Abstract

Apesar de um aumento do nível de XIAP expressão está associado a metástases de células cancerosas, os mecanismos moleculares subjacentes permanecem largamente inexplorado. Para verificar a base estrutural específico de XIAP para a regulação da migração de células cancerosas, introduzimos domínios XIAP diferentes em XIAP

– /- células HCT116, e descobriram que a expressão de reconstituição de comprimento total HA-XIAP e HA-XIAP ΔBIR, ambos que tem domínio intacta ANEL, expressão β-actina restaurado, polimerização de actina e motilidade de células cancerígenas. Considerando introdução de HA-XIAP ΔRING ou mutante H467A, que aboliu a sua função ligase E3, não mostraram recuperação evidente, demonstrando que a atividade ligase E3 de domínio XIAP ANEL desempenhou um papel crucial de XIAP na regulação da motilidade da célula cancerosa. Além disso, em vez de domínio RING domínio BIR era necessário para a interacção com RhoGDI independente da sua actividade de ligase E3. Em suma, os nossos estudos atuais descobriram que o papel de XIAP na regulação da motilidade celular foi desacoplada das suas propriedades caspase-inibitória, mas relacionados com a interação física entre RhoGDI e seu domínio ANEL. Embora a atividade ligase E3 de domínio RING contribuiu para migração celular, que não estava envolvido na RhoGDI vinculativo nem a sua modificação ubiquitinational

Citation:. Liu J, Zhang D, Luo W, Yu J, Li J, Yu Y, et ai. (2012) E3 Ligase Atividade de XIAP ANEL domínio é requerida para as Migrações Cancer Cell XIAP-Mediated, mas não para a sua RhoGDI Encadernação Atividade. PLoS ONE 7 (4): e35682. doi: 10.1371 /journal.pone.0035682

editor: Carl G. Maki, Rush University Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 10 de dezembro de 2011; Aceito: 20 de março de 2012; Publicação: 19 de abril de 2012

Direitos de autor: © 2012 Liu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O financiamento foi fornecida pela United States National Institutes of Health /NCI CA112557 e CA119028-05S110, NIH /NIEHS ES012451 e ES010344. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o inibidor ligada ao X de proteína apoptose (XIAP) é um membro dos inibidores da família de proteínas de apoptose (IAP) [1]. XIAP foi reconhecido pela primeira vez por suas propriedades potentes na regulação da apoptose da célula [2], [3]. Investigações posteriores descobriram que XIAP pode regular outros caminhos celulares desacoplado de suas atividades caspase-inibitória [4], [5], majorly inspirado pelas descobertas de ratos XIAP deficiente, que não apresentava sinais de fenótipo apoptótico ostensiva [6]. Recentemente, uma ampla variedade de provas tem sugerido que os envolvimentos de XIAP no metabolismo do cobre, [7], a motilidade celular [8], [9] e a activação das vias JNK e NFkB [10], [11] não estavam relacionados com o seu efeito inibitório sobre caspases.

As múltiplas funções de XIAP de raiz a partir da sua base estrutural. XIAP é composta por três domínios de IAP de baculovírus de repetição (BIR) no terminal amino e um domínio RING-terminal carboxilo [12]. Cada domínio BIR constituída por cerca de 70 aminoácidos que coordenam a um ião zinco através de resíduos de cisteína e histidina [13]. As suas propriedades anti-apoptóticas são potentes principalmente dependente das funções de uma ranhura no domínio BIR3 e duas superfícies no domínio BIR2 que têm sido relatados para se ligar e inibir a caspase-9 e caspase-3/7, respectivamente [14]. domínio RING é definida pela presença de sete cisteínas e uma histidina que formam arquitectura travessa e coordenam dois iões de zinco [15]. ANEL domínios funcionam muitas vezes como modula que conferem actividade de ligase (E3) ubiquitina [13]. Por mutação do resíduo de histidina chave no aminoácido 467 para alanina de XIAP humana, de Lewis et ai verificaram que era necessária função de E3 ubiquitina-ligase de anel para a activação de NFkB, embora não para a transcrição de Smad-dependente [16], indicando que estrutura- funções com base de XIAP também contexto celular dependente.

