Abstract

Objectivo

tetramérica α

2- macroglobulina (α

2M), um inibidor panproteinase plasma, é activada após a interacção com uma proteinase, e sofre uma grande alteração conformacional expor um sítio de reconhecimento do receptor em cada uma das suas subunidades. α ativados

2 M (α

2M *) liga-se a GRP78 superfície da célula cancerosa e desencadeia a sinalização proliferativa e anti-apoptótica. Nós estudamos o papel de α

2M * na regulação da mTORC1 e TORC2 sinalização no crescimento de células cancerosas humanas da próstata.

Métodos

técnicas Empregando imunoprecipitação e Western blotting bem como ensaios de quinase, a activação do mTORC1 e complexos mTORC2, bem como os alvos a jusante foram estudados. RNAi também foi utilizada para silenciar a expressão de Raptor, Rictor ou GRP78 em estudos paralelos.

Resultados

A estimulação das células com α

2M * promove a fosforilação da mTOR, TSC2, S6- quinase, 4EBP, Akt

T308, e Akt

S473 de forma a concentração e tempo-dependente. Rheb, Raptor, e Rictor também aumentou. α

2M * tratamento de células elevados atividade mTORC1 quinase como determinado por ensaios de cinase de mTOR ou Raptor imunoprecipitados. mTORC1 actividade foi sensível para LY294002 e rapamicina ou transfecção de células com ARNdc GRP78. Abaixo regulação da expressão Raptor por RNAi α significativamente reduzida

2M * induzida fosforilação S6-quinase no T389 e atividade da quinase em imunoprecipitados Raptor. α

células 2M * tenha sido tratada com demonstrar sobre um duplo aumento na atividade mTORC2 quinase, conforme determinado pelo ensaio de cinase de Akt

fosforilação e níveis de p-Akt

S473 em mTOR e rictor imunoprecipitados S473. mTORC2 actividade foi sensível para LY294002 e transfecção de células com ARNdc GRP78, mas insensível à rapamicina. Abaixo regulação da expressão Rictor por RNAi reduz significativamente α

2M * fosforilação induzida de Akt

fosforilação S473 em imunoprecipitados rictor.

Conclusão

A ligação de α

2M * a próstata GRP78 superfície da célula cancerosa regula positivamente mTORC1 e mTORC2 ativação e promove a síntese de proteínas nas células cancerosas da próstata

Citation:. Misra Reino Unido, Pizzo SV (2012) α Reconhecida-Receptor

2-macroglobulina Vinculado ao celular Surface-Associated GRP78 e ativa mTORC1 e mTORC2 sinalização em células do cancro da próstata. PLoS ONE 7 (12): e51735. doi: 10.1371 /journal.pone.0051735

editor: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, Áustria

Recebido: 19 de junho de 2012; Aceito: 05 de novembro de 2012; Publicado: 14 de Dezembro, 2012 |

Direitos de autor: © 2012 Misra, Pizzo. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Os autores não têm apoio ou financiamento para relatar

Conflito de interesses:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a capacidade das células cancerosas de prosperar

in vivo depende de muitos factores entre os quais estão o repertório de proteínas que modulam o seu ambiente. Enquanto o fígado produz grandes quantidades do inibidor de proteinase α

2-macroglobulina (α

2M) que é produzida por células de cancro e está ligada com o crescimento do tumor [1]. α

2M também é produzido localmente no tecido do estroma tumoral, como associado com o câncer de próstata [2]. É um inibidor da pan-proteinase que reage com metaloproteinases de matriz derivadas de tumor e antigénio específico da próstata (PSA). Enquanto o PSA está mais estreitamente identificado com cancro da próstata, que é também produzido por outros tumores, incluindo da mama [3]. Quando proteinases atacar a “região isco”, em cada um dos quatro α

subunidades 2m, ésteres de tiol ruptura e a proteína sofre uma alteração conformacional muito grande expondo locais de reconhecimento de receptores em cada subunidade [4]. Além de proteinases, a exposição de α

