Abstract
Fundo Visa
síntese de proteínas
Apesar do cancro hepatocelular (CHC) surgem frequentemente no cenário de fibrose e uma resposta regenerativa hepática exigindo crescimento de células novas, estratégias terapêuticas para esses cânceres não têm como alvo. Silvestrol, um rocaglate isolado do
Aglaia
foveolata
, pode inibir a síntese de proteínas através da modulação da iniciação da tradução através do fator de iniciação 4A eucariótica. Neste estudo, foi avaliada a eficácia terapêutica da silvestrol para HCC.
Métodos
A eficácia da silvestrol foi examinada utilizando células de carcinoma hepatocelular humanos
em
in vitro
utilizando um modelo de xenoenxerto de células tumorais ortotópico em um fígado fibrótico. O impacto da silvestrol sobre o fígado foi avaliada
em
vivo
em camundongos selvagens
Resultados
crescimento celular.
Silvestrol inibido com uma IC50 de 12,5-86 nM em quatro linhas celulares de carcinoma hepatocelular diferentes.
Em
vitro
, silvestrol aumento da apoptose e caspase 3/7 atividade acompanhada por perda de potencial de membrana mitocondrial e diminuição da expressão de Mcl-1 e Bcl-xL. Foi observado um efeito sinérgico quando silvestrol foi combinado com outros agentes terapêuticos, com um índice de redução da dose de 3,42-vezes com sorafenib e 1.75 vezes com rapamicina a um efeito fraccionada de 0,5.
Em
vivo
, foi observado um efeito antitumoral com 0,4 mg /kg silvestrol comparados aos controles após uma semana, e a sobrevivência de ratinhos portadores de tumor foi melhorada com um tempo médio de sobrevivência de 42 e 28 dias nos grupos de controlo e silvestrol, respectivamente. O efeito sobre a sobrevivência não foi observada em xenoenxertos ortotópicos em fígados não fibrótico. tratamento Silvestrol
em
vivo
não alterar a estrutura do fígado.
Conclusões
Estes dados identificam silvestrol como um romance, estruturalmente única droga com potente atividade antitumoral para HCC e apoiar o valor potencial de alvejar iniciação da tradução no tratamento da HCC
Citation:. Kogure T, Kinghorn AD, Yan I, Bolon B, Lucas DM, Grever MR, et al. (2013) O potencial terapêutico da tradução Inibidor Silvestrol em cancro hepatocelular. PLoS ONE 8 (9): e76136. doi: 10.1371 /journal.pone.0076136
editor: Manlio Vinciguerra, University College London, Reino Unido
Recebido: 01 de junho de 2013; Aceito: 23 de agosto de 2013; Publicação: 26 de setembro de 2013
Direitos de autor: © 2013 Kogure et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiado em parte por subvenções do National Institutes of Health, DK069370 (TP) e do Instituto Nacional do Câncer, CA125066 P01 (ADK). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
a alta incidência global e mortalidade de câncer hepatocelular (HCC) enfatiza a necessidade de terapias que são eficazes na melhoria da sobrevivência [1]. HCC é altamente refractário para abordagens terapêuticas convencionais, e existe uma necessidade de agentes terapêuticos mais eficazes para controlar estes cancros. A cura é possível apenas com a ressecção cirúrgica ou transplante, mas estes não são possíveis para a maioria dos doentes com este cancro, muitos dos quais apresentam com doença mais avançada. Estudos recentes têm implicado vários mecanismos de sinalização diversificada na patogênese molecular desse tipo de câncer [2]. Estes representam a heterogeneidade das respostas e limitar a utilidade de intervenções terapêuticas utilizando estratégias convencionais que visam modular alvos moleculares específicos [3,4]. Actualmente, apenas um agente, sorafenib, está disponível para a terapia sistémica com resultados modestos na melhoria da sobrevivência [5].
