Sumário

ERG, um membro da família do factor de transcrição ETS, é frequentemente sobre-expressos em câncer de próstata como resultado de sua fusão com o gene TMPRSS2 andrógeno-responsivo. Diferentes rearranjos genômicos e eventos de splicing alternativo em torno da região da junção levar a múltipla combinação de TMPRSS2: ERG transcrições de fusão que se correlacionam com diferentes agressividade do tumor, mas as suas funções específicas e atividades biológicas ainda não estão claros. A complexidade do padrão de expressão do ERG é agravado pela utilização de promotores alternativos, locais de splice e os locais de poliadenilação, locais de iniciação da tradução em ambos os contextos nativas e de fusão. Nossa caracterização sistemática do ERG nativa e TMPRSS2: ERG variantes revela que o seu potencial oncogénico diferente é afetado pelo status do domínio Ets e da configuração da região UTR 5 ‘. Em particular, expressão e atividade da ERG funcional e TMPRSS2: ERG variantes são influenciados tanto por sinais de iniciação da tradução no âmbito dos diferentes isoformas e pelo inibidor a montante Abrir Reading Frames (uORF) em seus 5 ‘UTRs. A expressão estável de ERG e TMPRSS2: ERG variantes promoveu a migração de células /invasão, induzida por um bloco de proliferação e induzido um estado de senescência semelhante, sugerindo um papel para estas variantes no processo de tumorigénese da próstata. Além de TMPRSS2: produtos de fusão ERG, um grupo de isoformas ERG nativas relacionados também é altamente sobre-expresso em cancros da próstata de transporte de fusão, e compartilhar o mesmo local de iniciação da tradução (em ERG exon 4) com o exon1 TMPRSS2 comumente observada unida a ERG exão 4 (T1: E4) variante derivada de fusão. Uso deste ATG pode ser, preferencialmente, regulada por compostos à base de anti-sentido dirigidos, possivelmente representando a base de uma abordagem específica que distingue entre associada ao tumor e normal ERG

Citation:. Zammarchi F, Boutsalis G, Cartegni L (2013) 5 ‘Control UTR de Native ERG e TMPRSS2: ERG Variantes Atividade no câncer de próstata. PLoS ONE 8 (3): e49721. doi: 10.1371 /journal.pone.0049721

editor: Bin Tian, ​​UMDNJ-New Jersey Medical School, Estados Unidos da América

Recebido: 27 de julho de 2012; Aceite: 19 de setembro de 2012; Publicação: 05 de março de 2013

Direitos de autor: © 2013 Zammarchi et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O trabalho era suportado por PC081477 concessão DOD. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução translocações

cromossômicas estão bem estabelecidos os eventos-chave no desenvolvimento de malignidades hematológicas e sarcomas [1]. A identificação de translocações recorrentes entre o gene e os membros da família Ets de fatores de transcrição no câncer de próstata (PCA) TMPRSS2 andrógeno responsivo mudou o panorama da biologia CaP [2].

Mais de 80% do CaP amostras abrigar fusões oncogénicos, mais comumente envolvendo a região 5 ‘do locus TMPRSS2 (com o seu promotor) unido ao quadro de leitura aberto (ORF) de vários genes Ets [3], embora outras combinações têm sido descritas [4], [5] , [6]. O único rearranjo mais comum, TMPRSS2 exon1 unida a ERG exon 4 (T1: E4, ou variante III) está presente em ~ 50% dos casos de CaP [3]

ETS fusões de genes desempenham um papel na transição. de neoplasia intraepitelial prostática (PIN) para adenocarcinoma e estão associados a lesões agressivas e mau prognóstico [7], [8], [9], [10], [11]. A sobre-expressão de ERG em linhas de células de próstata activa programas de invasão celular e resulta no desenvolvimento de pinos em ratinhos, mas não pode conduzir a carcinogénese [5], [8], [10], [12], como a cooperação com lesões genéticas separadas, por exemplo perda de PTEN, é necessário para desencadear a progressão para doença avançada [7], [13], [14].

