Abstract

A exposição humana ao bisfenol A (BPA) é onipresente. Estudos em animais descobriram que BPA contribui para o desenvolvimento de câncer de próstata, mas os dados humanos são escassos. Nosso estudo examinou a associação entre níveis de BPA na urina e câncer de próstata e avaliados os efeitos do BPA na indução de anormalidades centrossoma como um mecanismo subjacente promover carcinogênese de próstata. O estudo, envolvendo 60 pacientes de urologia, encontraram níveis mais elevados de BPA urinária (ajustada para a creatinina) em pacientes com câncer de próstata (5,74 mg /g [IC 95%; 2.63, 12.51]) do que em doentes com cancro não prostático (1,43 mg /g [IC 95%; 0,70, 2,88]) (

p

= 0,012). A diferença foi ainda mais significativa em pacientes 65 anos de idade. A tendência para uma associação negativa entre urinária BPA e soro PSA foi observado em pacientes com câncer de próstata, mas não em pacientes com cancro não prostático.

In vitro

estudos examinaram anomalias centrosomal, nucleação de microtúbulos, e crescimento independente de ancoragem de linhas celulares de cancro de quatro próstata (LNCaP, C4-2, 22Rv1, PC-3) e dois imortalizadas linhas de células epiteliais da próstata normais (NPrEC e RWPE-1). A exposição a doses baixas (0,01-100 nM) de ABP aumentou a percentagem de células com dois amplificação centrossoma a oito vezes. Dose respostas quer pico ou atingiram o planalto com 0,1 exposição nM BPA. Esta dose baixa também promoveu a nucleação de microtúbulos e rebrota de centrossomas em RWPE-1 e maior crescimento independente de ancoragem em C4-2. Estes achados sugerem que o nível de BPA urinária é um marcador independente de prognóstico no câncer de próstata e que a exposição ao BPA pode diminuir os níveis de PSA no soro em pacientes com câncer de próstata. Além disso, a interrupção do ciclo de duplicação centrossoma por uma dose baixa de BPA podem contribuir para a transformação neoplásica da próstata

Citation:. Tarapore P, Ying J, Ouyang B, Burke B, Bracken B, Ho SM (2014) a exposição ao Bisfenol a está correlacionada com início precoce do cancro da próstata e promove centrossoma Amplification e Crescimento Anchorage-Independent

In Vitro

. PLoS ONE 9 (3): e90332. doi: 10.1371 /journal.pone.0090332

Edição: Natasha Kyprianou, da Universidade de Kentucky College of Medicine, Estados Unidos da América

Recebido: 25 de novembro de 2013; Aceito: 30 de janeiro de 2014; Publicação: 03 de março de 2014

Direitos de autor: © 2014 Tarapore et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado em parte pelas bolsas do National Institutes of Health (P30-ES006096, U01-ES019480, U01-ES020988), um Prémio de Mérito Veterans Administration (I01-BX000675), uma fonte de financiamento interno da Universidade de Cincinnati para SMH e PT e um Medical Research Department Programa Congressionally Directed do Prêmio de Defesa (PC094619) para PT. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de próstata (PCA) é a segunda malignidade mais comum entre os homens na América do Norte. O envelhecimento é um fator de risco bem estabelecido para CaP [1]. Um em cada seis homens desenvolverá CaP longo da sua vida; No entanto, o câncer raramente é diagnosticada em homens 40 anos de idade, com quase dois terços dos casos relatados [2], [3] em homens com 65 anos de 2006 a 2010, a média de idade no momento do diagnóstico foi de 66 anos de acordo com a as estatísticas da Vigilância Epidemiologia do Instituto Nacional do Câncer e Estudos Resultados finais (2013) [4]. Principais outros do que a idade fatores que contribuem são a raça e história familiar [1], ao passo que pouco se sabe sobre o impacto dos desreguladores endócrinos da ACP.