O crescimento do tumor requer a síntese de novas proteínas e, consequentemente, está associada com um aumento na tradução da proteína. Diretamente segmentação tradução poderia ser uma estratégia útil terapêutica, e garante consideração para HCC [6,7]. Diversos estudos relataram efeitos oncogénicos resultantes da expressão ectópica do fator de iniciação eucariótico eIF-4E, que é um factor limitante da velocidade para a inibição da tradução [6]. Além disso, um efeito anti-tumoral do alvo a sub-regulação de eIF-4E tem sido demonstrado em vários estudos utilizando modelos de xenoenxerto de tumor diversificada. Segmentação de outros componentes da maquinaria de tradução de proteínas também têm sido eficazes na modulação do crescimento de células tumorais. modesta eficácia antitumoral para HCC tem sido demonstrado usando inibidores de alvo da rapamicina em mamíferos (mTOR) via que estão implicados na síntese de proteínas [8-10].
O silvestrol rocaglate é uma ciclopenta [b] benzofurano flavagline do
Aglaia
gênero da família Meliacae [11-13]. Como um membro de uma nova classe de fármacos com uma estrutura única, silvestrol é um composto alvo atraente para o HCC [14]. Silvestrol tem a propriedade de modular a tradução, impedindo ribossomo do carregamento para moldes de ARNm por alvo o fator de iniciação eucariótica, eIF-4A [15,16].
In vivo
actividade anti-tumoral tem sido demonstrado para silvestrol em malignidades hematológicas, tais como leucemia linfocítica crónica, leucemia linfocítica aguda e linfoma das células do manto [16-18], provavelmente através da depleção de curto pro- meia-vida proteínas de crescimento ou pró-sobrevivência, incluindo a ciclina D e Mcl-1. Em estudos com animais, utilizando o modelo Eμ-myc, silvestrol pode aumentar a sensibilidade aos agentes convencionais, tais como doxorrubicina [15]. Assim, foram realizados estudos pré-clínicos para avaliar o papel deste composto único para o tratamento do carcinoma hepatocelular. Nossos dados mostram que silvestrol é um agente citostático e citotóxica eficaz para células de carcinoma hepatocelular tanto
in vitro Comprar e no tumor ortotópico xenoenxertos de células
in vivo
, e apoiar o desenvolvimento deste agente como um terapêutico para HCC.
Materiais e Métodos
Ética declaração
Todos os estudos com animais foram realizados de acordo com procedimentos e diretrizes Institucionais animal Care e do Comitê Use da Universidade Estadual de Ohio ao abrigo de um protocolo aprovado.
linhas celulares
linhas de células de carcinoma hepatocelular humano, PLC /PRF /5 (PLC), HepG2, Hep3B e Huh7 foram obtidos a partir da American Type Culture Collection (Manassas, VA) e foram cultivadas em mínimos meio essencial com 10% de soro fetal de bovino (FBS) e 1% antimicótica /antibiótica mistura. Luciferase-expressando PLC (PLC-luc), que foram gerados por transfecção estável com-luciferase expressando plasmídeo pHCMV contendo cDNA que codificam o fogo gene luciferase y fl, foram gentilmente cedidas pelo Dr. Ching-Shih Chen (Faculdade de Farmácia da Universidade do Estado de Ohio, Columbus, OH). autenticação de linha celular foi realizada por laboratórios de DNA Genetica (Cincinnati, OH).
Ensaio de citotoxicidade
A viabilidade celular foi avaliada utilizando o CellTiter 96 Aqueous kit de ensaio (Promega, Madison, WI). As células (5000 /poço) foram plaqueadas em placas de 96 poços (BD Biosciences, Rockville, MD) e incubou-se a 37 ° C durante a noite antes da adição de agentes experimentais. A viabilidade das células foi avaliada após 72 horas. IC
50 valores foram calculados utilizando o software XLfit (IDBS, Burlington, MA). interações medicamentosas foram avaliados utilizando uma proporção fixa de concentrações. Os resultados foram analisados utilizando a análise de efeitos médio eo índice de combinação (CI) derivado usando o programa de software CalcuSyn (Biosoft, Cambridge, Reino Unido).
apoptose Assays
As células foram cultivadas em 4 bem lâminas de câmara (5 x 10
4 células por poço) em 500 uL de meio e incubou-se a 37 ° C com 5% de CO
2. 100 nM de silvestrol foi adicionado e a extensão da apoptose das células foi avaliada após 24 horas. As células com alterações morfológicas de morte celular apoptótica foram quantificados por microscopia de fluorescência após coloração com 4 ‘, 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI). Para a caspase-3/7 ensaios, as células foram cultivadas em placas de 96 poços (5 x 10
3 células por poço) e foram de 100 nM de silvestrol por até 24 horas). a actividade da caspase-3/7 foi avaliada utilizando um ensaio luminométrico (caspase-Glo 3/7 ensaio, Promega Corp., Madison, WI).