Várias variantes do produto do gene normal de ERG foram descritos, resultante de uma combinação de splicing alternativo, poliadenilação e iniciação da transcrição [15], [16], [17], [18]. Os detalhes dos rearranjos genômicos também introduzir heterogeneidade estrutural considerável na ‘região 5. Além do T1 comum: E4 transcrição, exons TMPRSS2 1, 2 e 3 pode ser combinado com exons ERG 2, 3, 4, 5 e 6 em vários padrões de splicing alternativo que podem gerar, pelo menos, 17 TMPRSS2 distintas: transcrições ERG [2 ], [19], [20], [21]. Estes podem servir como marcadores para a progressão da doença e correlacionam-se com a agressividade de tumores [8], [9], [19]. Em particular, o T2: variante E4 (TMPRSS2-exon2: ERG-exon4 ou variante VI), em que o ATG nativa em TMPRSS2 exão 2 está em grelha com o ERG ORF, está associado com aspectos patológicos e clínicos de doença agressiva [19] .

o mecanismo de base para o potencial oncogénico diferentes das isoformas de fusão continua a ser elucidados, e pode ser relacionada com as diferenças intrínsecas nas regiões N-terminais ou para o efeito (s) que a variação na 5 ‘região do mRNA pode ter sobre a estabilidade de ARN ou expressão.

para testar esta hipótese, avaliou-se o uso de 3 promotores alternativos, 2 eventos de splicing alternativo comuns e 3 locais de poliadenilação (PAS) em tecidos normais em relação ao TMPRSS2: ERG-expressando tumores da próstata. Estes eventos regulados de forma independente se combinam para gerar 30 “principais” isoformas nativas, algumas das quais encontramos a ser também altamente sobre-expressos em tumores. A caracterização dos locais de iniciação da tradução usados ​​pelas variantes ERG e fusão nativas mais comuns revela que o organismo específico de região UTR 5 ‘é um dos principais factores determinantes da sua actividade biológica e identifica um ATG no exão 4, como um alvo putativo para a inibição de tradução baseada em antisense no câncer de próstata.

resultados e Discussão

estrutura do gene ERG

Várias isoformas ERG nativos podem surgir devido a uma combinação de promotores alternativos, splicing e poliadenilação. Estas isoformas pode, por sua vez combinam com TMPRSS2 e outros parceiros 5 ‘para produzir numerosas variantes ERG derivados, com valores de prognóstico variável [8], [9], [19]. Para entender melhor as atividades de produtos oncogénicos ERG derivados, buscou-se esclarecer, inicialmente, a estrutura do gene ERG e caracterizar seu padrão de expressão.

Existem inconsistências consideráveis ​​na nomenclatura ERG publicou, com pelo menos quatro classificação diferente esquemas, com a consequência óbvia de gerar confusão na compreensão e comparação de dados a partir de diferentes estudos (por exemplo: o grande exão terminal que contém os Ets e domínios de transactivação é variavelmente referidos como exon 11 [2], [22], 12 [3] , 16 [18], [23], 17 [24]).

Nós relatamos na Figura 1A uma vista up-to-date da estrutura exon-intron do locus -300 Kb ERG (ENSG000000157554) e propor uma nomenclatura unificada e racional de variantes de RNA e proteínas que visa incorporar as convenções mais estabelecidos. A estrutura baseia-se principalmente sobre os 11 exons de RefSeq NM_004449.4 entrada (UniProt P11308 entrada para ERG2), e incorpora a numeração exão utilizado no trabalho seminal Tomlins [2], [22] primeiro descrevendo a fusão TMPRSS2: ERG. Em suma, temos mantido como “exão 4” do exão 218nt que é o principal parceiro de TMPRSS2 e como “exon 11” a grande exão 3897nt codifica o domínio Ets; nomeamos Exon 1a, 1b, 1c a «primeira» exons três mutuamente exclusivas seguindo os três promotores validados P

A, P

B e P

C. Para garantir a inclusão racional dos exons adicionais que poderiam ser identificados no futuro, nós diferenciados por letras os exons alternativos que não fazem parte dos 11 queridos referência. Por exemplo, o 72 exão nt alternativa incluída entre exons 7 e 8 é chamado de “exão 7b ‘

