Abstract

O gene variante plasmocitoma translocação 1 (

PVT1

) é um lncRNA que tenha sido designada como um oncogene devido à sua contribuição para o fenótipo de vários cancros. Embora o mecanismo pelo qual

PVT1

influencia processos de doença tem sido estudada em vários tipos de cancro, o seu papel na tumorigénese do colo do útero permanece desconhecida. Assim, o presente estudo foi desenhado para investigar o papel da

PVT1

no cancro do colo do útero

in vitro

e

in vivo

.

PVT1

expressão foi medida por PCR quantitativa (qPCR) em 121 amostras de carcinoma cervical invasivo (ICC), 30 amostras de cérvix normal, e linhas de células cervicais. Os ensaios funcionais foram realizados utilizando tanto siRNA e knockdown mediado-LNA para examinar os efeitos

‘

s PVT1 sobre a proliferação de células de cancro do colo do útero, migração e invasão, apoptose, e resistência à cisplatina. Nossos resultados demonstram que

PVT1

expressão é significativamente aumentada no tecido ICC contra o colo do útero normal e que a maior expressão de

PVT1

se correlaciona com a sobrevida global mais pobres. Em linhas celulares de cancro do colo do útero,

PVT1

knockdown resultou numa diminuição significativa a proliferação celular, migração e invasão, enquanto que a apoptose e citotoxicidade cisplatina foram significativamente aumentados nessas células. Finalmente, mostramos que

PVT1

expressão é aumentada em resposta à hipoxia e estimulação da resposta imune e que este lncRNA associa com a proteína multifuncional e stress-responsivo, nucleolin. Coletivamente, nossos resultados fornecem fortes evidências para um papel oncogênico dos

PVT1

no cancro do colo do útero e dar uma idéia das possíveis mecanismos pelos quais

PVT1

superexpressão ajuda a impulsionar carcinogênese cervical.

Citation : Iden M, Fye S, Li K, Chowdhury T, Ramchandran R, Rader JS (2016) o lncRNA

PVT1

Contribui para o cancro do colo do útero Fenótipo and Associates com o prognóstico do paciente pobre. PLoS ONE 11 (5): e0156274. doi: 10.1371 /journal.pone.0156274

editor: Bibekanand Mallick, Instituto Nacional de Tecnologia, Rourkela, Índia |

Recebido: 15 Agosto, 2015; Aceito: 11 de maio de 2016; Publicado em: 27 de maio de 2016

Direitos de autor: © 2016 Iden et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. Todos relevante os dados estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Programa de Pesquisa em Saúde da Mulher no Medical College of Wisconsin (https://obgyn.mcw.edu/research/whrp/). Os financiadores não tiveram nenhum papel em qualquer parte da preparação deste manuscrito

Conflito de interesses:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

RNAs não codificadores Longo ( lncRNAs) fornecer alvos importantes para o diagnóstico e terapêutica do cancro, devido ao seu papel crítico em numerosos processos celulares, tais como alterações epigenético estimulador do gene e da actividade supressora de tumores, e miARN sequestrante. LncRNAs estão presentes no genoma, muitas vezes mostram-tipo de células e regulação específica temporal da expressão do gene, e pode influenciar muitos processos celulares através de vários mecanismos diferentes [1]. Plasmocitoma variante translocação 1 (

PVT1

) é um lncRNA ~ altamente conservada 50kb jusante da

MYC

que tem atraído muita atenção por parte do campo de câncer devido à sua co-amplificação frequente com

MYC

em vários tumores sólidos [2]. Os primeiros estudos fornecem evidências de que

PVT1

pode contribuir para a carcinogênese demonstrado translocações frequentes na plasmocitomas rato [3,4] e linfomas humanos de Burkitt [5-7]. Os efeitos oncogénicos da

PVT1

foram ainda mais realçada por estudos mais recentes demonstram a sua superexpressão e amplificação em vários tipos de câncer [8-17]. Mais importante,

PVT1

expressão foi significativamente correlacionada com características clínicas, tais como risco, recorrência e sobrevida em vários tipos de câncer [8,11-13,18].