Medição da Membrana Mitocondrial Potencial
Perturbação de mitocondrial potencial de membrana foi detectado através da utilização de JC-1 (APO LOGIX ™ JC-1, Península Laboratories Inc., San Carlos, CA). Para a microscopia de fluorescência, as células foram cultivadas em um slide câmara de 4 poços (5 x 10
4 células por poço) durante a microscopia de fluorescência, ou em placas de 96 poços (5 x 10
3 células por poço) durante fluorométrico detecção. As células foram incubadas com 100 nM de silvestrol durante 24 horas, depois com 5 mg /ml de JC-1 a 37 ° C durante 15 min. mitocôndrias intactas são detectados como agregados vermelhos com emissão a 590 nm, e despolarização da membrana mitocondrial foi detectado como fluorescência verde com emissão a 530 nm.
Western Blotting
Células cultivadas em placas de 6 poços foram lavados com solução salina tamponada com fosfato (PBS) e lisadas por incubação durante 30 minutos em 600 mL de tampão de lise celular com inibidores de protease (completo lise-M isento de EDTA, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemanha). As concentrações de proteína de lisado foram medidos utilizando um kit de ensaio de ácido bicinconínico (Kit de ensaio de proteína, Pierce Biotechnology, Rockford, IL). ~ 25 mg de proteínas foram misturadas com tampão de amostra NuPAGE LDS (Invitrogen, Carlsbad, CA) e as proteínas separadas por electroforese de sódio dodecil sulfato de gel de poliacrilamida-(SDS-PAGE) utilizando NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gels (Invitrogen). Após a electroforese, as proteínas nos geles foram transferidas para uma membrana de difluoreto de polivinilideno (PVDF) (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). As membranas foram bloqueadas com albumina de soro bovino a 5% (BSA) em soro fisiológico tamponado com Tris, e foram incubadas com anticorpos primários e anticorpos secundários e IRDye700- IRDye800-marcados (Rockland, Gilbertsville, PA) de acordo com as instruções do fabricante. A proteína de interesse foi visualizado e quantificado usando o Odyssey Infrared Imaging System LI-COR (LI-COR Bioscience, Lincoln, NE).
A indução de fibrose hepática em ratos pelados
Six-de-semana camundongos imunodeficient masculinos -Old (NCr nu) foram obtidos a partir de Taconic (Hudson, NY) e alimentos alimentados e água
ad libitum
. Os ratos foram mantidos de acordo com os procedimentos e diretrizes Animal Care Institucional e Comitê de Uso ao abrigo de um protocolo aprovado. fibrose do fígado foi induzida em ratinhos nus por injecção subcutânea de 0,4 g /kg de peso corporal tetracloreto de carbono (CCl
4) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) duas vezes por semana. CCl
4 foi diluído em azeite (CCl
4: azeite = 1: 7) e esterilizada utilizando 0,22 milímetros-filtro, antes de usar. Para os estudos de validação para verificar e quantificar a fibrose hepática, CCl
4 foi administrada a ratos pelados duas vezes por semana. Após 6, 9 ou 12 semanas, os fígados foram extraídas e fixadas com formalina para exame patológico. Após a coloração tecido hepático com Masson, pelo menos, cinco imagens microscópicas selecionados aleatoriamente de secções de tecido de cada rato foram fotografados usando software de imagem digital (NIS-Elements, NIKON, Tóquio, Japão) e a área percentual de fibrose hepática quantificados usando software NIH ImageJ (Instituto Nacional de Saúde, Bethesda, MD).