(A) superior:. O ERG lócus -300 Kb humana, elaborado aproximadamente à escala. tamanhos aproximados de intrões estão indicadas, juntamente com os exões posição (barras). O vermelho indica primeiros exons, as alternativas comuns azuis e os incomuns cinza. Médio: estrutura Exon, com exão tamanhos na parte inferior. As caixas azuis indicam as principais ORF previstos, caixas brancas as regiões não traduzidas e cinza os exons incomuns. Os círculos vermelhos indicam locais poliA. Resumindo: o alinhamento dos exons que formam o principal ORF (ERG-1b) com domínios da proteína. Os números indicam o tamanho em aminoácidos. PNT = domínio pontas, AD = domínio alternativo, domínio Ets = Ets, TAD = domínio de transativação. Asterisk e um círculo indicar a posição do primeiro e segundo ATG. principais variantes (B) ERG Humano. Alinhamento de exões que formam os 30 principais variantes de ARN de ERG humano. Azul indica que o ORF, a luz azul a região adicional do ATG no exão 3. Para cada variante, o nome proposto é indicada ao lado nomenclatura anterior (caso exista). O nome proteína proposta é relatada ao longo do tamanho previsto no aa e kDa. Variantes derivadas do uso alternativo de promotor de 1a e 1b estão emparelhados como eles levam a mRNAs relacionados e proteínas idênticas

Em seguida, identificou os principais eventos regulamentares alternativas que geram a maioria dos ERG variabilidade: 3. Alternativa promotores (P

A, P

B e P

C); dois eventos de splicing alternativo comuns (de inclusão /falha do exão 4 ou 7-B); três sinais poliA separados (PAS 7bpA, 11LpA e 12pA). uso combinatória dos eventos alternativos gera 30 possíveis “grandes” variantes ERG transcrição (Figura 1B), que pode codificar 15 diferentes previu polipeptídeos relacionados com o ERG, com 3 diferentes N-terminais, C-3 terminais diferentes e uma possível variação interna (inclusão ou salto de 24 aa no domínio alternativo codificadas pelo exão 7b).

em adição ao 30 «maior» variantes descritas na Figura 1, uma multiplicidade de isoformas ‘menores’ têm sido relatados na literatura ou são apresentar em bancos de dados. A lista inclui variantes que mostram saltando de exons 2, 5, 7 e 8; uso de um proximal local (Short) poliA no exão 11 (11SpA) ou de um já intrônica adicional a jusante do exão 8 (8PA); e inclusão de complementar os exões alternativos 7c, 10b e de múltiplos exões alternativos derivados de intrão 3 (exões 3b-H), indicadas a cinzento na figura 1A. Isoformas ERG4, ERG6 e ERG9 do estudo anterior Owczarek [18] são variantes menores e foram reclassificados neste grupo

.

Uma vez que qualquer desses eventos menores adicionais poderia combinar de forma independente, com todas as principais isoformas estruturalmente compatíveis, centenas de variantes poderiam potencialmente ser gerado. No entanto, esses eventos parecem ocorrer esporadicamente e sua relevância fisiológica é desconhecida

ERG Expressão:. Um Switch associados ao câncer em Promotor Uso

Nos propusemos a investigar o uso de promotores, PAS ou sinais de splicing por análise de qPCR de expressão do ERG em diferentes tecidos normais, tumores e linhas de células (Figura 2). Embora um certo grau de variabilidade tecido-a-tecido é observada (Fig. S1A), no promotor geral P

C (média ôc (t) = 10,2) parece ser o mais activo em tecido normal (incluindo na próstata), ~ 25 ~ 10 vezes e vezes mais activa do que a média de promotores P

A (ôc (t) = 14,9) e P

B (ôc (t) = 13,4), respectivamente (Figura 2A). Por outro lado, em um painel de 8 amostras primárias CaP expressando fusões TMPRSS2-ERG, promotor P

B (média Sc (t) = 5,4) representa a maioria da transcrição nativo ERG e está presente em níveis comparáveis ​​aos da própria fusão (ôc (t) = 6), mais de 100 vezes mais abundante do que o mesmo transcrito na próstata normal (ôc (t) = 12,8) (Figura 2B e Fig. S1A). Com efeito, em vários TMPRSS2: amostras ERG-transportando o P nativa

promotor de B, em vez do gene de fusão, é a principal fonte de ERG transcrição (Fig S1B.). Comparado a próstata normal, os promotores P