Apesar da riqueza de conhecimentos sobre as propriedades oncogênicas do

PVT1

em vários tipos de câncer, muito pouco se sabe sobre sua função biológica precisa. Na verdade, o punhado de estudos fornecer

PVT1

dados mecanicistas sugerem extremamente que ele exerce seus efeitos em um tipo de célula e /ou forma específica da doença. Por exemplo,

PVT1

função tem sido atribuído à sua ligação e estabilização da Myc [19] e Nop2 [17] em proteínas da mama e carcinoma hepatocelular, respectivamente. Em células cancerosas gástricas,

PVT1

age para reprimir a expressão da p15 e p16 através da sua interação física com a proteína grupo Polycomb, EZH2 [20]. Também através de recrutamento e regulação do receptor de hormônio estimulante da tireóide EZH2,

PVT1

induz a proliferação de células de câncer da tireóide [21]. Finalmente, a análise computacional de

PVT1

sugere que pode actuar através de ligação e fixação do mir-200 membros da família no tecido do cancro da mama [14]. Devido à sua complexidade e amplitude dos resultados, esses estudos enfatizam a importância de uma investigação específica para a doença de

mecanismos PVT1

.

O nosso interesse no

PVT1

originado do nosso trabalho e demonstrando dos outros que é um local frequente de integração do HPV no câncer cervical, sugerindo ainda uma função biológica importante [22-24]. Assim, buscou-se definir melhor o papel da

PVT1

na carcinogênese cervical examinando

PVT1

padrões de expressão em tumores de câncer do colo do útero e linhas celulares e os efeitos funcionais deste lncRNA sobre os processos relacionados com o cancro tais como a proliferação, a motilidade celular, apoptose, e quimioresistência. Finalmente, porque muitas lncRNAs contar com parceiros de proteína para levar a cabo os seus efeitos, utilizou cromatografia de afinidade RNA e sequenciamento de espectrometria de massa para elucidar específica de células-cervical cancer

PVT1

parceiros de ligação.

Métodos

o protocolo do estudo foi aprovado pelo conselho de revisão institucional do Medical College of Wisconsin IRB (PRO00011466; Caracterização Molecular do Câncer do colo do útero).

cultura celular

SiHa (ATCC® HTB35 ™), HeLa (linhas celulares de cancro ATCC® CCL2 ™) e DoTc2 4510 (ATCC CRL-7920 ™) humanos do colo do útero e HPV 16 E6 /E7-transformado, células ectocervicais normais (Ect1 /E6E7; ATCC® CRL-2614 ™ ) foram obtidas a partir da American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). células de cancro cervical foram mantidas em qualquer Mínimo Essencial Meio de Eagle (EMEM; SiHa e HeLa) ou Meio de Eagle Modificado por Dulbecco (MEM; DoTc2) suplementado com 10% de Soro Fetal Bovino (FBS; ATCC). Ect1 /E6E7 células foram mantidas em meio isento de queratinócitos de soro (GIBCO) com 0,1 ng de EGF /ml recombinante humano, 0,05 mg /ml de extracto de pituitária bovina, e adicional de cloreto de cálcio 44,1 mg /L. A ATCC autentica todas as linhas de células, examinando seus perfis de ADN curta em tandem repeat (STR). As células foram mantidas a 37 ° C em elevada humidade com uma atmosfera de 95% de ar e 5% de CO

2. As células foram recolhidas utilizando tripsina-EDTA (tripsina a 0,25%, EDTA a 0,53 mM; ATCC) e contadas utilizando Azul de Tripano a 0,4% Solução (Amresco, Solon, OH) e a câmara de contagem hemacitómetro. Para algumas experiências, cisplatina (1 mM, Sigma, St. Louis, MO) foi reconstituída em água destilada e armazenado a -20 ° C até à sua utilização. As células foram expostas a cisplatina numa concentração de 10 uM, 50 uM e 100 uM em meio de crescimento durante 4 h em meio de cultura. meios de cultura contendo cisplatina foi removido e substituído com meio de crescimento fresco 4 horas mais tarde e as células incubadas a 37 ° C durante a noite. Para experiências de investigação

expressão PVT1

após a hipóxia e estimulação resposta imune, as células SiHa foram, respectivamente, tratados com cloreto de cobalto (150 uM; Sigma) ou interferão alfa (IFN-α; 10 uM; Sigma) durante 48 h antes de extracção de ARN (métodos abaixo). Finalmente, outras células SiHa foram tratadas com ciclo-hexamida (10 uM; Sigma). Para diferentes pontos de tempo antes de serem submetidos a lise por blotting Myc Ocidental

transfecções

As células (2,0 x 10

5) as células foram plaqueadas numa placa de 6 poços e deixou-se aderir durante a noite. As células foram então transfectadas com 2 pequeno ARN interferente (siRNA) concebidas contra