O aumento da expressão de XIAP é encontrada em muitos tecidos de câncer e associado com chemoresistance, progressão da doença e mau prognóstico [9], [17], [18], [19 ], [20], [21], [22]. As descobertas recentes de nosso laboratório e outros ‘demonstrou que XIAP poderia regular a metástase do tumor [8], [23], [24]. Metástase tumoral é uma das principais causas de morte na maioria dos pacientes de cancro [25]. Muitas moléculas envolvidas na cascata metastática são controlados pelos membros da superfamília Ras de pequenas proteínas de ligação ao GTP, que são capazes de se ligar PIB /GTP e hidrolisam a GTP conduz à activação de proteínas efectoras a jusante [26]. Humana Rho-GTPases da subfamília compreende 23 moléculas de sinalização, entre os quais RhoA, RhoB, Rac1 e Cdc42 são mais amplamente investigados e relatados para controlar vários aspectos da motilidade celular e a invasão, isto é, a polaridade celular, organização ctyoskeletal, e a transdução de sinal [27], [28].

Rho-GTPases actividade é controlada por quatro componentes principais envolvidos no PIB /ciclo GTPase ligada a GTP, incluindo as proteínas de activação de GTPase (gaps), inibidores de PIB-de dissociação (GDIS), dissociação GDI fatores (GDF), e fatores de câmbio nucleótido guanina (GEFs) [29]. RhoGDI desempenha um papel fundamental no equilíbrio de todo o ciclo de GTPase, impedindo PIB dissocation e mantendo GTP associação através de interacção com o grupo de prenilação de GTPase. Assim, sequestra GTPase no citoplasma, enquanto a localização para a membrana plasmática interna é necessário para a activação da GTPase. Os efeitos inibidores de RhoGDI na actividade de GTPase têm sido apoiadas por várias linhas de evidência [30], [31], [32]. Por exemplo, Leffers

et al

. descobriram que a sobre-expressão de RhoGDI em queratinócitos humanos provocou uma ruptura do citoesqueleto de actina e a inibição da motilidade [32]. Portanto, RhoGDI é considerado como um candidato atraente para regular a actividade de Rho GTPase no tratamento do câncer [26].

Nossos estudos recentes provaram que XIAP mediada motilidades de células cancerosas através de forma RhoGDI-dependente na regulação do citoesqueleto [ ,,,0],23]. No estudo atual, nós elucidado ainda mais os mecanismos moleculares subjacentes interação proteína XIAP-RhoGDI e forneceu a base estrutural de XIAP para a contribuição para a mediação da motilidade da célula cancerosa.

Resultados

domínio RING foi necessária para a expressão de XIAP β-Actina-mediada

expressão de XIAP é elevado em muitas linhas celulares de cancro e estreitamente relacionada com a progressão e a agressividade do tumor maligno [33], [34]. Nosso trabalho recente demonstrou que XIAP poderia regular a expressão β-actina [23]. Como resultado, a depleção de expressão de XIAP atenuada taxa de migração celular e capacidade invasiva como se mostra na cicatrização de feridas e ensaio de trans-poço de ensaio, respectivamente (Figs. 1A-1E). Tomar nota, houve apenas diferença marginal na taxa de proliferação entre WT e XIAP

– /- células quando cultivadas em meio de cultura celular normal (10% FBS) por até 5 dias, que incluiu o intervalo de tempo para o ensaio de cicatrização de feridas ( a Fig. 1F), indicando que a taxa de migração celular reduzida observada em XIAP

– /- células não foi devido a uma proliferação celular defeituosa. Além disso, a dinâmica de indução da polimerização da actina, ou seja, a formação de F-actina, por EGF também foi drasticamente reduzida em XIAP

– /- células detectadas por espectrofotometria (Fig. 1G). Consistentemente, uma clara mudança de morfologia do esqueleto celular e plissados ​​/babados membrana mais periféricas foram observadas em células HCT116 WT tratados com EGF mas não em XIAP

– /- células (Figuras 1 H . 1I). Esses fenômenos foram reprodutíveis com a derrocada das XIAP em células HCT116 (Fig. 2). Por isso, indicou que XIAP, desempenhou um papel fundamental na mediação da migração de células de cancro e invasão.