ortotópico HCC modelo de xenoenxerto de células
CCl
4 ou diluente foram administrados por via subcutânea duas vezes por semana durante 10 semanas, como acima, seguido por intra-hepática directa injecção de PLC-
Luc
células para estabelecer xenoenxertos de células de tumor em ratinhos imunodeficientes ortotópicos como se segue. Laparotomia foi realizada com anestesia isoflurano e do lóbulo esquerdo do fígado foi exposto. células PLC-luc (10
6), foram suspensos em 20 mL de meio isento de soro contendo 50% de Matrigel (BD Bioscience, San Jose, CA), e lentamente injectada no lobo esquerdo do fígado utilizando uma agulha de calibre 28 . Após a remoção da agulha, a compressão foi aplicado no local da injecção usando um cotonete de algodão para evitar o sangramento. Abdominal músculo da parede e da pele foram fechadas por sutura contínua com material de sutura absorvível. Dez dias após a injecção das células tumorais, imagem de bioluminescência utilizando o sistema de imagiologia IVIS (Xenogen Corp., Alameda, CA) foi iniciado para controlar o estabelecimento e o crescimento de tumores. Os ratinhos foram anestesiados com isoflurano e D-luciferina (Gold Biotechnology, St. Louis, MO) dissolvido em PBS foi administrada por via intraperitoneal (150 mg /kg de peso corporal do rato). Após 10 minutos, os ratos foram fotografadas com um altamente sensível, arrefecida câmara CCD numa câmara de amostra à prova de luz (IVIS200, Xenogen). Aquisição e quanti fi cação de sinais de bioluminescência foram realizadas utilizando Viver software de imagem (Xenogen). Para um estudo preliminar, cinco ratos foram sacrificados após pelo menos quatro semanas de monitoramento. imagem de bioluminescência foi correlacionada com os volumes dos tumores de fígado estimados usando medições de calibre e uma fórmula padrão: 1/6 * largura * comprimento * profundidade. Para
In vitro
imagem de bioluminescência, as células foram contadas e plaqueadas (40-10240 células) em placas de 96 poços preta. D-luciferina (150 ug /ml) foi adicionado a cada poço e de imagem foi realizado depois de 10 minutos, utilizando IVIS.
estudo de tratamento em modelo de xenoenxerto
Um estudo tratamento foi realizado em xenoenxertos em ortotópicos ratinhos nus com ou sem indução de fibrose hepática. Após o implante de células PLC-luc intra-hepática, bioluminescência foi monitorado para monitorar o desenvolvimento de tumores. Uma vez que a intensidade de bioluminescência excedeu 10 milhões de fotões /sec, ratinhos com xenoenxertos ortotópicos foram randomizados para receber silvestrol (0,4 ou 1 mg /kg de IP de peso corporal) ou controlo (0,5 ml /kg de peso corporal de 0,1% de DMSO em soro fisiológico) durante 5 dias consecutivos por semana, durante quatro semanas. Uma resposta terapêutica foi definida como redução de 30% na intensidade de bioluminescência da linha de base. Os ratinhos foram fotografadas por semana durante 10 semanas a partir do início do tratamento.
investigação hepatotoxicidade em murganhos de tipo natural
de seis semanas de idade, fêmea, ratinhos C57BL /6 foram tratados com 0 (veículo controlo) ou 1,5 mg /kg de silvestrol (n = 7 por grupo) a cada 48 horas durante 28 dias por via intraperitoneal. Na autópsia, o sangue foi recolhido para medir níveis séricos de alanina (ALT) e aspartato aminotransferase (AST), enquanto o fígado foi fixada por imersão em neutro tamponado a 10% de formalina. lesões histopatológicas em fixo, embebido em parafina, hematoxilina e eosina (H E) secções de tecido -stained foram classificados por um patologista veterinário credenciado usando uma escala de 5 níveis, semi-quantitativa: dentro dos limites normais, ou mínima, leve, moderada, ou alterações marcadas.
