09M84). Todos os procedimentos foram realizados sob anestesia pentobarbital de sódio, e todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento.
Linhas de Células e Tecidos
O A6L, A13a, linhas celulares A10.7 e IMIM-PC2 foram estabelecidos em nossos próprios laboratórios. PK8 e PK9 eram do Dr. Akira Horii (Universidade Tohoko, Sendai, Japão), e HCG-25 do Dr. Tony Hollingsworth (University of Nebraska Medical Center, Omaha NE). Todas as restantes linhas celulares de cancro pancreático utilizados foram obtidos a partir de ATCC (Manassas VA). As linhas de células do ducto pancreático normais epiteliais e de HPDE HPNE foram preparados como anteriormente descrito [19]. O cancro do cólon linhas de células HCT116 (
CTNNB1
mutante), SW480 (
APC
mutante) e RKO (
APC
e
CTNNB1
tipo selvagem) foram fornecido pelo Dr. James Eshleman (Johns Hopkins Medical Institutions, Baltimore MD EUA). Todas as células foram cultivadas em DMEM (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS), 100 unidades /ml de penicilina, 100 mg /ml de estreptomicina e 2 mmol /l de L-glutamina, a 37 ° C e 5% de CO
2.
amostras de tecido pancreático humano foram obtidos a partir da Surgical Departamento de Johns Hopkins e xenotransplantes Patologia foram generosamente fornecidos pelo Dr. Scott Kern (Johns Hopkins Medical Institutions, Baltimore MD EUA). Todas as amostras foram coletadas com a aprovação do Johns Hopkins Hospital Institutional Review Board.
Lentivirus Constrói
lentivírus recombinantes expressando GFP a jusante de um shRNA simulada ou um shRNA específico para GATA6 foram criados usando uma de três sistema de vírus como anteriormente descrito em detalhe [20], [21]. sequências de oligonucleótidos para knockdown GATA6 foram sentido, 5′-gatccgctgtcacaccacaactaccttcaagagaggtagttgtggtgtgacagctttttta-3 ‘; e anti-sentido, 5’-cgataaaaaagctgtcacaccacaactacctctcttgaaggtagttgtggtgtgacagcg-3 ‘. Após a infecção, uma alíquota de cada linha celular (1 × 10
5) foi analisado por FACS na Unidade de Citometria de Fluxo do núcleo para confirmar a eficiência de transdução ( 95% em todas as linhas celulares testadas) ao monitorar a expressão da GFP 60 h após a transdução.
plasmídeo Construções
O GATA6 vector pcDNA3.1-GATA6 humana foi um presente do Dr. Clement Ho (Universidade da Pensilvânia, Filadélfia PA) e usado para criar pcDNA3.1 -mGATA6 por mutagénese dirigida ao local (Invitrogen) em que foram eliminados os oito bases mais altamente conservadas do motivo dedo de zinco [22], [23]. Humana vector de expressão pCMV-DKK1 DKK1 e o promotor de DKK1 repórter de luciferase pGL3-DKK1 foram generosamente fornecidos pelo Dr. Hirotaka Osada (Aichi Câncer Instititue, Nagoya, Japão). linhas de células estáveis foram criados seguindo nossos métodos previamente relatados em detalhe [8].
Os ensaios in vitro de celular Crescimento
ensaios de proliferação celular foram realizadas usando celular Counting Kit-8 (DOJINDO Tecnologias Moleculares) seguindo o protocolo sugerido. Os ensaios de formação de colónias foram realizados como previamente descrito [8]. Todos os ensaios foram realizados em triplicado.
análise do ciclo celular
A citometria de fluxo foi realizada num Becton Dickenson LSR Benchtop Citómetro de fluxo (BD Biosciences, San Jose, CA). Percentagens de células em G0-G1, S e G2 fase foram determinados utilizando CellQuest (BD Biosciences)
método imunoenzimático
ELISAs foram realizados utilizando mAb de rato anti-humano DKK-1. anticorpo (clone 141119) seguindo o protocolo do fabricante (R D Systems, Inc., Minneapolis, MN, EUA). Todos os ensaios foram realizados em triplicado.