(A), knockout de XIAP em células HCT116 foi verificada por ensaio de transferência de Western. (B e C), o comportamento de migração celular foi avaliada durante a execução de um ensaio de cicatrização da ferida, e as imagens foram tiradas em diferentes pontos de tempo. barra de escala é 300 mm. A área da ferida foi quantificada utilizando software de análise de migração celular, e os dados quantitativos foram mostrados como indicado (barras de erro representam D.P., n = 3). O asterisco (*) indica uma diferença significativa na percentagem de área ferida entre as linhas de células indicadas (

P

0,05). (D e E), Invasão do WT (Vector), XIAP

– /- (Vector), e XIAP

– /- foi determinada células HCT116 (HA-XIAP), quantificados e expressos como percentagem de invasão. Os resultados foram representados pela média ± S.D. dos dados a partir de experiências independentes com três cavidades em duplicado para cada experimento. O asterisco (*) indica uma diminuição significativa no percentual invasão comparada com a WT (vector) e XIAP

– /- células (HA-XIAP) (

p Art 0,01). (F), as taxas proliferam das linhas celulares indicadas foram avaliados por um kit de ensaio de viabilidade celular CellTiter-Glo® luminescentes. Os resultados foram representados pela média ± S.D. dos poços em triplicado. (G-I), As células indicadas foram tratadas com ou sem EGF e indução de F-actina foi analisado por espectrofotometria (L), ou observada sob microscópio confocal (H), respectivamente. A fluorescência das células foi quantificada pelo software ImageJ de (I). Os dados quantitativos foram mostrados como indicado (barras de erro representam D.P., n = 3). O asterisco (*) indica uma diminuição significativa em comparação com a de células WT (

p Art 0,01).

(A), Knockdown de XIAP em células HCT116 foram verificadas por ensaio de transferência de western. (B e C), o comportamento de migração celular foi avaliada durante a execução de um ensaio de cicatrização da ferida, e as imagens foram tiradas em diferentes pontos de tempo. barra de escala é 300 mm. A área da ferida foi quantificada utilizando software de análise de migração celular, e os dados quantitativos foram mostrados como indicado (barras de erro representam D.P., n = 3). O asterisco (*) indica uma diferença significativa na porcentagem de área ferida entre as linhas celulares indicadas (

p Art 0,05)

proteína XIAP contém quatro domínios funcionais, incluindo três Birs. e um domínio RING (Fig. 3A). A função anti-apoptótica de XIAP Birs foi relatada como sendo atribuíveis à sua ligação e comprometimento da activação de caspase [1]. O domínio ANEL de XIAP pertence a E3 ligase e medeia ubiquitinação e degradação de proteínas [1]. Para verificar a base estrutural específico de XIAP para a regulação da migração de células de câncer, nós transfectadas diferente marcada com HA cDNA XIAP constrói, incluindo full-length (HA-XIAP), o anel de domínio de exclusão (HA-XIAPΔRING), supressão BIR total (HA -XIAPΔBIR), e um ponto de mutação H467A, o que resulta em perda de actividade de ubiquitina-ligase E3, em XIAP

– /-. as células foram identificadas respectivamente, e os transfectantes estáveis ​​(Figura 3B). Re-constitucional expressão de HA-XIAP ou HA-XIAP ΔBIR que contém domínio RING em XIAP

– /- células resultaram num aumento na expressão de β-actina, em comparação com que em XIAP

– /- (Vector) células, enquanto expressão de HA-XIAP ΔRING que contém domínios BIR, ou HA-XIAP H467A que torna abolição da actividade ligase E3, não forneceu reparação comparável (Fig. 3C). Portanto, ele demonstrou esse domínio XIAP ANEL e sua atividade ligase E3 desempenhado um papel na regulação da expressão de β-actina.

(A), Representação esquemática de proteína XIAP e função identificadas de cada domínio. (B e C), Identificação dos transfectantes estáveis ​​abrigando XIAP e seus vários plasmídeos de deleção em XIAP

– células HCT116 – /. Os números sob as bandas indicadas a análise densitométrica das proporções relativas dos níveis de p-actina para controlos de carga (GAPDH) avaliadas por meio de software ImageQuant versão 5.2 (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA). Os resultados foram representativos de pelo menos três experiências independentes.

atividade ligase E3 de domínio XIAP RING foi envolvido na mediação da migração celular e polimerização de actina