A (ôc (T) = 9) e P

C (ôc (t) = 8), também são activados, mas não com o grau de P

B. Em linhas de células APC, P

B é o único promotor ERG nativa activa, com sinais detectáveis ​​de P

A ou P

C (Figura 2C). Duas das linhas celulares testadas com CaP, capnografia, e NCI-H660, expressar a fusão TMPRSS2: ERG (Figura 2C, símbolos cheios), que é em vez ausente em linhas de células que não contenham o CaP TMPRSS2: ERG (LNCap, DU145, C4- 2, símbolos abertos e Fig. s1c). Tal como esperado, nenhuma expressão de qualquer um dos promotores nativos foi observado na linha celular NCI-H660, que transporta a fusão em ambos os alelos e perdeu todos os promotores endógenos [25].

quantificação por qPCR de alternativa ERG variantes no tecido normal (a, D), as amostras de CaP primárias (B, e) e linhas de células APC. (C, F). (A-C) Quantificação da utilização promotor. conjuntos de primers específicos para os 3 promotores ERG diferentes e para a fusão TMPRSS2: ERG onde usado, juntamente com um conjunto de iniciadores abrangendo exons 5-7 para quantificar total de ERG. Tecidos normais não expressam o produto de fusão. A expressão de variantes de 1a e 1c é virtualmente indetectável nas linhas celulares de CaP analisados. Para o painel C, símbolos abertos indicam LnCap, DU145 e C4-2 (não expressando fusão TMPRSS2: ERG), símbolos completos indicam VCap e NCI-H660 (expressando fusão TMPRSS2: ERG). Ver também a Fig. S1 A-C. (D-F) Quantificação por qPCR de utilização alternativo de poliadenilação. conjuntos de primers específicos para os 3 sites de poliA diferentes onde usado, juntamente com um conjunto de primers para quantificar total de ERG e um conjunto de quantificar exão total de 11 níveis, a fim de inferir o uso 11SpA. Ver também a Fig. S1 D-F. Em todos os casos, cada valor indicado representa médias de ≥3 experiências independentes e é apresentado como ôc (t) normalizados para o gene GAPDH de limpeza, por conseguinte, um valor de “alta” ôc (t) significa baixos níveis de expressão e um valor “baixo” significa elevado nível de expressão. As barras horizontais indicam a média. Os asteriscos indicam que o produto não foi detectado na amostra e, portanto, seria equivalente a um ponto experimental na parte superior da mesa, mas não se reflecte pela média.

A partir deste primeiro conjunto de experiências concluímos que um interruptor promotor ocorre em tumores APC e das linhas celulares e que o aumento do uso de promotor nativo P

B é associado com (e possivelmente contribui para) o fenótipo tumoral.

a superexpressão de ERG no CaP foi anteriormente descrito [23], mas a seguir a descoberta do TMPRSS2: ERG, que tem sido tipicamente atribuída a este evento. No entanto, a nossa conclusão de que, para além dos transcritos derivados de fusão, algumas variantes ERG nativa podem também ser altamente sobre-expresso em APC, sugere um papel mais importante para o desenvolvimento do ERG nativa em CaP. Isto é suportado pela observação de que o mouse endógena

ERG

transcrições são sobre-expressos em tumores de próstata condicional

Pten

– /-;

Trp53

– /- ratos, em comparação com

Pten

– /-;

Trp53

+ /+ camundongos [7]. Importante, enquanto o modelo de último resulta em uma forma indolente da APC, o ex produz um fenótipo agressivo [7].

A ativação diferencial dos três promotores nativos nas amostras de PCA-transportando de fusão sugere que esta expressão aberrante é transcricionalmente regulado. Uma possibilidade intrigante é que a ativação do

promotor B nativa P pode ser acionado diretamente ou indiretamente, por si só ERG como parte de um circuito regulador positivo. Por exemplo, vários elementos responsivos de c-myc putativas foram identificadas imediatamente a montante do ERG P

B promotor [18]. Uma vez que c-Myc é um alvo a jusante chave de ERG [26], a activação dependente de androgénio do ERG a partir da fusão, ou uma activação Myc dependente de PTEN separado [27] pode desencadear um GRE /Myc circuito oncogénica auto-sustentável, que poderia eventualmente tornar-se independente de androgénios. Na verdade, de forma consistente com este modelo, um mecanismo de feed-forward, onde expressão de ERG endógena é controlada pela superexpressão do produto de fusão foi recentemente descrito [28]