Western Blotting
quantidades iguais de proteína foram separadas em 15% SDS-poliacrilamida e transferidos para membranas de PVDF (DuPont NEN, Boston, MA). As membranas foram hibridadas com uma diluição 1: 100 de anticorpo primário (SS-catenina clone de mAc de rato E-5 ou GATA6 clone de pAb de coelho H-92, Santa Cruz Biotechnology, CA) seguido por peroxidase de rábano (HRP) -linked de cabra anti-coelho IgG e visualizado pelo sistema de quimioluminescência aumentada (ECL) (Amersham). Expressão de ß-actina foi utilizado como um controlo interno.
A imuno-histoquímica
imunomarcação foi realizada de acordo com métodos previamente relatados métodos padrão [8], utilizando uma diluição 1:100 de cada anticorpo primário durante 2 horas à temperatura ambiente. A especificidade dos anticorpos para GATA6 e DKK1 é apresentado pela tela cheia Western blot na Figura S1.
Microarrays Gene Expression
O RNA total foi isolado com um kit RNeasy (Qiagen, Valencia, CA) . As amostras foram hibridadas com Agilent Humano 4 × 44K matrizes (Santa Clara, CA) e os dados brutos analisadas seguindo protocolos padrão na instalação Microarray núcleo na Universidade Johns Hopkins. Todos os dados são Miame complacente e os arquivos de dados brutos foram depositadas no banco de dados Miame compatível GEO (
número de acesso
GSE27173).
Tempo real PCR quantitativo para a expressão de mRNA
um micrograma de ARN por amostra foi transcrito de forma inversa em ADNc utilizando SuperScriptTMIII Platinum® Two-Step qRT-PCR Kit (Invitrogen). análise de RT-qPCR foi realizado utilizando um tempo real Sistema de PCR 7300 (Applied Biosystems, CA, EUA) para a monitorização da fluorescência do corante verde (SYBR®Green, Invitrogen Inc., CA, EUA). Relative dobra-alterações da expressão do gene em comparação com o gene de manutenção de b-actina foram determinados por cálculo do 2
ΔΔCt. Todos os ensaios foram realizados em triplicado. (As sequências dos iniciadores são fornecidos em S1 Arquivo).
GATA6 copiar o número de ensaios
número de cópias do DNA genômico de GATA6 foi determinada como descrito anteriormente em detalhe [8]. número de cópias de 2,3 foram considerados cópia ganho de número para dar conta polissomia do cromossomo 18q, e por até 20 vezes superexpressão GATA6 pode ocorrer em PDACs com mesmo número de cópias baixo nível de ganho [8]
luciferase. e TOPFLASH ensaios
Para os ensaios TOPFLASH, pGL3-OT e pGL3-de plasmídeos foram utilizados (gentilmente cedidas pelo Dr. Bert Vogelstein). Wnt actividade relativa foi determinada pela razão da expressão de luciferase a partir do vector pGL3-OT dividida pela do vector pGL3-DA, como descrito anteriormente. Para todos os outros ensaios de luciferase, o vector pRL-TK (Promega) que expressam a luciferase do amor perfeito do mar foi utilizada como um controlo. O vector pcDNA3.1 vazio foi utilizado para ajustar a quantidade total de ADN transfectado. Os ensaios de luciferase foram realizadas 40 horas após a transfecção usando o Sistema de Ensaio de luciferase dupla-Repórter (Promega), e a actividade da luciferase foi determinada com o contador 1420 multilabel (PerkinElmer vida e ciência análise, CT, EUA). Firefly actividades da luciferase foram normalizados por actividades de luciferase do amor perfeito do mar. Todos os experimentos foram realizados em triplicado.
Cromatina imunoprecipitação Assay (Ensaio CHIP)
ensaios ChIP foram realizadas utilizando reagentes e protocolos de Upstate Biotechnology (Lake Placid, Nova Iorque) utilizando métodos descritos anteriormente [24 ]. Todos os primers utilizados foram projetados para atingir especificamente motivos de ligação GATA no
DKK1
promotor. (Sequências de sondas são fornecidos em S1 Arquivo).