PVT1

combinados numa proporção equimolar (20 ou 40 nM; FlexiTube Hs_PVT1_5 e Hs_PVT1_6; Qiagen, Valência, CA) ou um ARNsi de controlo negativo (AllStar Controlo negativo; Qiagen) conjugado com Alexa Fluor 488. as transfecções foram realizadas utilizando DharmaFECT1 (GE Dharmacon, Lafayette, CO) segundo as instruções do fabricante. A eficiência de transfecção foi monitorizada por microscopia de fluorescência e confirmada através de PCR quantitativa (qPCR) 48 h após a transfecção. transfecções siRNA foram realizadas em ambas as linhas celulares HeLa e SiHa cervical e utilizados na proliferação, apoptose e morte celular e ensaios de migração e invasão.

Para o ácido nucleico bloqueado (LNA) transfecções de oligonucleótidos, células (2,0 x 10

5) foram plaqueadas numa placa de 6 poços e no dia seguinte transfectadas com 10 nM PVT1_10 ou PVT1_15 LNA (Exiqon, Woburn, MA) ou um LNA controlo scrambled (controlo negativo a, Exiqon) usando DharmaFECT 1 (GE Dharmacon) a uma concentração de 0,2 ul por 100 ul de meio de crescimento. As sequências de PVT1_10 LNA, PVT1_15 LNA e o Controlo Negativo A são 5′-AACACGTCTATACGC-3 ‘, 5′-AGATCACTGTAAATCC-3′ e 5’-GGCAGGATCTATGGCA-3 ‘, respectivamente. meio de transfecção foi substituído por meio de crescimento fresco 24 h após a transfecção e a jusante ensaios realizados 48 horas mais tarde. células SiHa-LNA transfectadas foram utilizados para confirmar os efeitos do siARN transfecção na proliferação das células, para determinar os efeitos de

PVT1

knockdown em resposta cisplatina, as experiências de degradação de Myc, e os efeitos sobre a expressão do mRNA dependente da nucleolina.

isolamento de ARN, a síntese de ADNc, e PCR quantitativa (qPCR)

O ARN foi isolado utilizando um estojo de isolamento miRvana miARN (Ambion, Austin, TX) e o ADNc sintetizada utilizando-alta Capacidade para ARN-ADNc-Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA). Para algumas experiências, células vivas em cultura foram lavadas com PBS 1x e separadas em porções de ARN nucleares e citoplasmáticos através da utilização de detergentes não iónicos seguintes as instruções do kit de Paris (Life Technologies). O ARN foi isolado a partir de cada porção e tratado com DNase usando o kit de ADN-livre (Life Technologies). Expressão de

PVT1

,

MYC

e controle

RPS18

foi avaliada usando EvaGreen qPCR Mastermix (MidSci, St. Louis, MO) em um Real-Time PCR System StepOnePlus ( life Technologies). O programa de ciclo térmico incluído um passo inicial de activação de enzimas, a 95 ° C durante 10 min, seguido de 40 ciclos constituídos por um passo de desnaturação 10 seg a 95 ° C, e uma etapa de hibridação /extensão de 1 min a 60 ° C durante todos os iniciadores. A intensidade de fluorescência foi medida a 62 ° C no final de cada ciclo. Adiante e iniciadores para

PVT1

foram 5′-CCGACTCTTCCTGGTGAAGC-3 ‘e 5′-GTATGGTCAGCTCAAGCCCA-3′, 5’-TACCCTCTCAACGACAGAG-3 ‘e 5′-TCTTGACATTCTCCTCGGTG-3’ para

MYC

, e 5′-CTTCAGTCGCTCCAGGTCTT-3 ‘para

RPS18

(para a normalização de dados) .s para

PVT1

foram 5′-CCGACTCTTCCTGGTGAAGC-3′ e 5′-GTATGGTCAGCTCAAGCCCA-3 ‘ , 5’-TACCCTCTCAACGACAGAG-3 ‘e 5’TCTTGACATTCTCCTCGGTG-3’ para

MYC

, e 5′-CTTCAGTCGCTCCAGGTCTT-3 ‘para

RPS18

(para a normalização de dados).