Para explorar ainda mais a relevância biológica de β mudança de expressão actina regulada por domínio XIAP ANEL, ferida ensaio de cura foi realizada para comparar as taxas de migração entre vários transfectantes que transportam diferentes domínios de XIAP como identificado na Fig. 3B. De acordo com defeitos na expressão de β-actina, a introdução de nenhum HA-XIAP ΔRING nem HA-XIAP H467A poderia reverter o prejuízo na migração de células de XIAP

– /- células, enquanto expressão de comprimento total HA-XIAP ou HA- XIAPΔBIR, ambos dos quais detêm domínio RING intacta, restaurou a redução da capacidade de migração de células causada pela depleção de XIAP (Fig. 4A). Embora, devido ao baixo expressão relativa de HA-XIAPΔBIR em comparação com a de HA-XIAP nos transfectantes individuais (Fig. 3B), a taxa de cicatrização de feridas observadas no HA-XIAPΔBIR-expressando transfectantes foi mais lento do que no HA-XIAP- células que expressam (Fig. 4A). A percentagem de área ferida deixada não-fechado, em 4

° dia em comparação com a das 0 dias foi quantificada utilizando software de análise de migração celular, que mostrou que as áreas das feridas em XIAP

– /- (vector), HA- ΔRING XIAP e XIAP-HA H467A transfectantes foram marcadamente mais elevada do que em células HCT116 WT (Fig. 4B). Por conseguinte, foi sugerido que a actividade de ligase E3 do domínio RING desempenhou um papel importante na motilidade celular mediada por XIAP.

(A), o comportamento de migração celular foi avaliada com um ensaio de cicatrização da ferida, e as imagens foram tiradas em diferentes Os pontos de tempo. barra de escala é 300 mm. (B), A área ferida deixada un-fechada sobre o 4

° dia foi quantificada utilizando software de análise de migração celular, e os dados quantitativos foi mostrado como indicado (barras de erro representam D.P., n = 2). O asterisco (*) indica uma diferença significativa na percentagem de área da ferida, comparando com a de células (vetor) WT (

p Art 0,05).

filamentos de actina desempenhar um centro de papel em numerosas funções celulares, tais como a migração celular e regulação morfológica [35]. Para determinar o envolvimento potencial de diferentes domínios de XIAP na regulação da polimerização da actina, que trataram células com EGF, e, em seguida, as células para a determinação dos níveis de F-actina extraído por citometria de fluxo usando os transfectantes estáveis ​​acima mencionadas. Mais uma vez, formações de F-actina induzidas por tratamento com EGF foram, obviamente, obtida em células HCT116 WT, XIAP

– /- (HA-XIAP) e XIAP

– /- (HA-XIAP ΔBIR) transfectantes, ao passo que não houve indução de F-actina observáveis ​​em XIAP

– /- (vector), XIAP

– /- (HA-XIAP ΔRING) ou XIAP

– /- (HA-XIAP H467A) transfectantes (Fig. 5A) . O resultado quantificação foi mostrado na Fig. 5B. Tomados em conjunto, os nossos resultados demonstraram que a função do domínio de XIAP ANEL na regulação da motilidade celular e a polimerização da actina foi mediada pela sua actividade de ligase E3.

(A), as células indicadas foram tratadas com ou sem EGF e F- indução actina foi analisada por citometria de fluxo. (B), Os dados quantitativos foram mostrados como indicado (barras de erro representam D.P., n = 2). O asterisco (*) indica uma diferença significativa na indução de F-actina em comparação com a de células (vetor) WT (

p Art 0,05).

XIAP ANEL Domínio interagiu com RhoGDI, independente da sua actividade ligase E3

Nosso trabalho recente demonstrou que RhoGDI estava envolvido na polimerização de actina regulada por XIAP [23]. Por isso, detectada a interacção física entre estas duas moléculas por co-imunoprecipitação utilizando um anticorpo específico anti-XIAP. Os resultados mostraram que RhoGDI foi detectado no complexo de co-imunoprecipitada em XIAP

+ /+, mas não XIAP

– /- células HCT116 (Fig. 6A), o que sugere que pode interagir com RhoGDI XIAP endógena. A interacção entre XIAP e RhoGDI foi adicionalmente verificado mutuamente por detecção de XIAP no complexo de co-imunoprecipitação puxado para baixo pelo anticorpo anti-GFP utilizando transfectantes de XIAP

– /- (HA-XIAP /GFP-RhoGDI), ao passo que houve nenhum nível detectável de XIAP no complexo de Co-IP em transfectantes de XIAP