Mudança eletroforética Mobility Assay (EMSA)
ensaios de EMSA foram realizadas utilizando métodos previamente descritos [24]. Os extractos de proteína foram normalizados para proteína total, e 5-10 mg de proteína foram incubadas com as sondas de afinidade elevada GATA6
32P-marcadas específicas para cada um dos quatro motivos de ligação putativos dentro do GATA
DKK1
promotor . sondas mutante no qual a sequência motivo de ligação foi mutantes também foram utilizados. Uma sonda GATA6-P (5′-GCCAGCAGATAGCATGGAAAAG-3 ‘) derivada a partir de
TFF2
promotor que contém um local de ligação GATA6 [25] foi utilizado como um controlo positivo. os complexos proteína-ADN foram resolvidos em géis de poliacrilamida a 5% nondenaturating e analisados por autorradiograf ia utilizando filme Kodak. (Sequências de sondas são fornecidos em S1 Arquivo).
shRNA knockdown mediado
As células cultivadas em fase de crescimento log (50% confluentes) foram transfectadas com DKK1 shRNA (Dharmacon), CTNNB1 shRNA (CTNNB1- VHS50819, Invitrogen Inc, CA) ou shRNA simulada (# 4611, Ambion) usando Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen Inc, CA) seguindo o protocolo recomendado. Vinte e quatro horas após a transfecção, as células foram colhidas e submetidas a ensaios de análise, de proliferação celular e formação de colónias de RT-qPCR.
Fluorescente de hibridização in situ (FISH)
FISH foi executada como descrito anteriormente [8] utilizando clones de cromossomos artificiais bacterianos CTD-2376C8 contendo as sequências genómicas do amplicon 18q11.2 em 0,11 Mb (Invitrogen, Carlsbad, CA).
a metilação específico PCR
Promotor de metilação foi avaliada usando primers e condições previamente relatados por Suzuki et al [26].
a análise estatística
As análises estatísticas foram realizadas com um unpaired
t
-teste para distribuições paramétricas, ou um teste qui-quadrado para comparar frequências. P 0,05 foi considerado estatisticamente significativo
Resultados
GATA6 Copiar número de ganho ocorre durante pâncreas neoplasia intra-epitelial
é acreditado normal epitélio ductal pancreático para avançar para infiltrar o cancro através de uma série. de precursores morfologicamente definidas chamados neoplasia intraepitelial pancreáticas (pancreáticas intraepiteliais-1, 2, 3) [27]. Para entender a correlação entre o ganho genético de
GATA6
e desenvolvimento PDAC, avaliou
GATA6
número de cópias em amostras microdissecadas de epitélio normal do duto, PanIN e PDAC humano por PCR quantitativa. Em relação ao genoma haplóide, houve nenhum ganho de
GATA6
no epitélio conduta normais (0 de 4), PanIN-1 (0 de 13) ou PanIN-2 (10) 0 de lesões. Em contrapartida, o aumento da
GATA6
número (≥2.3 cópias) copiar foi identificada em 6/17 amostras (35%) de 3-PanIN e em 18/55 amostras (33%) de PDAC (Figura 1A).
GATA6
cópia ganho número foi ainda confirmada por fluorescência
in situ
fluorescente (FISH) em secções embebidas em parafina de um PanIN-3 e 10 amostras PDAC (Figura 1B).
(a)
GATA6
número de cópias (média ± SE) nas condutas normais microdissecadas (N = 4), PanIN-1 (N = 13), PanIN-2 (10), PanIN-3 (N = 17) lesões e câncer pancreático (N = 55). (B) O peixe representativo do núcleo de uma célula neoplásica dentro de uma lesão PanIN3 com 11 vezes
GATA6
amplificação (direito) em comparação com o núcleo de uma célula neoplásica a partir de uma lesão PanIN3 diferente sem cópia número ganho de
GATA6
(esquerda). sonda GATA6 foi marcado com sonda 18 centrômero vermelho e cromossomo (18 Cent) foi marcado com verde. As secções foram contrastadas com DAPI para realçar núcleos. (C) Correlação da expressão de mRNA GATA6 e número de cópias em amostras microdissecadas de normal, PanIN e tecido canceroso. imunomarcação (D) GATA6 de dois tecidos cancro do pâncreas com cópia GATA6 ganho número em comparação com dois tipos de câncer, sem ganho de número de cópias. número de cópias aumentado é altamente associado com rotulagem nuclear de proteína GATA6. (E) Kaplan Meier curva de sobrevivência que ilustra a relação de
GATA6
copiar ganho número (≥2.3 cópias por genoma haplóide) para a sobrevida global em pacientes com cirurgicamente ressecado câncer pancreático.