Expressão de miARNs foi realizado utilizando ensaios TaqMan® microRNA (Life Technologies) para HSA-miR-1204 (002872), HSA-miR-1205 (002778), HSA-miR-1206 (002878), HSA-miR-1207 -3P (002.826), HSA-miR-1207-5P (241060_mat), HSA-miR-1208 (002.880) e RNU48 (001.006; para a normalização de dados) de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, o ARN foi isolado utilizando um estojo de isolamento miRvana miARN e ADNc sintetizado utilizando o TaqMan MicroRNA Transcrição Reversa Kit (Life Technologies) com os primers fornecidos para cada miARN. amplificação qPCR foi, em seguida, realizada num Sistema de PCR em Tempo Real StepOnePlus usando parâmetros do fabricante. Todas as amostras foram analisadas em triplicado usando o método 2- ΔΔCt de expressão gênica relativa, expresso em 2-ΔΔCt.

fluorescentes RNA hibridização in situ (FISH) e imunocitoquímica

ViewRNA TIPO 6 conjuntos de sonda ( Affymetrix, Santa Clara, CA) projetado contra o

PVT1

(NR_003367.2) foram usados ​​para visualizar

expressão PVT1

in vitro

. As experiências foram realizadas de acordo com o protocolo do fabricante utilizando reagentes fornecidos no kit de Ensaio celular QuantiGene ViewRNA ISH (Affymetrix). Resumidamente, as células SiHa foram semeadas em lamelas circulares de 12 mm e cultivadas a 70-90% de confluência, antes de serem fixadas com 4% de formaldeído. As células foram então lavadas com PBS 1X e incubadas durante 5 min em Solução Detergente para a permeabilização. As células foram lavadas mais uma vez e incubadas com solução de trabalho de protease, durante 25 min. As sondas foram diluídas (1: 100) no pré-aquecido Sonda diluente e incubadas com as células durante 3 h a 40 ° C. As células foram lavadas, hibridado com o trabalho pré-amplificador de misturar a solução durante 30 min a 40 ° C, lavou-se novamente, e hibridou-se com o trabalho Amplificador misturar a solução durante 30 min a 40 ° C. Depois de mais de lavagem, as células foram hibridadas com as sondas marcadas durante 30 min a 40 ° C. Após esta incubação, lamelas foram lavadas, coradas com DAPI, e montada em lâminas de vidro. As células foram fotografadas com um microscópio confocal Zeiss LSM510 localizado nas Infantil Instituto de Pesquisa de Imagem Núcleo no Medical College of Wisconsin. As imagens foram processadas no Adobe Photoshop CS5.1.

Para co-coloração de nucleolin com

PVT1

RNA FISH, imunocitoquímica foi realizada antes da coloração com o passo DAPI acima. As células foram lavadas 3 vezes com PBS + 1% de BSA e 0,1% de Tween-20 e depois bloqueados à temperatura ambiente durante 2 h em tampão de bloqueio (PBS + BSA a 10%, 0% de soro de burro normal e 0,1% de Tween-20). As lamelas foram então incubadas a 4 ° C durante a noite em tampão contendo um anticorpo policlonal dirigido contra a nucleolina de bloqueio (1: 1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA). As células foram de novo lavadas 3 vezes e incubadas durante 1 h à temperatura ambiente em solução de bloqueio contendo um anticorpo secundário conjugado com FITC para a visualização de nucleolina. Após uma lavagem final, lamelas foram montadas utilizando meio de montagem Vectashield Antifade com DAPI (Vector Laboratories, Burlingame, CA) e visualizada como se descreveu acima.

proliferação celular ensaio

A proliferação celular foi medida utilizando o Proliferação celular ELISA BrdU (colorimétrico) kit (Hoffmann-La Roche, Nutley, NJ) de acordo com o protocolo do fabricante. Resumidamente, 48 h após a transfecção, 1,0 x 10

4 células foram plaqueadas numa placa de 96 poços e deixou-se aderir durante a noite. As células foram então marcadas com BrdU durante 2 h, fixadas e incubadas com anti-BrdU-POD. conjugados de peroxidase não ligados foram removidos por lavagem. Substrato foi então adicionada e os valores de absorvância (370 nm-492 nm) foram medidos 15 min mais tarde.