ERG Expressão:. Poliadenilação alternativa e emenda

de forma análoga ao que fizemos para estudar o uso do promotor, que, em seguida, explorou o papel de poliadenilação alternativa e splicing na expressão das variantes do ERG. Dos três PAS principais descrita (Figura 1), a 11L-PA é necessária para uma proteína ERG totalmente funcional, enquanto que a PAS em 7b intrão (7b-PA) e o exão 12 (12-PA) gerar isoformas ERG C-terminal truncado sem o domínio Ets DNA de ligação e o domínio de transativação (TAD).

o 11L-pA PAS foi o mais comumente usado em tecidos normais (média, Sc (t) = 10,8), cerca de 8 vezes mais que 7b-pA (ôc (t) = 13,8) e 50 vezes mais do que 12 pa (ôc (t) = 16,6) (Fig. 2D). No entanto, em TMPRSS2: ERG-expressando amostras de PCA (Sc (t) = 5,2), o uso de 7b-PA é fortemente activado, e torna-se quase tão comum como a 11L-PA (Sc (t) = 5,8) (Figura 2E) . O mesmo é verdade em linhas celulares de CaP expressando a fusão (Figura 2F), sugerindo que a mudança para este padrão de expressão poderia se correlacionam com a progressão do tumor. É importante notar que, enquanto esta variante não tem os Ets e domínios TAD, ele retém os determinantes de dimerização, e, assim, a sua expressão pode influenciar a actividade de outras variantes de corpo inteiro presentes. A PAS proximal no exão 11 (11S-PA) [15], [18] foi avaliado indiretamente através da comparação qPCR das regiões de cada lado dele (E11 e 11L-PA), e os níveis de expressão semelhantes foram observados, sugerindo que o uso de 11S-pA é marginal na maioria das condições normais e patológicos (Figura 2D-F e Figura S1D-F)

Uma vez que as variantes de splicing alternativo pode influenciar TMPRSS2 ERG ou:. funções de fusão ERG [24], foram analisadas as regiões 7b em torno do exão e o exão 4 em tecidos normais, amostras de APC e linhas celulares por PCR semi-quantitativa. Ambos os eventos de splicing alternativo eram facilmente detectável, com uma clara prevalência dos exão 4 e exon variantes de inclusão 7b. No entanto, não observamos qualquer enriquecimento significativo na quantidade relativa de ambos variantes de splicing em amostras APC, sugerindo que a modulação desses dois eventos de splicing específicos podem não desempenhar um papel determinante na CaP.

No total, estes dados indicam que os produtos completos, contendo 7b exão e os ETs e domínios TAD, são os mais abundantes ERG variantes independentemente do estatuto das regiões a montante, tanto em tecidos e tumores normais. O forte aumento do truncada TE: 7bpA isoforma em relação à variante de corpo inteiro poderia simplesmente refletir as mudanças na máquina splicing /poliadenilação de células cancerosas, mas também pode indicar o seu papel (ainda inexplorada) no ERG biologia em tumores

a heterogeneidade N-terminal do ERG isoformas

Para avaliar se a heterogeneidade descrito na região 5 ‘afetar a expressão ea atividade ERG, nós, os sub-clonado o nativo variantes ERG-1a, ERG-1b, ERG -1-C, ERG-1b.Δ4, ERG-1c.Δ4, ea fusão comum variante T1: E4, com seus completos 5 ‘UTRs e com 7b exão incluído (Fig 3A.). Após a transfecção transiente em células HeLa, o ADNc do ERG-1c eficientemente expressos a 54 KDa esperado do produto (Fig. 3B, pista 4). Pelo contrário, a expressão do ERG-ERG e 1a-1b variantes nativa foi ineficaz, resultando em péptidos mais pequenos do que o esperado se ~55 KDa o primeiro ATG em enquadramento no foi utilizado exão 3 (Fig. 3B, pistas 2-3 ). Curiosamente, este péptido co-migrou com que gerado pela sobre-expressão transitória do T1: variante fusão E4, em ~ 50 KDa (pista 5). variação adicional na região N-terminal deriva de exão 4 de salto, o que altera ORF principal do ERG de modo que os ATGs início previsto no exão 1c ou exão 3 não seria capaz de gerar um peptídeo relacionado com o ERG (Figura 3A). sobreexpressão transiente de ERG-ERG-1b.Δ4 ou 1c.Δ4 ambos resultou em péptidos relacionados-ERG migrando a ~44 KDa, consistente com o uso de um em grelha M5 ATG no exão 5 (Figura 3B, pistas 7,9) . Isto é mais evidente quando se utiliza ERG anticorpo C-17, que prontamente reconhece ERG recombinante, mas não as proteínas endógenas. Um anticorpo ERG diferente (C-20), preferencialmente reconhece uma banda endógena correspondente em tamanho para ERGΔ4 (pistas 1-5), fazendo a transição para o uso M5 mais difícil de detectar

.