Para seis pacientes do pancreáticas intraepiteliais-3 combinados e PDAC foram microdissectados a partir da mesma secção de tecido e analisadas para
GATA6
número de cópias,
KRAS Comprar e
TP53
estado do gene (Tabela 1) . Em dois pacientes (pacientes 7 e 53)
GATA6
cópia ganho número foi encontrado em ambas as amostras pancreáticas intraepiteliais-3 e PDAC indicando que surgiu antes do desenvolvimento do carcinoma de infiltração, enquanto que em um terceiro paciente (paciente 53)
GATA6
copiar ganho número só estava presente na amostra PDAC sugerindo que surgiu durante a progressão temporal com PDAC. No entanto, como um único PanIN-3 foi analisada neste paciente, não podemos excluir que PanIN-3 lesões adicionais e não testados em pâncreas deste paciente também continha ganho de número de cópias. Para confirmar que aumenta em
GATA6
copiar resultado número de aumento da expressão do gene, que os níveis de ARNm quantificado GATA6 nestas mesmas amostras microdissecadas (Figura 1C), indicando que os níveis relativos de ARNm GATA6 foram significativamente maiores nas amostras com
GATA6
copiar números ≥2.3 comparação com aqueles com números de cópias 2,3 (461,9 ± 126,2 e 194,1 ± 69,7, p 0,0004). Da mesma forma, imunomarcação para GATA6 em cinco cancros pancreáticos com ganho de número de cópias mostrou marcação nuclear positiva forte enquanto que nenhuma marcação foi visto em cinco cancros pancreáticos com números de cópias. 2,3 (Figura 1D)
carcinogênese de pâncreas é acompanhado pelo acúmulo de alterações genéticas no
KRAS, CDKN2A, TP53
e
SMAD4
genes [27]. Por isso, determinou a relação de
GATA6
copiar ganho de número para o estado genético destes quatro genes em 56 de xenotransplante PDACs enriquecidos. Dezessete xenotransplantes (30%) tinha um
GATA6
copiar o número de ≥2.3 em relação ao genoma haplóide, dos quais seis (11%) tinham um número 5.0. No entanto, não houve correlação de
KRAS, CDKN2A, TP53
ou
SMAD4
status com
GATA6
número de cópias. Porque
GATA6
está também localizado no mesmo braço cromossomo como
SMAD4
que é frequentemente alvo de deleção homozigótica [28], o próximo perguntou se
GATA6
copiar ganho número é especificamente relacionados com eventos de rearranjo genómico que podem levar a deleção homozigótica do
SMAD4
no mesmo DNA de xenotransplante. No entanto, isso de novo não revelou uma associação, com seis de oito
SMAD4
mutantes que ocorrem devido ao apagamento homozygous em xenoenxertos com o aumento da
GATA6
número de cópias contra 13 de 21 com uma deleção homozigótica no xenotransplantes sem
GATA6
copiar ganho número (p = 0,2844). Tomados em conjunto, podemos concluir que
GATA6
copiar ganho numbe≥r ocorre durante as fases tardias da neoplasia intra-epitelial pancreáticas, mas não é especificamente enriquecido para dentro de carcinomas com alterações destes quatro genes.
A seguir, determinou a medida em que
GATA6
copiar ganho número está associado às características clínico-patológicas de PDAC ressecado. Nenhuma relação foi encontrado com
GATA6 Comprar e idade, sexo, tamanho do tumor, diferenciação do tumor, localização do tumor ou estado dos linfonodos. No entanto, os pacientes com número de cópias ≥2.3 tiveram uma sobrevivência global maior do que pacientes sem ganho de número de cópias por Kaplan Meier estimativa de sobrevida (p = 0,0096, Figura 1E).