O ensaio de viabilidade celular PrestoBlue® também foi utilizado de acordo com as instruções do fabricante. células SiHa foram transfectadas com LNA, tal como descrito acima. Quarenta e oito horas mais tarde, as células foram plaqueadas numa placa de 96 poços (1,0 x 10

4 células /cavidade) e expostas à cisplatina (Sigma) a uma gama de concentrações entre 10-200 uM, durante 4 h. meios de cultura de cisplatina foi removido e substituído com meio de crescimento após a exposição 4 h e em seguida incubadas a 37 ° C durante a noite. No dia seguinte, os valores da fluorescência foram medidos após incubação das células com o reagente PrestoBlue® durante 1 h a 37 ° C. Os ensaios de

A morte celular e apoptose

A morte celular foi ensaiada utilizando a morte celular Detecção de ELISA Kit (Hoffmann-La Roche) de acordo com instruções de fabricação. Resumidamente, 48 h após a transfecção, 0,5 x 10

5 as células foram colhidas e lisadas. nucleossomos celulares foram ligado à placa ELISA preparado através de componentes de histonas. Anti-ADN-peroxidase foi adicionado, e conjugados de peroxidase não ligados foram removidos por lavagem. Substrato foi então adicionada e os valores de absorção foram medidos 15 minutos mais tarde (405 nm-490 nm). A apoptose foi caracterizada medindo a caspase-3 activa (ng /mg de lisado celular total) usando o humano Caspase-3 (Activo) ELISA Kit (Life Technologies, Grand Island, NY). Setenta e duas horas após a transfecção, as células (1,0 x 10

6) foram lisadas em tampão de Extracção celular (Life Technologies) suplementado com Cocktail de Inibidor de Protease (Sigma) e fluoreto de fenilmetanossulfonilo (Sigma).

A migração celular e ensaios de invasão

Quarenta e oito horas após a transfecção, o meio contendo soro foi removido e as células foram lavadas com PBS 1x então cultivadas durante 24 horas em EMEM livre de soro. Após o período de jejum, as células foram colhidas utilizando HyQTase e plaqueadas (1 x 10

5 células) e para Corning Transwell Suportes permeáveis ​​(Corning, Tewksbury, MA). Para os ensaios de migração, membranas Transwell foram equalizados em meios de crescimento de 24 h antes da semeadura de células. Para os ensaios de invasão, membranas Transwell foram revestidas com Matrigel Matrix (Corning; 1: 6 em EMEM) e secou-se durante 6 h a 37 ° C. As células foram cultivadas na presença e na ausência de quimioatraente (EMEM + 20% de FBS) e colhidas 6 h ou 48 h mais tarde para análise de migração e invasão, respectivamente. As células não migrantes foram removidos a partir da face superior da membrana Transwell com um cotonete de algodão, enquanto que as células migrantes foram fixadas e coradas com violeta de cristal (Merck Millipore, Billerica, MA) e visualizados /contados utilizando microscopia de luz.

Western blotting

tecido cervical fresco congelado ou 3,6 x 10

6 as células foram lavadas com 1x PBS e lisadas durante 10 min em gelo usando celular Tampão de Extracção (Life Technologies) suplementado com PMSF 1 mM (Sigma) e um cocktail inibidor de protease (Sigma). detritos celulares não digerido foi sedimentado por centrifugação a 10.000 rpm e o lisado remanescente foi quantificada utilizando o ensaio de Bradford (Sigma). O lisado (20 ug) foi executado em uma Critério de gel de poliacrilamida Tris-HCl (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA), transferidos para membranas de PVDF, bloquearam-se com 1X TBS + leite em pó magro a 10% à temperatura ambiente durante 1 h, e incubadas com anticorpo primário (Myc ou nucleolina, 1: 1000; Cell Signaling Technology) durante a noite a 4 ° C. No dia seguinte, as membranas foram lavadas, incubadas durante 1 h à temperatura ambiente com IgG anti-coelho de cabra conjugado com HRP (1: 5000; Cell Signaling Technology), e desenvolvidos utilizando ECL (Life Technologies). Quimiluminescência foi medido utilizando Molecular Imager XRS ChemiDoc + (Bio-Rad Laboratories) e visualizadas bandas de proteínas foram quantificadas utilizando Software Lab Imagem (Bio-Rad Laboratories).

cromatografia de afinidade RNA e espectrometria de massa sequenciamento

vários sentido sobreposição e oligonucleótidos anti-sentido de ADN de cadeia simples (ssDNA oligos; 100 nt de comprimento) foram gerados contra as sequências completas dos exons 2 e 9 do