– /- (HA-XIAP /GFP-vector) (Fig 6B.). Então nós derrubado RhoGDI no WT e XIAP

– células para confirmar a participação de RhoGDI na motilidade celular – /. Cicatrização de Feridas resultados do ensaio mostraram que knockdown de RhoGDI em células WT não causar uma alteração evidente da taxa de encerramento de feridas, no entanto, um aumento notável da migração celular foi observada em XIAP

– /- células (shRNA-RhoGDI) em comparação com o que, em controlo não silenciar, XIAP

– /- células (não-silenciamento) (Fig. 6C). Consistentemente, knockdown de expressão RhoGDI também aumentou o conteúdo de F-actina em XIAP

– células (Si-RhoGDI) expostas a EGF (Figura 6D, p 0,05.) – /. As sequências do gene RhoGDI (401-419), que era complementar do oligonucleótido siRNA em pEGFP-C3 /RhoGDI-re construção, foram mutados para evitar a destruição do ARNm exógeno por RhoGDI siRNA [36]. Como mostrado na Fig. 6E, superexpressão de pEGFP-C3 /RhoGDI-re foi identificado em XIAP

– /- (Si-RhoGDI + RhoGDI-re). Esta expressão de reconstituição de RhoGDI em XIAP

– /- (Si-RhoGDI + RhoGDI-re) drasticamente atenuado polimerização de actina induzida por tratamento com EGF em comparação com o que em XIAP

– /- células (Si-RhoGDI) (2 % vs. 14%, p 0,01, Figura 6F).. Além disso, a expressão de reconstituição de RhoGDI em XIAP

– /- (Si-RhoGDI + RhoGDI-re) células restaurados papel inibitório de RhoGDI na formação de actina filamentosa (Figura 6G.), Sugerindo que a reintrodução de RhoGDI-re compensação habilitado para perda da função endógena RhoGDI na polimerização de actina em XIAP

– /- células. Os nossos resultados evidência desde que RhoGDI pode estar envolvido na regulação de XIAP ANEL mediada por domínio da polimerização de actina e a migração de células

(A), os lisados ​​de WT e de XIAP

-. /- Células HCT116 foram co-imunoprecipitada com XIAP anti-anticorpo (rato) ou IgG normal de murganho, e os imunoprecipitados foram então sujeitas a imunotransf erência com anticorpos anti-XIAP (coelho) anti-RhoGDI (coelho) ou. Cinco por cento de lisados ​​foi utilizada como entrada. (B), de XIAP

– /- células (HA-XIAP) foram transientemente transfectadas com o GFP-RhoGDI ou vector vazio, PTIG-vector. Co-imunoprecipitação foi realizada com esferas de agarose anti-GFP de anticorpo conjugado. Os imunoprecipitados foram então sujeitas a imunotransf erência utilizando anticorpos, tal como indicado. (C). transfectantes estáveis ​​de shRNA-RhoGDI em WT e XIAP

– /- foram identificadas células. A migração celular foi determinada por ensaios de cura de feridas nos horários indicados entre não-silenciamento e transfectantes shRNA-RhoGDI em WT e XIAP

– /- células, respectivamente. A área da ferida foi quantificada utilizando software de análise de migração celular, e os dados quantitativos foi mostrado como indicado (barras de erro representam D.P., n = 3). O asterisco (*) indica uma diferença significativa entre as linhas de células indicadas (

P

0,05). barra de escala é 300 mm. (D), as células indicadas foram tratadas com EGF durante 1 min para a determinação da indução F-actina por citometria de fluxo. (E), expressão constitutiva de GFP-RhoGDI-Re em XIAP

– /- (Si-RhoGDI) foi verificada por Western Blotting. (F e G), a indução Relativa da actina F na presença de EGF foi determinada por espectrofotometria (F), e os níveis de actina filamentosa foram observados sob microscopia confocal (L) nos transfectantes indicados. O asterisco (*) indica um aumento significativo em comparação com aqueles em XIAP

– /- (Si-Control) (

P

0,05), e o (♣) indica uma redução significativa em comparação para aqueles em XIAP

– /- células (Si-RhoGDI) (

p Art 0,001, n = 3)

para determinar domínios XIAP específicas envolvidas na interação. com proteína RhoGDI, nós co-transf GFP-RhoGDI construir com HA-XIAP, HA-XIAP H467A, HA-XIAP ΔRING e HA-XIAP ΔBIR respectivamente, em XIAP