(A) heterogeneidade N-terminal em ERG variantes nativos humanos. Das regiões 5 para as variantes indicadas são reproduzidas. Caixas representam exons com a ORF em azul. Vermelho carrapatos abaixo indicam os exões ATG em grelha nos exões 1c e exões 3 a 5. Os produtos de fora da estrutura causadas pela exclusão de exon, a partir do de outro modo no ATG do quadro são indicados no vermelho. (B) Western Blot (WB) da expressão transitória das variantes em células HeLa. Anticorpo C20 reconhece proteína exógena e uma banda endógena na ~44 KDa correspondendo em tamanho para Δ4 variantes. O anticorpo reconhece preferencialmente C17 bandas ERG exógenos. (C) As mutações que eliminam os 3 independentemente ATG em grelha no exão 4 foram introduzidas no ADNc de T1: E4 e analisada como acima. (D), da mesma forma, as mutações foram introduzidas para eliminar os ATGs no exon 3 (ERG-1b) ou em 1c exão (ERG-1c) por si só ou em combinação com mutações no primeiro em grelha ATG (M4A) no exão 4 (ERG-1b e ERG-1c)

desde T1:. E4 não tem os códons de iniciação previstos a partir ambos os transcrições TMPRSS2 e ERG, um ATG interno alternativo de dentro de leitura aberta do ERG devem ser usadas para expressar um produto relacionado com a do ERG a partir do mRNA de fusão, provavelmente desde o exão 4. para identificar o T1: E4 codão de iniciação, uma metionina de série-para-alanina mutações pontuais foram gerados para os três codões ATG em-quadro presente no ERG exão 4 ( A Fig. 3A). A mutação nos nucleótidos 79 (M4A), mas não 121 (M4B) e 184 (M4C) de exão 4 T1 abolida: Expressão de E4 (figura 3C), indicando que o transcrito de fusão utiliza o primeiro em grelha ATG para a expressão do péptido ERG .

Para mapear os ATGs a partir do ERG nativa isoformas mutações semelhantes onde também introduzidos sozinhos ou em combinação nas primeiras ATG em grelha no exão 3, 1c e 4 (Figura 3D). A mutação do ATG do exão 3 (M3) não tem qualquer efeito sobre a expressão do produto de ~ 50 kDa (Figura 3D, pistas 2 vs. 4), enquanto que a mutação do ATG próxima no exão 4 (M4A) que anulou tanto no contexto em peso e M3 (Figura 3D, pistas 3 e 5), indicando que ERG-1b (e ERG-1a) não usar o seu primeiro ATG em grelha, como seria previsto por um varrimento dependente de 5’cap modelo de iniciação da tradução [29]. Em vez disso, o uso da sequência ATG do exão 4 gera um péptido idêntico ao que codificado pelo T1: fusão E4. Pelo contrário, quando o codão de iniciação no exão 1c é mutado (M1c), a mobilidade do ERG-1C é reduzido de ~54 kDa e ~ 50 kDa (Figura 3D, pistas 6 x 8), como T1: E4 e ERG-1b (pista 1 e 2), de acordo com um interruptor ao M4a ATG. Na verdade, a mutação desta resultados ATG na revogação do produto ~ 50 KDa em favor de um produto ainda menor.

caracterização biológica das isoformas ERG

Para avaliar se a estrutura N-terminal as diferenças entre a associada a cancro do ERG-1b /T1: E4 e o ERG-1c normais intrinsecamente afectar a sua actividade biológica, que inicialmente expressa de forma estável os seus correspondentes ADNc em células NIH-3T3 (Figura 4A) e os clones seleccionados com a expressão robusta. De acordo com relatórios anteriores, observamos promoção da invasão e migração celular por ambas as variantes ERG, como ensaiado pela migração trans-bem através de matrigel (Figura 4B) e ensaio de zero ferida (Figura 4C-D). A extensão do efeito sobre a migração /invasão foi comparável em ERG-ERG-1b e 1c, indicando que eles são igualmente activa, pelo menos em alguns aspectos fundamentais da sua biologia.