PVT1

(NR_003367.3; Eurofins MWG Operon, Huntsville, AL) . Exons 2 e 9 foram escolhidos com base em sua maior propensão para a ligação como determinado

in silico

proteína. ADNcs foram hibridados para se obter ADN de cadeia dupla (dsDNA), todos dos quais tinha uma sequência de promotor de T7 na extremidade 5 ‘. O promotor contendo T7 dsDNA foi

in vitro

-transcribed usando o kit MaxiScript T7 (Ambion) e RNA resultante foi, em seguida, 3′-biotinilado com o kit de Pierce Desthiobiotinylation (ThermoScientific). RNAs Desthiobiotinylated foram incubados com contas magnéticas ligadas a estreptavidina, a partir de Pierce Magnética ARN-proteína Kit Pull-Down (Thermo Scientific), conforme o protocolo do fabricante. Após a lavagem, 200 ^ g de lisado de células SiHa todo foi adicionado às esferas magnéticas com estreptavidina ligada a ARN e incubadas a 4 ° C com agitação suave durante 90 min. Após 3 lavagens com tampão de lavagem (Thermo Scientific 20164), as proteínas ligadas foram eluídas de ARN em tampão de amostra SDS e resolvidas por SDS-PAGE num gel de acrilamida a 12%. Após coloração com prata, bandas de proteínas de interesse foram Espectrometria de Massa sequenciado em Taplin Espectrometria de Massa Facility (Harvard Medical School, Boston, MA). espectrometria de massa “hits” foram analisadas quanto ao número de péptidos únicos e totais obtidos e a área sob a curva. Cada resultado era

in silico

digerido tripsina e o número de péptidos obtidos com

in silico

digestão foi comparado com o número de péptidos obtidos nos resultados de espectrometria de massa. Apenas as proteínas que tinham 20% ou mais dos fragmentos de tripsina-digerível presentes foram consideradas verdadeiras visitas. Transferência de Western (conforme descrito acima) no seguimento da cromatografia de afinidade de RNA foi ainda utilizado para validar os verdadeiros sucessos.

ARN imunoprecipitação

imunoprecipitação ARN (RIP) os ensaios foram realizados utilizando a proteína A imunoprecipitação Magna PIR ARN-Binding kit (Merck) seguindo as instruções do fabricante. lisado celular total a partir de 1,7 x 10

7 células SiHa foi utilizado para imunoprecipitação com anticorpos Myc e nucleolina (o mesmo que para Western blotting). Como um controlo IgG inespecífica, IgG de coelho purificada foi executado em paralelo. Após digestão da proteína, o ARN foi extraído e tratado com DNase usando o kit de ADN-livre (Life Technologies). Níveis de

PVT1

foram quantificados em entrada e RNA imunoprecipitado.

Análise de Dados e Estatística

As experiências foram realizadas em triplicata e as diferenças entre os dados médios foram analisados ​​utilizando Estudante de

testes

t (de duas caudas). Os resultados foram representados graficamente como a média ± erro padrão da média. curvas de dose-resposta cisplatina foram gerados utilizando um modelo de inclinação variável. Todas as análises estatísticas e de gráficos de dados foram realizadas utilizando o GraphPad Prism 6.0 (La Jolla, CA), excepto para a análise de sobrevivência que foi realizada usando software de SPSS11.0 (Chicago, IL). curvas de sobrevida de Kaplan-Meier foram plotados e comparados usando o log-rank (Mantel-Cox) testes. Os valores de P inferiores a 0,05 foram considerados significativos.

Resultados

PVT1

expressão é regulada positivamente em tumores de pacientes com câncer cervical e correlacionados com pior sobrevida

PVT1

é um gene multi-exão com a sua região genómica contígua contendo um conjunto de 6 microRNAs (miRNAs) anotados.

PVT1 Comprar e níveis de expressão de miRNA locais foram determinados por qPCR para tecidos cancerosos e adjacentes normais de pacientes com câncer cervical.

PVT1

expressão foi significativamente mais elevada em tumores de doentes com cancro do colo do útero em relação ao tecido normal adjacente (n = 127 tumor; n = 30 adjacente normal; p 0,001; Figura 1A). Expressão de miARNs 1204 e 1206 (mas não de 1205, 1207-3p, 1207-5p, ou 1208; S1A-S1D fig) foi significativamente mais elevada no tumor contra tecido cervical normal adjacente (Figura 1B e 1C). É de notar, porque

PVT1

e

MYC

são frequentemente co-amplificado em câncer, que, adicionalmente, analisou a expressão de

MYC

no cancro do colo do útero e tecidos normais adjacentes. Embora tenhamos observado uma tendência de aumento da

MYC

em câncer em comparação com adjacente normal, a diferença na expressão média de

MYC

não foi estatisticamente significativa entre os dois grupos (S1E FIG).