– /- células. Como mostrado na Fig. 7A, HA-tag foi detectado na co-imunocomplexo puxado para baixo pelo anticorpo anti-GFP em transfectantes que albergam HA-XIAP e XIAP-HA ΔBIR. Além disso, a afinidade semelhante para GFP-RhoGDI foi observada em transfectantes de HA-XIAP H467A, uma mutação com a perda de actividade de ligase E3 no domínio RING. Enquanto foi observada apenas uma banda marginal de HA no imunocomplexo de transfectantes ΔRING HA-XIAP, revelando que domínio XIAP ANEL desempenhado um papel na interação com RhoGDI independente sobre a sua actividade ligase E3. Além disso, embora domínio RING de XIAP poderia ligar-se a RhoGDI, a sua interacção não resultar na ubiquitinação de RhoGDI (Figs. 7B e 7C). A conjugação de ubiquitina para RhoGDI mal foi detectado, mesmo na presença do tipo selvagem de ubiquitina exógeno no imunocomplexo puxado para baixo pela GFP que foi marcado para RhoGDI (Fig. 7B). Nem expressar mutante da ubiquitina prestar quaisquer reduções óbvias em ubiquitinação de RhoGDI (Fig. 7B). Também não houve diferença observável em RhoGDI ubiquitination entre as células WT e XIAP

– /- células (Fig. 7B). Os resultados semelhantes foram reproduzidos em células 293T, como mostrado na Fig. 7C. Portanto, sugere-se que embora a atividade E3 ligase foi necessária para a migração celular XIAP-mediada, não era essencial para RhoGDI vinculativo, nem para a sua modificação ubiquitinational

(A), XIAP

-. /- As células foram transfectadas com GFP-RhoGDI, juntamente com HA-XIAP, HA-XIAP H467A, HA-XIAP ΔRING, ou HA-XIAP ΔBIR. Co-imunoprecipitação foi realizada com esferas de agarose anti-GFP de anticorpo conjugado. Os imunoprecipitados foram então sujeitas a imunotransf erência para a detecção de XIAP, utilizando o anticorpo HA. (B). WT (Vector), XIAP

– /- (vetor) e XIAP

– /- (HA-XIAP) células HCT116 foram transfectadas com construções de GFP-RhoGDI em combinação com ubiquitina-WT, ubiquitina-K48R, ubiquitina -K63R ou ubiquitina-K48R /K63R (KKRR). Quarenta e oito horas após a transfecção, as células foram lisadas e co-imunoprecipitada com anticorpo anti-GFP, e, em seguida, coradas imunologicamente com anticorpos anti-anti-GFP e Ub. (C), células 293T foram transfectadas com várias construções como indicado para a detecção de RhoGDI ubiquitinação por anticorpos anti-anti-GFP e Ub. (D), um modelo para a modulação XIAP-regulada de motilidade celular: XIAP se liga a RhoGDI através do seu domínio RING e inibe RhoGDI SUMOilação o que resulta em diminuição da regulação da função de RhoGDI e promove a polimerização de actina e motilidade celular. Ou atividade ligase E3 de domínio XIAP ANEL poderia regular alguns fatores un-verificou que controlam posteriormente migração celular independente da RhoGDI vinculativo.

Discussão

Nossas descobertas anteriores demonstraram que quer nocaute ou knockdown de XIAP diminuiu a migração de células HCT116 e invasão [23]. No presente estudo, nós fornecemos a base estrutural de XIAP para suas funções reguladoras na metástase do câncer. Através da introdução de diferentes domínios de XIAP em XIAP

– /- células, o nosso trabalho mostrou que, em vez de domínio RING domínio BIR era necessária para a expressão β-actina, a migração de células, bem como a interacção RhoGDI. actividade de ligase E3 do domínio RING contribuiu para os primeiros dois efeitos, mas não estava envolvido na RhoGDI ligação, nem a sua modificação ubiquitinational, indicando que o papel de XIAP na regulação da motilidade celular foi desacoplado das suas propriedades de caspase-inibidora, mas relacionado com a sua função de anel que foi em parte atribuível a interação física com RhoGDI (Fig. 7D).