produtos químicos e reagentes
Silvestrol, {6-O-desmetil-6- [6- (1,2-di-hidroxietil) -3-metoxi-1,4 dioxan-2-il] -aglafolin}, foi isolado a partir da casca e ramos de Aglaia foveolata Pannell (Meliaceae), tal como descrito anteriormente por AD Kinghorn. Silvestrol foi ressuspenso em dimetilsulfóxido (DMSO) e armazenada a -80 ° C. Sorafenib foi obtido a partir de LC Laboratories (Woburn, MA) e diluídos em DMSO. A rapamicina foi obtida de Calbiochem (San Diego, CA) e diluídos em DMSO. A concentração de DMSO eram 0,1% para todos os estudos. Z-VAD-FMK foi obtido a partir de Promega (Madison, WI):
A análise estatística
Os dados foram analisados por análise unidireccional de variância (ANOVA) seguida de um procedimento post-hoc. Para a análise de sobrevivência, as curvas de sobrevida foram criadas pelo método de Kaplan-Meier e comparadas pelo teste log-lisos. A análise multivariada foi realizada com Cox riscos proporcionais regressão. A significância estatística foi aceita em um valor de
p Art 0,05.
Ética declaração
Todos os estudos com animais foram realizados de acordo com procedimentos e diretrizes Institucionais Animal Care e do Comitê Use da Universidade Estadual de Ohio ao abrigo de um protocolo aprovado.
Resultados
silvestrol inibe o crescimento celular HCC humana
in vitro
Para examinar o potencial efeito anti-tumoral de silvestrol, começamos por examinar o efeito de silvestrol no crescimento celular
in vitro
utilizando um painel de diferentes linhas de células de hepatócitos humanos malignos. A incubação com silvestrol resultou num efeito dependente da concentração na inibição do crescimento de células em todas as linhas celulares de tumores examinadas, com uma IC50 de 23,9 nM em PLC /PRF /5, 12,5 nM em Hep3B, 14,6 nM em Huh 7 e 86 nM em células HepG2 (Figura 1). Estes dados indicaram que silvestrol teve um efeito anti-cancro altamente potente em células de carcinoma hepatocelular humano.
células de carcinoma hepatocelular humano foram semeadas em placas de 96 poços (5.000 células /poço) e incubadas com várias concentrações de silvestrol ou controlo ( diluente). A viabilidade das células foi avaliada após 72 horas, utilizando um ensaio de células vivas metabólica (CellTiter 96 AQ, Promega Corp., Madison, WI). Os dados representam a média e o desvio padrão de cinco determinações separadas.
A indução da morte celular por apoptose em células de carcinoma hepatocelular por silvestrol
a hipótese de que a citotoxicidade de silvestrol ocorrido como resultado de indução de apoptose mediada pela síntese diminuída de moléculas reguladoras da apoptose de vida curta, tais como Mcl-1 [16,17]. Assim, analisámos a indução da apoptose em células de carcinoma hepatocelular PLC /PRF /5 humanos após a incubação com 100 nM silvestrol. Caspase 3/7 activação foi detectada por ensaio luminométrico, com um aumento de actividade observado dentro de 30 minutos e com duração de até 6 horas (Figura 2A). Do mesmo modo, um aumento da clivagem de polimerase polyADP-ribose (PARP), um substrato para a actividade da caspase, também foi observada, juntamente com a clivagem de outras caspases, tais como caspase 8 e 9 (Figura 2B). A pré-incubação de células durante 30 minutos com o inibidor de caspase zVAD-50 uM FMK reduzida citotoxicidade de incubação subsequente com silvestrol 50 nM de 36,4 ± 3,5% para 17,6 ± 2,9% após 24 horas. Consistente com estas alterações, 19,3% de células PLC /PRF /5 apresentaram características morfológicas das células em apoptose após 24 horas (Figura 2C). Estes estudos indicam que as características morfológicas e bioquímicas da apoptose ocorrer precocemente durante a incubação de células de carcinoma hepatocelular com silvetrol.
PLC /PRF /5 células de carcinoma hepatocelular foram semeadas em 4 poços corrediça câmara (25000 células /poço) e foram incubadas com 100 nM silvestrol durante 24 horas. As células apoptóticas foram detectadas por microscopia de fluorescência após coloração com DAPI. A proporção de células que apresentam características morfológicas de apoptose foram contadas. *,
p Art 0,05, teste-t.
Silvestrol altera a expressão de Mcl-1