2M para pequenas aminas primárias ou amônia, por ataque direto contra os ésteres tiol, também induz a uma grande mudança conformacional expor esses sítios de reconhecimento de receptor [4]. Estas formas activadas são designados α

2M *. Embora GRP78 (glucose regulada proteína de Mr ~78000) é conhecida principalmente como uma chaperona residente retículo endoplasmático, que aparece na superfície da célula de muitos tipos de células malignas [5] – [10]. A ligação de α

2M * a tumor GRP78 superfície celular faz com que a sua autofosforilação [11], [12] activação para baixo fluxo pro-proliferativo e anti-apoptótica cascatas incluindo RAS /MAPK e sinalização PI 3-quinase /Akt [5] – [10]. tem, portanto, foi sugerido que a regulação positiva de GRP78 superfície da célula é parte do fenótipo agressivo em vários cancros, incluindo o da próstata e o melanoma [8]. Consistente com esta hipótese, auto-anticorpos contra o NH

domínio 2-terminal de GPR78 aparecem no soro de cancro da próstata e pacientes com melanoma em que eles são um biomarcador de comportamento agressivo [13], [14]. Estes anticorpos são agonistas que se ligam à mesma região de GRP78 onde α

2M se liga * [15]. Em contraste, os anticorpos monoclonais dirigidos contra o domínio do terminal carboxilo de GRP78 são antagonistas de α

2M * e anti-GRP78-NH anticorpos

2-terminais de domínio na cultura de células e ratinhos [10], [12], [16] – [20]. Com base nestas e outras observações, que a hipótese de que α ativados

funções 2M como um factor de crescimento e GRP78 associada à superfície celular como um receptor do factor de crescimento semelhante [5] – [10].

Painel A . α

2M * síntese de proteínas dependente da concentração. Painel B. A modulação da α

2M * A síntese de proteína em células induzidas por 1-LN. As barras são: (1) tampão; (2) α

* 2M (50 pM); (3) A wortmanina 30 nm /20 min, em seguida, α

* 2M (50 pM); (4) LY294002 (20 uM /20 min), em seguida, α

2M *; (5) A rapamicina (100 nm /20 min), em seguida, α

2M *; (6) actinomicina D (5 ug /ml /15 min), em seguida, α

2M *. Os valores no Painel A e B são a média ± DP de quatro expericias independentes. Os valores significativamente diferentes em nível de 5% para α

2M * células tenha sido tratada com assinalados com um asterisco (*).

Akt é uma quinase Ser /Tre expressa como isoformas, Akt1, Akt2 e Akt3, codificada por três genes diferentes [21]. Estas isoformas são quase idênticas em sequência de aminoácidos; No entanto, a sua expressão relativa difere em vários tecidos de mamífero [21]. Akt é o principal efector a jusante na via de PI 3-cinase e que regula a sobrevivência celular, a proliferação e o metabolismo. PI 3-quinase fosforila PIP2 para gerar PIP3 que se liga a Akt promovendo, assim, a sua translocação para a membrana do plasma onde ele é fosforilada em Thr308 no domínio catalítico por PDK1 e Ser473 no domínio motivo hidrofóbico por mTORC2 [21] – [24]. A fosforilação em ambas estas posições é necessária para a activação completa de Akt1. Akt1 também é fosforilada co-translocationally em Thr450 no motivo “virar” por mTORC2 [25] – [27]. A fosforilação de Akt sua vez motivo é essencial para recém-sintetizado Akt para assumir a sua dobragem e a estabilidade adequada. Mutações de RAS que activam Akt, ocorrer em ~ 30% de tumores epiteliais e a amplificação do gene de Akt também ocorre num subconjunto de cancros humanos. Além disso, a ablação parcial da Akt é suficiente para inibir o desenvolvimento de tumores em ratinhos PTEN +/- [28], [29]. Em amostras clínicas de cancro da próstata a sobre-expressão e activação de Akt1 está associada com níveis elevados de PSA pré-operatórias, os graus mais elevados de Gleason, e tempos mais curtos de recidiva da doença [29] – [32]. Estudos imuno-histoquímicos mostram uma coloração muito aumentada de P-Akt

S473 no cancro da próstata pouco diferenciado [29], [32].