No ensaio de cicatrização de feridas, que descobriram que a expressão de reconstituição de comprimento total HA-XIAP e HA-XIAP ΔBIR, sendo que ambos têm domínio RING, em XIAP

– /- células HCT116 restaurado motilidade celular de cancro, enquanto que a introdução de HA-XIAP ΔRING ou mutante H467A, que aboliu a sua função de E3 ligase, não mostraram restauração óbvio, demonstrando que a actividade de ligase E3 do domínio de XIAP ANEL desempenhou um papel na regulação de XIAP da motilidade da célula cancerosa. Alterações nos níveis de p-actina despertados por expressar vários domínios de XIAP foram consistentes com os seus efeitos na migração celular. O chefe “motor” intracelular de migração celular é citoesqueleto de actina [37]. Estudos anteriores sugeriram que o EGF induziu a migração de células através da reorganização do citoesqueleto de actina e a acumulação maciça de F-actina [38]. Em nossos estudos, mau funcionamento da polimerização de actina em XIAP

– /- células poderiam ser resgatados por expressão re-constitucional de qualquer comprimento total HA-XIAP ou HA-XIAP ΔBIR, enquanto que a sobre-expressão de HA-XIAP ΔRING ou H467A nenhum mostrou essas restaurações. De acordo dos nossos resultados, dados não publicados do Mehrotra também excepcional, que a actividade de ligase E3 de XIAP era crítico para a sua função reguladora na metástase de células com base na observação de que H467A XIAP mutante falhou em sinergia com survivina na estimulação da via dependente de NFkB [24]. Assim, estava claro que a função de regulação de XIAP em células de migração foi dependente da sua actividade de ligase E3 do domínio RING relacionado, em vez de com os seus potenciais de anti-apoptóticas.

Tem sido sugerido que o papel de IAP na célula motilidade pode ser evolutiva conservada desde o

Drosophila

IAP homólogo DIAP1 tem sido implicado na migração celular e morfogénese, controlando a actividade da caspase não apoptóticas [13]. DIAP1 foi mostrado para promover a migração de células do folículo dentro da câmara de ovos durante a

Drosophila

oogenesis via regulação da atividade de pequena GTPase, Rac. Mutações no DIAP1 apresentaram defeitos na migração celular provavelmente devido a alterações na organização celular dependente de actina [13], que foi bastante semelhante com o que observamos em XIAP

– /- células nos estudos atuais. GTPases pequenas desempenham funções importantes numa variedade de acontecimentos celulares, tais como sistemas de actina filamentosa regulam [39]. GTPases da família Rho agir interruptores de bicicleta, pois molecular entre a forma ligada a GDP inactiva no citoplasma e estado ligado a GTP activo na membrana citoplasma [40]. RhoGDI foi caracterizada como um regulador de baixo-GTPases Rho por extraindo-os a partir de membranas e solubilizar-los no citosol. RhoGDI também pode interagir com as regiões de troca de GTPases e restringir a acessibilidade para GEFs e lacunas de modo a manter GTPase nos estados inactivas [39]. Como já relatado aqui, XIAP foi capaz de interagir fisicamente com RhoGDI e inibir a sua actividade na regulação agindo montagem citoesqueleto. Então, quando XIAP foi altamente expresso, atividade RhoGDI foi reprimida que forneceu uma explicação para as observações que derrubar RhoGDI em células HCT116 WT não afetou a taxa de encerramento de feridas desde que a atividade RhoGDI já foi inibida por XIAP, enquanto em XIAP

– /-. células onde o efeito repressivo sobre a atividade RhoGDI era invalidar, RhoGDI derrubando exibiram efeitos muito mais evidente biológicos

Além disso, nossos estudos têm mostrado que domínio RING (XIAP ΔBIR), mas não domínios BIR (XIAP ΔRING ), pode ser co-imunoprecipitado no complexo imunológico com o anticorpo específico contra GFP-RhoGDI. Embora a actividade de ligase E3 do domínio RING foi demonstrado ser necessário para a migração de células, perturbações da sua função por mutações H467A não afectam a interacção com RhoGDI. Então, se a hipótese de que, além de RhoGDI, pode haver outros alvos a jusante da actividade ligase E3 de XIAP responsável por controlar a motilidade celular, como NFkB [24] ou alguns fatores un identificado. Embora a atividade ligase E3 de XIAP contribuiu para autoubiquitination de si mesmo e ubiquitinação de seus parceiros de ligação, como Smac e FIA ​​XIAP, RhoGDI não foi submetido a conjugação da ubiquitina mesmo quando XIAP foi overexpressed.