O bisfenol A (BPA) é um composto orgânico com a fórmula química (CH

3)

2C (C

6H

4Oh)

2. BPA é usado para fazer resinas de plástico de policarbonato e epoxi, que estão presentes em milhares de produtos de consumo [5], [6]. Nos Estados Unidos, a exposição ao BPA é generalizada, superior a 90% na população geral [7]. absorção dérmica, inalação e ingestão de alimentos e água contaminados são as principais vias de exposição [8]. Como um disruptor endócrino que imita hormônio estrogênio e da tireóide, BPA também age como um disruptor metabólica e imunológico. Assim, os efeitos adversos para a saúde do BPA são extensas [9], [10], e os níveis mais elevados de exposição ao BPA correlacionam com risco aumentado de doença cardiovascular, obesidade, diabetes, doenças imunológicas, e uma série de disfunções reprodutivas [11], [ ,,,0],12], [13]. Além disso,

In vitro

e estudos com animais, têm demonstrado que a exposição de BPA pode aumentar o risco de glândula mamaria, o cérebro e os cancros da próstata [9]. No entanto, estudos em humanos que ligam a exposição ao BPA para o risco de câncer aumentado são escassos. Um desses estudos na China mostrou que a incidência de meningioma foi de 1,6 vezes maior em adultos com concentrações mais elevadas de BPA na urina do que naqueles com concentrações mais baixas [14]. Estudos semelhantes do PCA não estiveram disponíveis até agora.

A centrossoma compreende um par de estruturas cilíndricas chamado

centrioles

cercado por material pericentriolar. Centrossomas estão envolvidos na organização do citoesqueleto interfase microtúbulos, fusos mitóticos e cílios. Acredita-se que a disfunção centrossoma (número e integridade), uma característica de muitos cânceres, para iniciar a transformação neoplásica e promover a progressão da doença [15], [16]. Um número anormal de centrossomas pode resultar na mitose mono- ou multipolar, levando ao aumento da aneuploidia [15], [16]. Outra característica da perturbação centrosomal é anormalidades no microtúbulos (MT) nucleação e ancoragem. Tais alterações foram mais freqüentemente observadas em células de câncer de mama do que nas células epiteliais normais da mama [15], [16]. Além disso, um número significativo de genes associados com o risco aumentado CaP estão em vias que levam à disfunção do centrossoma [17], [18]. Estas observações levaram-nos a examinar, em modelos baseados em células, os efeitos adversos do BPA sobre o ciclo centrossoma como um mecanismo que contribuem para a carcinogénese da próstata.

Foi utilizado um estudo clínico transversal para examinar a associação entre exposição ao BPA e PCA. Trabalhamos com a hipótese de que o BPA tem um papel na carcinogênese de próstata. Descobrimos que pacientes com PCA são mais propensos do que aqueles sem CaP a ter níveis mais elevados de BPA em sua urina. Observou-se uma tendência para uma correlação negativa entre o BPA na urina e níveis de PSA no soro em pacientes APC. Realizamos

in vitro

estudos para avaliar os efeitos do BPA no número centrossoma, a formação de ásteres MT, e colonização em ágar mole em duas linhas imortalizadas normais epiteliais da próstata celulares (RWPE-1 e NPrEC) e quatro CaP linhas de células (LNCaP, C4-2, 22Rv1, PC-3). Verificou-se que a percentagem de células com a amplificação do centrossoma (CA) aumentou em resposta à exposição BPA baixa dosagem e que a relação era não monótona para a maioria das linhas celulares. Além disso, a exposição a uma dose baixa de BPA promovido MT organização áster no não-canceroso RWPE-1 e um aumento do crescimento independente de ancoragem na linha de células C4-2 CaP independente de androgénios. Em conjunto, estes resultados revelam uma relação até então desconhecida entre a exposição ao BPA e PCA e sugerem um mecanismo subjacente ao papel do BPA na progressão de transformação e doença neoplásica.

Materiais e Métodos

Pacientes e a coleção de amostras de urina

os pacientes foram recrutados no ambulatório de urologia na Universidade de Cincinnati Medical Center sob um protocolo aprovado pela Universidade de Cincinnati Institutional Review Board. A Tabela 1 apresenta as características do paciente e informações de diagnóstico. Depois de assinar um termo de consentimento, os pacientes foram submetidos a um exame de toque retal e foram solicitados a fornecer um 20 a 50 ml amostra de urina antes da biópsia da próstata guiada por ultra-som agendada. Todos os procedimentos deste estudo foram aprovados pela Universidade de Cincinnati Institutional Review Board. As amostras de urina foram centrifugadas, os sedimentos foram recolhidos para um estudo de biomarcador CaP [19], e os sobrenadantes foram armazenados em alíquotas a -80 ° C para análise ABP. Entre as 60 amostras utilizadas para este estudo, 27 eram de pacientes com PCA (PCA) e 33 eram de pacientes sem PCA (não-PCA).