GATA6 Promove celular Crescimento
In vitro
e
In Vivo
a amplificação e superexpressão de
GATA6
em PanIN e PDAC sugere que contribui para PDAC biologia [8], [9]. Nós, portanto, construídos vectores lentivirais que expressam quer um mock ou GATA6 shRNA específica e usou-os para infectar estavelmente as linhas de células PDAC AsPC1 e A13a com números de cópias de 2,3 e 9,0 em relação ao genoma haplóide, respectivamente [8], [9]. Em ambas as linhas celulares, GATA6 também é sobre-expressa pelo menos 10 vezes em relação a células normais do ducto [8], [9] (Figura S2). Knockdown de GATA6 em ambas as linhas celulares (Figura 2A, 2B) levou a uma diminuição significativa na proliferação celular e formação de colónias (Figura 2C e D), uma redução nas células numa fase G2 /M (Figura 2E) e diminuição do crescimento in vivo (Figura 2F e 2G). Por outro lado, forçado a sobre-expressão de GATA6 na linha celular PDAC Panc1 com baixos níveis de expressão GATA6 endógeno [8] (Figura 3A e Figura S2) conduziu a um aumento da proliferação celular e formação de colónias (Figura 3B e 3C) semelhante ao também anteriormente mostrado para a linha de células MiaPaCa2 que não têm expressão endógena de GATA6 [8].
(a), proteína total foi extraído a partir de células e os controlos simulados shRNA AsPC1-GATA6sh e A13a-GATA6sh e analisados por Western blot para níveis relativos GATA6 de proteína em relação à actina. (B) PCR em tempo real para a expressão em GATA6 AsPC1-GATA6sh e células A13a-GATA6sh. (C) As células foram também analisadas para a proliferação de células em diferentes pontos de tempo, (D) cultivadas em ágar macio e o número de colónias a 2 semanas contadas, e (E) analisadas por citometria de fluxo para determinar a percentagem de células em G2 /H fase. (F) a formação de xenotransplante Representante
in vivo
(acima) e depois de explante (inferior) do controle AsPC1 e células GATA6sh em 8 semanas após a injecção. (L) o volume médio do tumor (média ± SE) destes mesmos xenoenxertos em 8 semanas após a injecção. Resultados semelhantes foram observados para células A13a-GATA6sh (dados não mostrados). Com excepção de citometria de fluxo que foi efectuada em duplicado, todos os dados experimentais mostrados representa o resumo de três experiências independentes. *, P 0,05; **, P 0,01; ***, P . 0.001
(A) PCR em tempo real para a expressão GATA6 em Panc1-simulada, Panc1-GATA6 e células Panc1-mGATA6. (B) Panc1-simulada, Panc1-GATA6 e Panc1-mGATA6 células foram analisadas tanto para a proliferação celular ou (C) cultivadas em ágar macio e o número de colónias a 2 semanas contadas. (D) a formação de xenotransplante Representante
in vivo
(acima) e depois de explante (inferior) de Panc1-simulada, Panc1-GATA6 e células Panc1-mGATA6 às 8 semanas após a injecção. (E) O volume de tumor médio (média ± SE) destes mesmos xenoenxertos em 8 semanas após a injecção. Todos os dados experimentais mostrados representa o resumo de três experiências independentes. *, P 0,05; **, P 0,01; ***, P . 0,001
GATA6 regula a transcrição de DNA por ligação aos motivos GATA canónicos, ou como um cofactor de transcrição [2], [29]. Para determinar se os efeitos em células Panc1 deveram-se a actividade de ligação a ADN GATA6, utilizou-se mutagénese dirigida ao local para criar um ADNc mutante em que o domínio de dedo de GATA6 Zn foi interrompida (o chamado mGATA6), e novamente transfectado estavelmente células Panc1 (Figura 3A ). Não houve diferença no crescimento celular ou a formação de colónias de células entre Panc1-mGATA6 e células de controlo (transfectadas Panc1 Figura 3B e 3C), sugerindo que a promoção do crescimento observado efeitos de GATA6
In vitro Quais são, devido à sua função como um factor de transcrição. Para esclarecer ainda mais o efeito de promoção do crescimento de GATA6, ratinhos nus foram inoculados por via subcutânea com células Panc1-mGATA6 Panc1-GATA6 ou. Após 8 semanas, o volume do tumor foi significativamente maior em ratos injectados com células Panc1-GATA6 do que com células Panc1-mGATA6 (Figura 3D e 3E), levando-nos a concluir que GATA6 promove carcinogênese através da sua capacidade de se ligar DNA.