(a)

PVT1

expressão foi significativamente mais elevada em tumores primários do colo do útero (n = 127) em relação ao tecido cervical normal adjacente (n = 30; p 0,001). Expressão de miARN 1204 (B; p 0,05) e 1206 (C; p 0,001), mas não outros miARNs locais, também foi significativamente mais elevada no tecido de tumor do colo do útero (n = 38) em comparação com o tecido normal adjacente (n = 18) . (D) Gráficos de Kaplan-Meier revelou uma associação de tumor mais elevada

PVT1

níveis, com o tempo de sobrevivência significativamente mais pobres em comparação com

PVT1

níveis mais baixos (p = 0,03).

os 127 pacientes com câncer cervical foram divididos em grupos de alta e baixa

PVT1

-expressing, utilizando a mediana

PVT1

nível de expressão, para investigar a sua correlação com o prognóstico. Usando análise de sobrevivência de Kaplan-Meier e testes-log rank, descobrimos que alta

PVT1

expressão foi significativamente correlacionada com menor tempo de sobrevivência cumulativa para pacientes com câncer cervical (p = 0,03; Fig 1D). Juntos, estes dados sugerem que, em geral,

PVT1

expressão é elevada em tumores de câncer cervical e que, quanto maior a expressão de

PVT1

, pior o prognóstico.

expressão PVT1

em linhas celulares de cancro do colo do útero

Para começar nosso

in vitro

exame no papel de

PVT1

em células de cancro do colo do útero, determinamos

PVT1

níveis de expressão em várias linhas celulares derivadas do colo do útero, disponíveis comercialmente através de qPCR (figura 2A). De 4 linhas do colo do útero, as células SiHa HPV 16 positivos exibiram a expressão

PVT1

mais alto, enquanto a mais baixa

PVT1

expressão foi observada em HPV 16 E6 células /E7-transformados derivados de ectocérvice normais (Ect1 /E6E7). Em seguida, buscou-se identificar estressores oncogênicos específicos que podem conduzir aprimorados

expressão PVT1

em câncer cervical. Para este fim, expuseram células SiHa (usado para o restante de nossos estudos) para vários estímulos transformadoras antes de medir os efeitos sobre

expressão PVT1

via qPCR. Curiosamente, verificou-se que

expressão PVT1

em células SiHa foi significativamente aumentada em resposta à incubação de 48 h com INF-α ou do mimético hipoxia, cloreto de cobalto (CoCl

2; Figura 2B). Outros estímulos, tais como o factor de crescimento epidérmico (EGF), factor de crescimento semelhante a insulina (IGF), forbol 12-miristato 13-acetato (quinase C activador de proteína), e a radiação gama não afectou significativamente

PVT1

expressão (dados não mostrados). Finalmente, nós investigamos localização subcelular de

PVT1

usando RNA FISH e encontrou expressão de

PVT1

tanto no citoplasma e núcleo das células SiHa. Além disso, o controle antisense-transf SiHa (Fig 2C) apresentaram semelhante nuclear e citoplasmática

PVT1

coloração, da qual estava ausente no

PVT1

células knockdown (Fig 2D). Em resumo,

PVT1

é expresso em várias linhas celulares derivadas do colo do útero humano, pode ser aumentada por estímulos imunitários e hipóxicas, e está localizada ao longo do núcleo e no citoplasma, sugerindo que este lncRNA pode participar em diversos processos celulares de cancro do colo do útero , possivelmente através de mais de um mecanismo único.

(a)

expressão PVT1

em linhas de células cervicais disponíveis comercialmente. Menor

PVT1

expressão foi observada em HPV 16 E6 células /E7-transformados derivados de ectocérvice normal (E6 /E7-Ecto), enquanto SiHa células cancerosas do colo do útero exibida a expressão

PVT1

mais alto em comparação com 2 outras linhas derivadas de câncer cervical (HeLa e DoTc2). (B) Expressão de

PVT1

em células SiHa foi ainda aumentada mediante tratamento de 48 h com INF-α (10 uM) ou o cloreto de cobalto mimético hipoxia (CoCl

2; 150? M). Imagens representativas de experimentos FISH de RNA em células SiHa transfectadas com LNAs