No painel A está ilustrado o efeito do tempo de incubação de células com α

* 2M (50 pM) e o Painel B mostra o efeito de várias concentrações de α

* 2M durante 25 minutos a expressão de: p-mTOR

T2481 (o); Raptor (▵); Rictor (▴); GβL (□); p-TSC (•); e Rheb (▪) tal como determinado por Western blotting. Uma imunotransferência representativa de três a cinco experiências é mostrado para cada proteína no Painel A e Painel B. A expressão destas proteínas está mostrado em unidades de fluorescência arbitrárias e é expressa como a média ± DP de três a cinco experiências independentes. controles de carga de proteína, quer proteínas-alvo não fosforilados ou actina, foram realizadas tanto para Painel A e Painel B são mostrados abaixo dos respectivos imunotransfer�cias.

alvo da rapamicina em mamíferos (mTOR), uma evolutivamente conservada Ser /Tre quinase, é um regulador chave da Akt fosforilação (ver comentários [33] – [37], e suas referências). Há um interesse crescente na segmentação mTOR no tratamento de cânceres, como de próstata [28], [33], [34], [36], [37]. Este objectivo pode ser complicada pelo facto de mTOR está presente em dois complexos proteicos física e funcionalmente distintas designadas como mTORC1 e mTORC2, respectivamente (ver comentários 33-37, e suas referências). Estes dois complexos diferem na sua regulação, alvos a jusante, e sensibilidade ao inibidor de rapamicina. mTORC1 é um homodímero de mTOR contendo rapina, e GβL; é sensível à rapamicina. mTORC1 activado promove o crescimento celular em parte por fosforilação diretamente os reguladores translacionais S6-quinase e eIF4E proteína (4EBP) (35) de ligação. fosforilação induzida por Akt de PRAS40 Deptor e faz com que a sua dissociação da rapina e promove o recrutamento dos seus substratos a jusante S6-Kinase1 e 2, 4EBP1, e 4EBP2 (ver comentários [33] – [37] e referências aí contidas). A ligação de Rheb • GTP para mTORC1 resulta na ativação mTORC1, enquanto que a ligação a Rheb • PIB em sua inibição. A fosforilação de TSC2 por Akt1 inibe a sua actividade de GTPase levando ao aumento da carga em GTP Rheb e consequente aumento da actividade mTORC1 (ver comentários [33] – [37] e referências aí contidas). S6-quinase regula mTORC1 através de uma via de sinalização de feedback negativo que fosforila IRS e inibe a PI 3-cinase e activação de Akt. O complexo mTORC2, além de mTOR, contém Rictor, GβL, Deptor, Protor, e mSIN1 e é insensível à inibição rapamicina aguda (ver [33] – [37] e referências aí contidas). No entanto, a exposição prolongada a mTORC2 rapamicina inibe mTORC2 em alguns tipos de células [24], [33] – [35]. Protor se liga firmemente a Rictor, mas não é necessária para a actividade mTORC2 [33] – [35]. Ambos mTORC1 mTORC2 e são activadas por factores de crescimento incluindo a insulina e factor de crescimento semelhante a insulina [33] – [35]. No entanto, os mecanismos através dos quais os factores de crescimento activam mTORC2 não está claramente entendido [33] – [37]. mTORC2 associados com ribossomas e esta pode servir como um mecanismo de regulação a montante [38], [39]. estimulação de insulina de células normais e cancerosas mTORC2 promove a ligação a ribossomas e sinalização PI 3-quinase [38], [39]. GβL liga mTORC1 e mTORC2 perto do domínio de cinase e é necessário para a integridade mTORC2. Deptor também se liga a ambos mTORC1 e mTORC2 perto do domínio quinase e negativamente regula tanto mTORC1 ea atividade mTORC2 [33] – [37].