o Wnt Antagonist Dickkopf1 (DKK1) é um GATA6 gene alvo
proteínas GATA estão ligados a sinalização Wnt na embriogênese do coração e dos pulmões [4], [30], [31]. Por conseguinte, a hipótese de que GATA6 contribui para a carcinogénese do pâncreas, em parte, através dos seus efeitos sobre a sinalização de Wnt, uma relação putativa que não tem sido explorado em pormenor para este tipo de tumor. Em comparação com células infectadas com lentivírus shRNA Mock, ambas as células AsPC1-GATA6sh e A13a-GATA6sh mostrou um decréscimo significativo na actividade de sinalização Wnt funcional pelo ensaio TOPFLASH (Figura 4A), enquanto que a sobre-expressão de GATA6 em Panc1 e células HPNE promoveu a actividade de sinalização de Wnt (Figura 4B ). Para determinar se a expressão de beta-catenina é necessário para que estes efeitos silenciados expressão SS-catenina utilizando uma estratégia de shRNA em células Panc1-GATA6, levando a uma inibição significativa da proliferação celular e formação de colónias (Figura 4C e 4D). Em tecidos de câncer de pâncreas, a superexpressão GATA6 foi significativamente correlacionada com a acumulação nuclear da proteína beta-catenina (8/12 PDACs com superexpressão GATA6 mostrando acumulação nuclear ß-catenina contra 3/20 sem superexpressão GATA6, p = 0,004) (Figura 4E). Assim, GATA6 superexpressão no PDAC contribui para a proliferação celular ea formação de colônias através do reforço da sinalização Wnt canônico.
(A) atividade de sinalização Wnt em células com base no ensaio TOPFLASH AsPC1-GATA6sh e A13a-GATA6sh. A actividade da luciferase é representado como a razão entre a OT dos níveis em células com GATA6 knockdown em relação à de células transfectadas por simulação. (B) actividade de sinalização Wnt em células HPNE-GATA6 determinada por ensaio TOPFLASH Panc1-GATA6 e. A actividade da luciferase é representado como a razão entre a OT dos níveis em células transfectadas GATA6 em relação à de células transfectadas por simulação. (C e D), as células Panc1-GATA6 foram transientemente transfectadas com beta-catenina ou shRNA simulada e a proliferação das células (C) ou a formação de (D) determinada colónia. Todos os dados experimentais mostrados representa o resumo de três experiências independentes. *, P 0,05; **, P 0,01. (E) imunomarcação padrões de GATA6 e proteína ß-catenina em dois tecidos PDAC representativas. As setas indicam etiquetagem nuclear de ambos GATA6 e SS-catenina em cortes seriados do mesmo tecido de cancro. Em contraste, a amostra PDAC com baixa expressão GATA6 também mostra nenhuma expressão de beta-catenina.
GATA6 regula seus genes alvo através da ligação ao motivo de ligação a GATA [2]. Para identificar genes alvo GATA6 que podem influenciar a sinalização de Wnt, realizamos perfis de expressão genética AsPC1-GATA6sh e A13a-GATA6sh e seus controles simulados e identificou 113 genes comumente desregulados (Figura 5a e Tabela S1) um dos quais foi Dickkopf-1 (
DKK1
), um antagonista de sinalização Wnt canónica [32]. Wnt11, um gene alvo GATA6 conhecido [30], foi também identificado, sugerindo que GATA6 contribui para a regulação da via Wnt, em parte, através da regulação destes genes. Porque DKK1 não tenha sido previamente reconhecido como um
gene alvo GATA6
que especificamente voltado para o relacionamento de GATA6 a DKK1.