Medição do BPA em amostras de urina

níveis de BPA em amostras foram determinados no Laboratório de Análise Química orgânica de Wadsworth Center, New York Secretaria Estadual de Saúde, (Albany, NY). cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) juntamente com electropulverização de quadrupolo triplo-espectrometria de massa (ESI-MS /MS) foi utilizado para quantificar BPA, uma técnica semelhante à descrita anteriormente, com algumas modificações, [20], [21]. Em resumo, a 500 ul de cada amostra de urina foram misturadas com 1 ml de glucuronidase (2 ul /ml) durante a digestão e a extracção. Para o controlo de qualidade, 5 ng de

13C

12-ABP foi adicionado a cada mistura. Os extractos foram aplicados a um HPLC Agilent series 1100 em interface com um Applied Biosystems API 2000 electrospray EM /EM (Applied Biosystems, Foster City, CA) para quantitativa de BPA. Os dados foram adquiridos através de monitoramento de múltiplos de reação para as transições de 227 212 para BPA, e 239 224 para

13 C

12-BPA. O limite mínimo de detecção (MDL) do BPA neste protocolo foi de 0,05 ng /ml. Para concentrações inferiores a MDL, um valor igual ao MDL dividida pela raiz quadrada de 2 foi utilizado em análises estatísticas [22]. concentrações relatados foram corrigidos para as recuperações de padrão de aluguel (método de diluição isotópica). O padrão BPA cravado para matrizes de amostras seleccionadas e passados ​​através de todo o procedimento analítico originou uma recuperação de 88% ± 8% (média ± DP). Uma curva de calibração externa foi preparado pela injeção de 10 ml de 0,05, 0,1, 0,2, 0,5, 1, 2, 5, 10, 50 e 100 normas ng /ml, e o coeficiente de regressão foi de 0,99.

Normalização de urina BPA

níveis de creatinina urinária foram usadas para ajustar a variabilidade na diluição e para determinar a validade de uma amostra de urina local para avaliar a exposição a substâncias químicas [23]. Um kit de creatinina (urinária) ensaio da Cayman Chemical Company (Ann Arbor, MI) foi utilizado de acordo com o protocolo do fabricante para medir os níveis de creatinina urinária. Os níveis de creatinina foram usadas para ajustar as concentrações urinárias de BPA medidos pelo HPLC-ESI-MS /MS para obter os níveis de BPA “ajustado ao creatinina” (níveis de BPA) em mg /g.

Células

o APC linhas de células PC-3, LNCaP, C4-2 e 22Rv1 foram obtidas a partir da American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) e cultivadas sob o padrão, recomendada, condições. Uma descrição da origem da linha de células imortalizada NPrEC epiteliais normais da próstata foi publicada [24]; a outra linha imortalizada de células normais epiteliais de próstata, RWPE-1, foi adquirido a partir de ATCC (Manassas, VA) e foi cultivada em meio de queratinócitos-SFM Definido (Invitrogen, Carlsbad, CA) com suplemento de promoção do crescimento. As culturas celulares foram mantidas a 37 ° C numa incubadora humidificada com 5% de CO

2 atmosfera.

tratamentos BPA

As células de cada linha de células foram semeadas em placas de seis poços com tampa de vidro desliza em 25.000 células /poço. Após 24 h, o meio foi mudado para fenol de meio isento de vermelho com soro retirado-carvão a 10% durante mais 24 h, altura em que a ABP foi adicionado para atingir uma concentração final de 0, 0,01 nM, 0,1 nM, 1 nM, 10 nM, ou 100 nM. O experimento foi repetido cinco vezes para gerar um total de cinco amostras por linha de células por concentração de BPA.