(A) células NIH-3T3 estavelmente expressando de alto nível do ERG-ERG-1b e 1c foram analisados ​​tal como na figura 3. (B-C) a seguir à selecção de drogas, os clones (1B e 1C), o controlo do vector vazio (pLPC) e tratada NIH-3T3 que sobre-expressam ERG células (nt) foram ensaiadas quanto à sua capacidade de invasão utilizando um ensaio de invasão em matrigel (B), e em um ensaio de ferida zero padrão para medir a sua motilidade (C). (D) Quantificação de (C), utilizando o software ImageJ. As barras indicam o desvio padrão. (E) Curva de crescimento de clones estáveis ​​NIH-3T3. Após a selecção, as células foram fixadas em intervalos de 48 horas durante um período de 8 dias e coradas com violeta de cristal. (F) Depois de selecção de droga, clones estáveis ​​NIH-3T3 foram semeadas e privadas de soro, e a morte celular foi medido pelo método do azul de tripano. (G) 5 dias após a selecção de clones estáveis ​​de drogas NIH-3T3 foram coradas para SA-β-galactosidase. curva (H) Crescimento de células IMR90 que expressam de forma estável de alto nível de ERG1b /T1: E4 ou o vector vazio. Após selecção de droga, as células foram fixadas em intervalos de 48 horas durante um período de 8 dias e coradas com violeta de cristal. (I) 5 dias após a selecção de drogas IMR90 clones estáveis ​​foram coradas para SA-β-galactosidase. As setas vermelhas indicam células bi-nucleadas. Imagens representativas são mostradas em B, C, G e I.

Surpreendentemente, a expressão do ERG variantes, neste contexto, resultou numa diminuição da proliferação celular (Figura 4E). Este não foi associada com a morte celular. Pelo contrário, a expressão de ERG-1b e 1c especialmente ERG-resultou na protecção contra a morte celular após privação de soro (Figura 4F). Este comportamento pode reflectir a activação de um estado de senescência-dependente como-oncogene por ERG expressão como anteriormente descrito para outros oncogenes [30]. De facto, as células que expressam o ERG, mas não controlo, coradas positivas para biomarcador senescência (beta) -Galactosidase (Figura 4G). Intrigued por estes resultados que sobre-expressos de forma estável, subsequentemente, o ERG-1b /T1: E4 isoforma e o vector vazio correspondente na linha de células de fibroblasto humano normal IMR90, um sistema de modelo de células bem caracterizadas para a senescência celular. Tal como acontece com as células NIH-3T3, a sobre-expressão do ERG-1b /T1: E4 isoforma resultou num aumento da migração celular e invasão da célula, (Figura S2). Além disso, células IMR90 que sobre-expressam o ERG-1b /T1: E4 isoforma apresentaram fenótipos senescência semelhante, tal como uma inibição da proliferação celular (Figura 4H), acumulação de células bi-nucleadas e elevada actividade de SA-β-gal, uma clássica biomarcador da senescência (Figura 4I).

Este resultado é particularmente interessante tendo em conta o facto de que o programa de senescência está activado uma vez que uma célula tenha detectado um nível crítico de danos ou disfunção, que aponta para um papel crítico para ERG -1-B /T1: E4 superexpressão como um evento inicial que conduz a CaP. Além disso, é importante notar que a senescência celular pode ser detectado em fase inicial espécimes CaP humanos e pode ser desencadeada por perda aguda de PTEN de uma forma dependente de p53 em modelos de rato de CaP [31], o que sugere que a activação do ERG pode resultar numa fenótipo senescente inicial que requer mudanças ambientais ou genéticos subsequentes para avançar para malignidade.