Juntos, os nossos estudos atuais revelaram que a actividade de ligase E3 domínio de XIAP ANEL contribuiu para a polimerização da actina, a formação do citoesqueleto e a migração celular. Apesar do domínio RING foi necessário para RhoGDI interacção que mediada motilidades celulares, a sua actividade ligase E3 não estava envolvido na RhoGDI vinculativa ou ubiqutination. A base molecular alternativa para a sua actividade ligase E3 ainda continua a ser completamente caracterizado.

Materiais e Métodos

Os plasmídeos

Os plasmídeos que expressam HA-marcado XIAP, HA-XIAP ΔRING, HA-XIAP ΔBIR, HA-XIAP H467A, e PEBB-HA expressão vazia vector, foram presentes de Dr. Colin S Duckett (Universidade do Texas em Austin, Austin, TX) [16]. vector pEGFP-C3 /RhoGDI expressando a proteína fluorescente verde (GFP) tagged RhoGDI e Rac1 foi gentilmente cedido pelo Dr. Mark R. Philips (Escola de Medicina da Universidade de New York, New York, NY, EUA). ARNp-U6 /siRhoGDI e pEGFP-C3 /mRhoGDI (gene RhoGDI foi mutado de 403-AAA GGC GTC AAG ATT GAC-420-403-AAG GGA GTA AAA ATC GAT-420 para evitar a destruição do mRNA exógena pelo siRNA correspondente) foi fornecida pelo Dr. BL Zhang como descrito anteriormente [36]. plasmídeos XIAP humana e RhoGDI shRNA foram comprados da Open Biosystems (Pittsburgh, PA):

Cultura de Células e Transfecção

de tipo selvagem e XIAP

-. /- células HCT116 (câncer de cólon humano linhas de células) foram presentes amáveis ​​do Dr. Bert Vogelstein (Howard Hughes Medical Institute e Sidney Kimmel Comprehensive Cancer Center, Johns Hopkins Medical Institutions, Baltimore, MD) [37]. WT e XIAP

– /- células HCT116 foram cultivadas em meio de McCoy 5A (Invitrogen, Carlsbad, CA) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS, Nova-Tech, Grand Island, NE) e penicilina /estreptomicina (Life Technologies , Grand Island, NY). transfecções de células foram realizadas com Lipofectamina reagente (Invitrogen) ou FuGENE® HD Transfection Reagent (Roche Applied Science, Indianapolis, IN). Para a transfecção estável, as culturas foram submetidas a higromicina B ou a G418 ou a selecção de drogas de puromicina (Life Technologies), e a partir de células sobreviventes a selecção de antibiótico foram reunidas como transfectantes estáveis ​​de massa. Estes transfectantes estáveis ​​foram então cultivadas no meio antibiótico livre-seleccionada para, pelo menos, duas passagens antes da sua utilização nas experiências.

Cicatrização de Feridas Ensaio

As células foram semeadas em cada poço de placas de 6 poços e cultivadas até 80% de confluência. As feridas foram feitas por pontas de pipetas estéreis. As células foram lavadas com PBS e, em seguida, cultivadas em meio normal durante os vários pontos de tempo isento de soro. As fotografias foram tiradas a cada 24 h até que a ferida foi curada nas células parentais [41]. A área da ferida foi quantificada usando o celular software Análise de Migração (muscale LLC, Scottsdale, AZ).

celular Invasion Ensaio

A BD BioCoatTM MatrigelTM Invasion Câmara (BD Biosciences, San Diego, CA) foi utilizado para o ensaio de invasão. Cells (2,5 × 10

4) foram semeadas por pastilha em triplicado em meio 5A 500 mL de soro livre de McCoy. Insersores foram colocados em cavidades que continham 500 ul de meio com FBS a 5% e TPA (20 ng /ml). As células foram incubadas durante 72 h numa incubadora com 5% de CO

2 atmosfera humidificada. Em seguida, as células sobre a superfície superior dos filtros foram em primeiro lugar representado e, então, completamente removida por limpeza com uma mecha de algodão. A membrana foi cortada com um bisturi afiado e colocados em placas de 96 poços.