imunofluorescência indireta

Para imunocoloração de centrossomas, as células foram fixadas com metanol durante 5 minutos a -20 ° C e, em seguida, processado para γ-tubulina (anticorpo GTU88 clone, Sigma Immunochemicals), α-tubulina (DM1A clone, Sigma Immunochemicals), e Centrin (SC-50452, Santacruz Biotechnology) Coloração como previamente descrito [25]. Em resumo, as células foram extraídas em 1% de NP-40 em PBS durante 10 min. As células foram sondadas com anticorpos primários, e os complexos anticorpo-antigénio foram detectados com Alexa Fluor 594 488- ou anticorpos conjugados (Molecular Probes). As células também foram coradas para ADN com 4 ‘, 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI, Invitrogen). células imunomarcadas foram examinadas por microscopia de fluorescência.

microtúbulos (MT) formação aster ensaio

O efeito do BPA na dinâmica dos microtúbulos foi determinada por um ensaio de formação de aster MT descrito anteriormente [25]. Em resumo, as células foram tratadas com nocodazole (1,5 ug /ml) durante 40 min em gelo para despolimerizar interfase MTS, lavou-se com PBS para remover o nocodazol, e incubadas em meio fresco quente durante 10 min a 37 ° C para permitir uma MT recrescimento .

Medidas

O número de centrossomas por célula foi marcado por microscopia de fluorescência. Pelo menos 150 células foram examinadas por tratamento, e a percentagem de células com um número anormal de centrossomas calculados a partir do número total de células examinadas foi utilizado como medida do resultado para a análise. Um grande anomalia em CA foi definida como uma célula com mais de dois centrossomas.

Anchorage-ensaio de crescimento independente

As células foram ensaiadas para o crescimento independente de ancoragem através da medição da eficiência de formação de colónias em semi-sólido forma como descrito [26]. Em resumo, as células foram cultivadas sob condições descritas acima, na presença ou ausência de 0,1 nM de BPA, para ~ 10 passagens. Nós escolhemos 0,1 nM, porque esta concentração induzida a maior percentagem de células com a CA para a maioria das linhas de células (ver resultados). Cerca de 2500 células /35 mm de poços foram incorporados em agar mole. As células foram alimentadas duas vezes por semana com meio fresco com e sem BPA. Após 2-3 semanas, as colónias foram contadas sob um microscópio. As experiências foram realizadas em triplicado e repetidas duas vezes. a eficiência de formação de colónias é o número de colónias obtidas dividido pelo número total de células banhado, multiplicado por 100.

A análise estatística

A principal medida na análise clínica foi uma variável contínua de urinária nível de BPA após a normalização ou ajuste para o nível de creatinina urinária. Inspecção inicial da distribuição mostrou que esta variável foi altamente enviesada para a direita. Portanto, a variável de transformada do log (LnBPA) foi utilizado como variável dependente nos modelos estatísticos. O modelo estatístico principal era um modelo de efeito fixo para avaliar a associação entre a LnBPA e estado PCA (1 = yes; 0 = não). Nós aplicamos métodos ambos não ajustadas e ajustadas para o nosso modelo de efeito fixo. No método não ajustada, o status ACP foi a única variável independente. No método ajustado, que incluíram idade (estratificada como a idade ≥65 vs. 65 anos) e os níveis séricos do PSA como co-variáveis ​​que controlam. Realizamos

post hoc

comparações de médias entre APC e pacientes não-PCA e uma comparações semelhantes em subgrupos de pacientes estratificados por idade. testes de soma de classes de Wilcoxon foram utilizados para validar os resultados dos modelos de efeito fixo para assegurar que todos os seus resultados foram robustos (dados não mostrados). Para BPA urinária e outras variáveis ​​independentes numéricos, como níveis séricos de PSA, as relações foram avaliados por modelos de regressão linear e /ou coeficientes de correlação.

in vitro

análises para cada linha celular, foi utilizado o modelo de efeito fixo para avaliar a associação da percentagem de células com CA à concentração de BPA usado para tratar as células e

post hoc

análises ajustado para comparações múltiplas, utilizando um teste de Bonferroni. Os dados do ensaio de crescimento independente de ancoragem foram analisados ​​por dois amostra

t

-Testes. Todos os testes estatísticos foram realizados com um SAS 9.3 software (SAS, Cary, NC) pacote.