(A) diagrama de Venn que indica o número de genes desregulados identificadas por análise de microarray de AsPC1-GATA6sh (círculo à esquerda, azul) e células A13a-GATA6sh (círculo direito, amarelo). A-área cruz verde indica genes comumente desregulados e inclui DKK1. (B) PCR em tempo real confirmando a sobre-expressão de DKK1 no AsPC1-GATA6sh e células A13a-GATA6sh. (C) Detecção da proteína secretada DKK1 em meios condicionados, em AsPC1-GATA6sh e células A13a-GATA6sh. Os níveis de proteína DKK1 secretadas são indicadas usando a absorvância DO450. (D) ensaio de imunoprecipitação da cromatina confirmando a ligação do GATA6 ao
DKK1
promotor. IgG não-imune e do genoma derivado ADNg são utilizados como controlos negativos e positivos, respectivamente. ensaio (E) EMSA confirmando a ligação do GATA6 para GATA putativo sítios de ligação # 2 e # 3. A sequência mutante mGATA- # 3 não gerou qualquer ligação detectável. Extr Nuclear, extracto nuclear; GATA6-P, uma sonda de controlo positivo derivado do
TFF2
promotor contendo um sítio de ligação GATA6; GATA- # 2, sonda contendo ligação putativo GATA local No. 2; GATA- # 3, sonda contendo ligação putativo GATA local No. 3; mGATA- # 3, sonda contendo um sítio de ligação GATA putativo mutado No. 3; referem-se a métodos para obter detalhes adicionais (F) Efeito de expressão GATA6 sobre a atividade do
DKK1
promotor. Os dados são apresentados como a razão entre a actividade de luciferase do pirilampo para a actividade da luciferase amor perfeito do mar. pGL3 foi utilizado como um controlo negativo para o fundo. (L) PCR em tempo real para a expressão de ARNm em células Panc1 DKK1. Quando apropriado, todos os dados experimentais mostrados representa o resumo de três experiências independentes. *, P 0,05; ***, P . 0,001
-PCR em tempo real confirmou DKK1 mRNA de regulação positiva e aumento da secreção de proteína de DKK1 no meio celular em ambas as linhas de células na presença de knockdown GATA6 (Figuras 5B e 5C) . Para determinar se
DKK1
é um alvo direto de GATA6, buscamos o
DKK1
promotor para sequências de ligação GATA6 consenso. Quatro motivos GATA-ligação independentes foram identificados (Figura S3), e por ensaio de imunoprecipitação da cromatina a ligação directa de GATA6 para estes motivos no
DKK1
promotor foi demonstrada (Figura 5D). A ligação por GATA6 também foi confirmada por ensaio de desvio de mobilidade electroforética (Figura 5E e dados não mostrados). A seguir, utilizado um repórter de luciferase sob o controlo do
DKK1
promotor para determinar se a ligação GATA6
DKK1
impactos sobre a actividade de transcrição do gene. Este repórter foi activada tanto em células 293T e Panc1 reflectindo activação endógena de expressão DKK1. No entanto, após a expressão GATA6 forçada (Fig. 5F) a actividade da luciferase foi significativamente reduzida, enquanto que nenhum efeito sobre
DKK1
actividade do promotor foi observada na presença do mutante de ligação motivo (mGATA6) GATA6, indicando que os efeitos repressivos de GATA6 em
DKK1
requer ligação directa de GATA6 ao
DKK1
promotor. A expressão forçada de tipo selvagem, mas não proteína mGATA6 em Panc1 também levou a reduções significativas nos níveis de mRNA DKK1 (Figura 5G). Tomados em conjunto, estes dados indicam que GATA6 regula negativamente DKK1 transcrição através de ligação direta com o motivo GATA na região promotora
DKK1
.
Expression DKK1 no PDAC se correlaciona com Wnt Activation
os membros da família de DKK (DKK1, DKK2, DKK3 e DKK4) são secretadas proteínas que inibem a sinalização de Wnt canónica pela ligação a uma subunidade do receptor de Wnt Lrp5 complexo /6 [32]. PCR em tempo real indicaram que o DKK1 foi o único membro da família de DKK que foi expresso em ambas as linhas celulares normais conduta e na maioria das linhas celulares PDAC analisados (Figura S4A). Do TSS, local de início da transcrição; 0,01;