PVT1

(D), quer de controlo (C) ou. células exibiram sinais puntiformes para

PVT1

(vermelho), tanto no núcleo (corado com DAPI em azul) e do citoplasma de controle LNA-transf. Ambos nuclear e citoplasmática

PVT1

coloração estava ausente no

PVT1

células transfectadas-LNA. imagem de fase (painel inferior esquerdo) descreve a morfologia das células. Escala da barra (branca) = 10 uM. * P 0,05, ** p 0,01

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silenciamento diminui a proliferação de células de câncer cervical, migração e invasão

Em seguida, as células SiHa transfectadas com

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-targeted siRNA (siPVT1) foram utilizados para examinar os efeitos desta lncRNA sobre a proliferação de células de câncer cervical e motilidade. A transfecção com

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-targeting siRNAs resultou, em média, 70% knockdown de

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comparados células para controlar-transfectadas (Figura 3A). Além disso, não houve diferença significativa nos locais de miARN (1204-1208) ou

MYC

expressão de ARNm em células transfectadas siPVT1 contra-controlo scrambled (siCONT; S2 figura). células SiHa siPVT1-transfectadas exibiram uma diminuição significativa na incorporação de BrdU, uma medida de células em replicação, às 72 horas pós-transfecção comparado com siCONT, sugerindo que

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desempenha um papel na condução a proliferação celular (Fig 3B). Estes efeitos do

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knockdown na proliferação SiHa também foram confirmados por transfecção com

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-targeted LNA. Finalmente, em comparação com células siCONT, células siPVT1 apresentado uma diminuição significativa na migração (Figura 3C) e capacidade de invasão (Figura 3D). Vale ressaltar que estes efeitos de

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knockdown são imitados em outra linha de células de câncer cervical, HeLa (S3 Fig), proporcionando mais apoio para um papel deste lncRNA na carcinogênese cervical.

(A ) Transfecção de células de cancro do colo do útero SiHa com siRNAs segmentação

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(siPVT1) resultou num knockdown aproximada de 70% em

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lncRNA expressão, em comparação com células transfectadas com um ARNsi de controlo scrambled (siCONT) . células (B) SiHa transfectadas com siPVT1 exibiu uma diminuição significativa na proliferação de células em comparação com siCONT. células SiHa transfectadas foram também avaliadas para alterações nas alíneas (C) e migração (D) invasão 6 h ou 48 h após a introdução de quimioatractor (FBS), respectivamente. siPVT1 células mostrou uma diminuição significativa em ambos migração celular e invasão em comparação com células siCONT. Os resultados quantitativos são representados graficamente no lado esquerdo, enquanto as imagens representativas estão à direita. *** P 0,001, **** p 0,0001

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silenciamento aumenta a apoptose e resposta a cisplatina em células cancerosas do colo do útero

Até o momento, estratégias knockdown mediado por siRNA segmentação

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têm demonstrado o seu papel na sensibilidade cisplatina no mesotelioma maligno pleural [25] e as células cancerosas gástricas [26]. No entanto, a assinatura anti-apoptótica induzida pela

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em outros tipos de células cancerígenas [8,18,20,26] pode indicar que a sua contribuição para a resistência a cisplatina é mais abrangente. Assim, os nossos próximos experimentos foram concebidos para investigar o papel da

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na apoptose e cisplatina sensibilidade em células de câncer do colo do útero. Estendendo os resultados anteriormente mencionados, os nossos resultados mostram que

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knockdown em células SiHa aumentou significativamente os níveis de fragmentos citoplasmáticos associados histona-ADN (Fig 4A) e activo caspase-3 (figura 4B), o que sugere que

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também pode contribuir para a carcinogénese do colo do útero através da inibição da morte celular e apoptose. Além disso,

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knockdown por qualquer siRNA (Figura 4C) ou oligonucleidos de LNA (Fig 4D) conduz a um aumento da capacidade de resposta de células SiHa a cisplatina. Colectivamente, o fenotípica celular (perda de

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) dados funcionais sugere que

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é necessário para a proliferação, manutenção e resistência à cisplatina de células de câncer do colo do útero.

siPVT1 células exibiram um aumento significativo na morte de células (a) e apoptose (B) em comparação com células siCONT. (C) A proliferação de células SiHa siPVT1 foi significativamente diminuída em resposta a várias doses de cisplatina. (D) curva de dose-resposta para

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células SiHa transfectadas-LNA seguintes 4 h de tratamento com cisplatina e controle de.