P

-Valores. 0,05 foram considerados estatisticamente significativos

Resultados

nível urinário BPA está associada com PCA e pode ter valor prognóstico

Foram estudados 60 pacientes urologia, 27 com PCA e 33 sem APC. A média de idade (± desvio-padrão [SD]) dos pacientes ACP foi de 69,7 ± 10,3 anos (min, 56 anos; máx. 87 anos); eles eram mais velhos do que os pacientes não-APC, que eram de 62,8 ± 7,15 anos (min 46 anos;. máx. 77 anos;

p

= 0,003). PSA níveis séricos de APC e pacientes não-PCA não foram diferentes. A pontuação de Gleason de 71% dos pacientes ACP foi 6 e 7 nas outras. Suas características basais estão resumidos na Tabela 1.

Em todos os assuntos (PCA e não-PCA), os níveis de BPA urinária não foram associados com a idade e PSA sérico e não se correlacionou com pontuação de Gleason de câncer e câncer características relacionados com temas em CaP (Tabela 2). No entanto, os pacientes com CaP tinham níveis mais elevados de BPA urinária (creatina ajustada), com uma média geométrica de CI 5,74 [95%; 2,63, 12,51] ug /g (média ± SD de LnBPA de 1,75 ± 1,97), ao passo que os níveis urinários de BPA pacientes não-PCA tinha uma média geométrica de CI 1,43 [95%; 0,70, 2,88] ig /g (média ± SD de LnBPA de 0,35 ± 2,14;

P

= 0,012, Fig 1A . 1D). análises estratificadas mostraram que a associação positiva foi significativa apenas entre os 30 pacientes urológicos menos de 65 anos (média e mediana de idade = 58 anos, idade mínima = 46 anos). Nos pacientes mais jovens ( 65 anos), a média geométrica dos níveis de BPA na urina dos pacientes ACP foi 8,08 [IC 95%; 2,40, 27,15] ug /g (média ± SD de LnBPA de 2,09 ± 1,71) versus uma média geométrica de CI 0,90 [95%; 0,36, 2,25] mg /g (média ± SD de LnBPA de -0,11 ± 2,09) entre os pacientes não-PCA (

p

= 0,006; A Fig. 1B 1D). Além disso, análises de regressão linear deste grupo mais jovem revelaram uma tendência para uma associação negativa entre níveis de BPA na urina e concentrações de PSA no soro nos pacientes PCA (n = 10, r = -0,52,

p

= 0,10), mas não essa tendência em pacientes não-PCA (Fig. 1C). A correlação não atingiu significância ao nível de 5% por causa do pequeno tamanho da amostra.

níveis de urina de BPA estão associados com PCA. A ABP-log transformado é referido como LnBPA. Os valores no gráfico são ± SD média de LnBPA. níveis de urina de BPA (A) são maiores em pacientes CaP do que em pacientes não-PCA. Meios de LnBPA = 1,75 ± 1,97 em PCA (azul, n = 27) vs. 0,35 ± 2,14 no não-PCA (vermelho, n = 33),

p

= 0,012. (B) LnBPA em CaP vs. LnBPA em non-PCA, estratificados por idade = níveis de BPA 65. urina são significativamente maiores em pacientes CaP jovens do que nos respectivos pacientes não-PCA apenas no grupo etário 65 anos;

p

= 0,006. A análise de regressão (C) linear de PSA no soro em pacientes versus LnBPA apenas 65 anos de idade (n = 30). Quadrados azuis sólidos representam pacientes APC; inverso círculos vermelhos representam pacientes não-PCA. linhas sólidas azuis e vermelhos representam as suas linhas de regressão, respectivamente. (D) A comparação da média geométrica de BPA em APC e grupos não-PCA. A média geométrica (GEO) é definida como a exponencial da média de LnBPA. Os valores são médias geométricas (IC 95%) do BPA em unidades de ug /g de creatinina.

Baixas doses de BPA promovido amplificação centrossoma (CA):