ATG contexto e uORFs afetam ERG Eficiência Tradução e Funções

eficientemente traduzido mRNAs eucarióticos requer um contexto ideal em torno do codão de início, para ajudar no seu reconhecimento pelo ribossoma (a sequência de Kozak: GCCRCCATGG) [32]. No entanto, isso nem sempre é suficiente para explicar a eficiência da tradução. Por exemplo, embora ERG-1a /b e T1: E4 compartilham a mesma ATG no exão 4 (M4A) para iniciar a tradução, os seus níveis de expressão são diferentes (Figura 3B pistas 2,3 e 5), sugerindo um papel para a sua diferente 5 ‘ UTRs. De facto, a substituição dos naturais 5 ‘UTRs com um contendo uma Kozak de consenso (Figura 5A-B) levou a activação da expressão do M3 ATG na variante ERG-1b, com a síntese do péptido originalmente previsto de 55 kDa (Figura 5C, pistas 1-2). Isto confirma que os elementos dentro do 5 ‘UTR de ERG-1b inibir a sua tradução e que exclui que a partir do ERG-1b (M3) abundância é devido a uma instabilidade intrínseca do seu domínio N-terminal.

( a) o nativo 5 ‘UTR de ERG-1b, 1c e ERG-T1: E4 foram substituídos com um comum a partir do vector de expressão (cor de laranja), e uma sequência de Kozak optimizada. Os ATG substituídos são no exon 3 (M3), 1C (M1c) e (M4A) (B) contexto de múltiplas em grelha ATG utilizados como codões de iniciação em diversos ERG e TMPRSS2 4: ERG variantes. A sequência em torno do ATG está alinhado com uma sequência de consenso de Kozak, com as posições conservadas em importantes -3 (R) e 4 (G) em destaque na vermelho (contando o A como um). Contexto é avaliada como “forte” (S) se ambas as posições são conservados, e “fraco” (W) se eles não são. Uma análise ampliada do ATG na região 5’UTR do ERG e TMPRSS2: ERG é relatado na Tabela S1. (C) WB análise das variantes e mutantes representados em (A). Melhorar o quadro M3 favorece a sua utilização nas despesas do M4a ATG. (D) uORFs que podem influenciar a eficiência da tradução de ERG variantes nos 5 ‘UTRs de ERG-1b e vários TMPRSS2 comum: ERG variantes. carrapatos vermelhos indicam ATG, quadros abaixo indicam a uORF putativo gerado ea sua duração aproximada (desenho não está à escala). caixas vermelhas indicam fortes contextos ATG e fracos verdes (como definido em (B)). Mais detalhes sobre os uORFs estão listadas na Tabela S1. (E) Efeito de mutação de forma independente ATG “uORFs no ERG-1b: Mutação do primeiro ATG no exão 2 lançamentos supressão da tradução e aumenta os níveis de ERG a partir do ATG no exão 4. (F) Expressão de ERG e TMPRSS2: ERG variantes . Os ADNc de comprimento completo para as variantes, incluindo os seus inteiras UTRs 5 ‘, foram expressos e os lisados ​​de células HeLa transitoriamente transfectadas foram analisados ​​por Western blot.

Upstream Abrir quadros de leitura (uORFs) são tipicamente ORFs curtos que de início dentro da UTR 5 ‘, estão fora de enquadramento com a sequência de codificação a jusante principal e pode reduzir a sua expressão [33], [34]. Enquanto não há uORFs estão presentes no ERG-1c ou em T1: E4, existem três uORFs no 5’UTR ERG-1b (Figura 5D, parte superior), o que poderia interferir com o reconhecimento do ATG prevista do ERG-1b (Tabela S1) . Ab-rogação da uORF a partir de uM2a por mutação do ATG para GCG levou a um aumento da expressão do ERG-1b (Figura 5E, pista 2), indicando que o bloqueamento do ribossoma análise através de um primeiro ATG encontrou, para gerar um curto uM2a 29 aa peptídeo, é um fator limitante na expressão ERG-1b do ATG jusante

a presença de uORFs também poderia afetar de forma semelhante os níveis de expressão das várias TMPRSS2-driven andrógenos:. proteínas de fusão ERG, com implicação prognóstica, uma vez que a heterogeneidade da 5 ‘em fusão está associada com diferentes resultados clínicos [19], [20]. Os perfis patológicos diferentes poderia ser devido a alterações na actividade biológica, dependendo da sequência de proteína primária ou a diferenças na sua abundância,

via modulação de tradução. Tais variações podem explicar como, por exemplo, o T2: fusão E4 está associada com um fenótipo mais agressivo [19], [20]

Para investigar se a eficiência da tradução desempenha um papel na actividade das variantes de fusão.