CA é comumente observados em tumores humanos e é um fator importante que contribui para a instabilidade cromossômica [15], [27]. Dependendo do facto de a célula está no G1 ou S /fase G2 /M do ciclo celular, as células normais apresentam um ou dois centrossomas, respectivamente. Verificou-se se o tratamento das células com a ABP alterado o número de centrossomas, por tratamento de culturas de células com concentrações crescentes de BPA (0,01-100 nM) (Figs. 2 e 3). As células não tratadas que serviram como controlos mostraram o perfil centrossoma normal esperada, em que a maioria das células ( 90%) continha um ou dois centrossomas (Fig 3-I, os painéis A, C, E, G, I, K. ). O NPrEC não tratado tinha as células com menor número de aberrações centrosomal (1,7%), seguido por C4-2 (2,9%), LNCaP (3,5%), 22Rv1 (4,9%), RWPE-1 (7,3%), e PC-3 ( 10,4%) (Figura 2). Em contraste, todas as linhas de células tratadas com a ABP mostrou um aumento (de dois a oito vezes, Tabela 3) no número de células com três ou mais centrossomas (Fig. 2, Fig. 3-I painéis B, D, F, H, J, L). As curvas de dose-resposta das duas linhas de células não cancerosas, NPrEC e RWPE-1, e duas linhas de células APC, LNCaP e 22Rv1, revelam uma relação de resposta não monótona (bifásica), com a resposta máxima com 0,1 nM de BPA ( Fig. 2). Por outro lado, as duas outras linhas de APC, C4-2 e PC-3, mostrou uma curva de dose-resposta aumentando planaltos que ao mesmo baixa concentração de BPA (0,1 nM) (Fig. 2). A linha de células epiteliais de próstata não canceroso imortalizada NPrEC-1, apresentou a maior alteração vezes (média ± DP, 8,1 ± 2,4) no perfil do centrossoma (Tabela 3), o que sugere que o seu ciclo de duplicação centrossoma pode ser mais sensível aos efeitos de baixo BPA -dose sobre a promoção da CA.

as linhas celulares NPrEC, RWPE1, LNCaP, C4-2, 22Rv1 e PC3 foram tratadas com meio contendo 10% CSS + 0, 0,01 nM, 0,1 nM, 1 nM, 10 nM e 100 nM BPA durante 72 h. As células foram fixadas com metanol a 100% arrefecido e imunocoradas para centrossomas e núcleos. O número de centrossomas por célula foi marcado por microscopia de fluorescência. Os resultados são apresentados como uma média determinada a partir de cinco experiências separadas. O gráfico de dispersão foi gerado da percentagem de células com um número anormal de centrossomas em resposta ao BPA. As análises foram realizadas utilizando um modelo de efeito fixo para cada linha celular.

post hoc

comparações de médias foram ajustadas por meio de testes de Bonferroni. A mudança vezes é a percentagem de células com centrossomas anormais em 0.1 nM BPA /a percentagem de células com centrossomas anormais a 0 nM BPA.

(i) um aumento no número de centrossoma. As linhas celulares NPrEC, RWPE1, LNCaP, C4-2, 22Rv1 e PC3 foram tratadas com meio contendo 10% de CSS mais 0 ou 0,1 nM BPA durante 72 h. As células foram fixadas com metanol a 100% arrefecido e imunocoradas para centrossomas (anti-γ-tubulina, vermelho) e o núcleo (DAPI, azul). As células foram examinadas por microscopia de fluorescência. Setas apontam para as posições dos centrossomas, e painéis sobre as imagens mostram certo ampliadas das áreas indicadas. Barra de escala, 10 | im. (II) amplificação do centrossoma na presença de BPA não é devido à separação centriole. células RWPE-1 foram tratados com 0,1 nM de BPA durante 3 dias. As células foram fixadas e imunocoradas para centrossomas (anti-γ-tubulina, vermelho), centrioles (anti-Centrin, verde), e o núcleo (DAPI, azul). Setas apontam para as posições dos centrossomas. Painéis em exposição ampliada imagens direitas das áreas indicadas. Barra de escala, 10 ^ m.

Low-dose de BPA não afetou divisão centriole

Estruturalmente, o centrossoma consiste de um par de estruturas cilíndricas chamados centrioles que agir como o unidades de duplicação. Para verificar a integridade dos centrossomas, que imunocoradas para células Centrin, um dos principais constituintes do cilindro centriole, permitindo a visualização do par centriole dentro do centrossoma. FIG. 3 mostra imagens representativas de células RWPE-1. Cada ponto detectada por um anticorpo para y-tubulina (Figura 3-II;. Pains A e D) foi resolvida a um par de pontos (que representa um par centriole) revelada pelo anticorpo para Centrin com uma ampliação maior (Fig 3-II.; Os painéis B e e, painéis a, a “; d ‘, d”). Estes dados indicam portanto que os centrossomas estão intactas, contendo um par de centrioles. Os perfis de centrossoma determinada por contagem do sinal Centrin foram semelhantes às determinadas por contagem do sinal γ-tubulina (Fig. 2). Resultados para LNCaP, C4-2, 22Rv1, e células NPrEC foram semelhantes. Assim, BPA não teve efeitos na separação centrossoma ou divisão centríolo.

Low-dose de BPA reforçada formação aster MT

A ancoragem das MTs e seu alongamento subsequente para formar matrizes MT radiais (ásteres) são acontecimentos críticos durante a interfase e também levar à formação do fuso mitótico associada com a função normal de centrossoma [28]. células RWPE-1 próstata ensaiadas para a formação aster MT (Fig. 4). As células foram tratadas primeiro com nocodazol em gelo para despolimerizar completamente MT interfase; nocodazole foi então removido, e as células foram incubadas em meio fresco quente para MT recrescimento. A capacidade dos centrossomas para nuclear, âncora, e alongar MT foi determinada por co-imunocoloração para centrossomas (anti-γ-tubulina) e MTS (anti-α-tubulina). O aster MT atividade dos centrossomas formação foi avaliada de acordo com o protocolo previamente estabelecido [25]. células não tratadas RWPE-1 mostrou a formação aster insignificante. Após aguda 2-h de tratamento com 0,1 nM de BPA, ásteres curtas foram observados 56% de células. Três dias após o tratamento com BPA (a exposição crónica), ~37% das células mostraram ásteres (Fig. 4A, 4B painéis G-I). Nossos dados indicam, portanto, que o BPA aumenta a formação de MT aster.

O ensaio de formação de aster microtúbulos foi realizada 2-histoquímica para centrossomas (anti-γ-tubulina, vermelho) e MTS (anti-α-tubulina, verde). A formação aster centrosomal foi avaliada como positiva se centrossomas teve um áster MT com mais de 15 mts. Os resultados mostrados na (A) são a média ± erro padrão (SE) a partir de três experimentos. Para cada experiência, 200 células foram examinadas. A significância foi calculada usando o teste t vs. 12:00 Student. *

p

≤0.00002.

exposição ao BPA crônica promove o crescimento independente de ancoragem em células C4-2

A capacidade de exposição ao BPA crónica para transformar ou promover maligno crescimento de NPrEC, RWPE-1, células LNCaP, células e C4-2 foi determinada por um ensaio de formação de colónias em ágar mole. As células foram cultivadas em meio com ou sem 0,1 nM BPA durante 10-14 passagens antes de serem semeadas em agar mole. A formação de colónias por NPrEC, RWPE-1, e de LNCaP foi 2%, e a exposição a 0,1 nM BPA não alterou a eficiência da formação de colónias. No entanto, as células C4-2 expostos ao BPA produzidos substancialmente mais, maiores, de crescimento mais rápido colônias soft-agar (Tabela 4, Fig. 5). A eficiência de formação de colónias por cento (média ± DP) aumentou para 19,25 ± 7,05% com o tratamento BPA comparação com 2,03 ± 0,40% nos controlos não expostos (

P

0,001). O diâmetro das colônias foi 50-400 mm nos controles vs. 100-1,200 mm em células C4-2 tratados com BPA.

imagens representativas de colónias após 2 semanas de incubação em agar. células C4-2 na presença de 0,1 nM de BPA formado colónias maiores (B, B ‘, de diâmetro 100-1200 uM) em comparação com as cultivadas na ausência de BPA (A, A’, diâmetro de 50-400 uM).

Discussão

a evidência de que a exposição ao BPA contribui para CaP foi derivada de estudos em animais [29], [30], [31], [32] ou à base de células [33 ], [34], [35], [36] modelos. Para o melhor de nosso conhecimento, este é o primeiro estudo que fornece evidências preliminares de uma associação de exposição ao BPA com PCA em um ambiente clínico. Nossos resultados em 60 pacientes urológicos mostram que o nível de BPA urinária é um biomarcador prognóstico independente da APC, foram detectados níveis de BPA na urina superior nos 27 pacientes PCA (média geométrica, 5,74 [IC 95%; 2.63, 12.51] mg /g creatinina) em comparação com os dos 33 pacientes não-PCA (média geométrica, 1,43 [IC 95%; 0,70, 2,88] ig /g de creatinina) (

P

= 0,012). O limite de detecção para este estudo foi de 0,05 ng /ml. Vários estudos populacionais agora estabelecido BPA como um contaminante do ambiente ubíquo detectáveis ​​na urina de a maioria dos indivíduos na população dos EUA. Na primeira grande escala estudo transversal em os EUA envolvendo 2.517 participantes do exame 2003-2004 National Health and Nutrition Examination Survey (NHANES) [7], BPA foi detectada em 93% da população a uma média geométrica e uma 95

th percentil concentração de 2,6 ug /g, e 11,2 ug /g, respectivamente; o limite de detecção foi de 0,4 ng /ml vs. 0,05 ng /ml no nosso estudo. Um estudo posterior de 2.747 participantes adultos no 2003-2006 NHANES [37] relataram uma média geométrica de 2,05 mg /g de creatinina (25

percentil: 1:18, 75

percentil: 3,33); o limite inferior de detecção foi de 0,36 ng /ml. Assim, a média geométrica dos níveis urinários de BPA nos pacientes com CaP no presente estudo foi ~2-2.5 vezes maior do que as médias geométricas da aqueles em grandes estudos US transversais. Em contraste, a média geométrica dos pacientes não-PCA neste estudo foi de ~ 50% mais baixa do que a média geométrica destes dois estudos populacionais.

A força deste estudo é a utilização do método recomendado pela centros para Controle e Prevenção de Doenças envolvendo extração em fase sólida juntamente com isótopo de diluição-HPLC-MS /MS para medir BPA urinária total em um laboratório de referência. Além disso, corrigida das variações causadas por fatores que afetam a diluição urinária por expressar os nossos dados em relação às concentrações de creatinina urinária. Finalmente, todos os pacientes tiveram confirmada por biópsia, em vez de auto-relato, o PCA. Uma possível limitação do nosso estudo foi que o BPA urinária total, em nossos pacientes foi medido apenas uma vez. No entanto, de acordo com a literatura atual, as concentrações de BPA urinária total (livre mais conjugados) em amostras spot (medição de uma só vez) é um método confiável de avaliar a exposição da linha de base de todas as fontes ao longo do tempo quando o tamanho da amostra é suficiente [38]. Embora estudos toxicocinéticos demonstraram que o BPA e seu principal metabólito, BPA-glucuronido, têm meia-vida bastante curtos (-2,5 h) na corrente sanguínea e que eles são rapidamente excretados com a urina [39], [40], a população transversal estudos têm sugerido substancialmente mais longas semi-vidas devido à exposição não alimentares, bioacumulação nos tecidos do corpo como gordura, e função hepática, especialmente aqueles relacionados a glucuronidação do BPA [12], [39]. A presença de elevadas concentrações de BPA na urina pode sugerir que os hábitos de vida desses pacientes podem manter níveis mais elevados de exposição. A este respeito, em um estudo clínico, níveis de BPA em amostras de urina coletadas no mesmo dia dos parceiros masculinos e femininos correlacionados [41], apoiando a premissa de que as escolhas de estilo de vida similares podem determinar o nível de exposição ao BPA. Além disso, um estudo recente mostrou maior variabilidade intrapessoal (mais de 1-3 anos) nos níveis de BPA em comparação com a variabilidade total em 80 mulheres [42]. Colectivamente, estes estudos destacam a importância de nossa descoberta de que uma amostragem de um tempo de BPA urinária correlaciona com PCA.

As análises estratificadas mostraram que a associação entre os níveis de BPA na urina e PCA é altamente significativa (

p

= 0,006) entre os 30 pacientes 65 anos (média e mediana de idade = 58, idade mínima = 46), mas que esta associação não atingir significância entre a metade dos pacientes 65 anos (Fig 1).. Estas conclusões são intrigantes, mas desconcertante. À primeira vista, eles sugerem que a maior exposição ao BPA está associada com início mais precoce do CaP. No entanto, com base na teoria de reprogramação de desenvolvimento de cancro risco [43], os nossos resultados levantam a possibilidade de reprogramação no início da vida de CaP em seres humanos. Em estudos com ratos, recém-nascidos alimentados com níveis ambientalmente relevantes de BPA tinham um risco aumentado de desenvolver neoplasias de próstata [29], [44].