Em nossos estudos anteriores que demonstraram que α

2M * NH

2 de ligação a GRP78 superfície celular associado em células de cancro da próstata desencadeia a proliferação e sinalização anti-apoptótica. O pré-tratamento de células com inibidores destas vias de sinalização, pré-tratamento com anticorpos contra o domínio carboxi-terminal de GRP78, ou a transfecção de células com dsGRP78 ARN, profundamente inibe estas vias de sinalização [10], [12], [16] – [20] . A estimulação de células de cancro da próstata com α

2M * também induz a síntese de GRP78, que em parte é mediada pelo factor de transcrição TFII-I desde a transfecção de células com RNA-I dsTFII suprime significativamente GRP78 upregulation [40]. Este tratamento também inibe a translocação da superfície da célula de I-TFII, promoveu a entrada de cálcio, e de sinalização apoptótica [40]. A estimulação de células de cancro da próstata com α

2M * também faz com que sobre-regulação transcricional e translacional de síntese PSA [10], que é segregada e complexos com α

2M. O tratamento de células com α

complexo 2M-PSA promove a síntese de ADN e proteína e regula positivamente RAS /MAPK e PI 3-quinase /Akt vias de sinalização similares às observadas em α

2M-NH

2 células estimuladas [10 ]. Como α

2M-NH

2, α

2M-PSA, provoca um aumento da expressão de p-S6-quinase, p-Akt

T308 e P-Akt

S473, a efetora sinalização componentes de mTORC1 activado e mTORC2 [10]. Tendo em vista o papel fundamental de sinalização mTOR no crescimento tumoral e metástase, e as nossas observações sobre α

2M * induzida pelo crescimento de células de cancro da próstata, proliferação celular e sobre-regulação de PI 3-quinase /AKT de sinalização [6], [7 ], [9], [10], [12], [16], [17], [18], nós avaliamos o papel de mTORC1 e mTORC2 vias de sinalização em células de câncer de próstata estimulados com α

2M *. Para avaliar a especificidade de GRP78 superfície celular em α

2M * induzida por eventos de sinalização, que tenham silenciado a expressão de GRP78 por ARNi, bem como o pré-tratamento das células com anticorpos contra o domínio do terminal carboxilo de GRP78. Para determinar a especificidade de mTORC1 na activação do seu substrato a jusante S6-quinase e de mTORC2 em fosforilar Akt

S473, que têm empregado rapina e Rictor ARNi tratamento, respectivamente. Aqui nós mostramos que α

2M * ativa mTORC1 quinase, conforme determinado pelo S6-quinase e fosforilação 4EBP1 e mTORC2 quinase, conforme determinado pelo Akt

S473 fosforilação. Silenciar a expressão do gene GRP78 por RNAi ou tratamento com anticorpos GRP78 α muito reprimidas

2M * ativação induzida de mTORC1 e mTORC2 nestas células. Estes estudos demonstram ainda mais o papel de fazer circular α

2M, um inibidor de proteinase panela, como um factor de crescimento e da chaperona GRP78 como um receptor do factor de crescimento importante para o crescimento celular em ambientes fisiopatológicos.

Um representante imunotransferência de p-S6-quinase (O) e p-4EBP1 (•) a partir três a cinco experiências é mostrado para cada proteína nos painéis a e B. p-S6-quinase (O) e p-4EBP1 (•) são expressos em unidades de fluorescência arbitrárias como médias ± DP de três a quatro experiências independentes. O controle de carga de proteína para o Painel A e Painel B são mostrados abaixo dos respectivos imunotransfer�cias.

Materiais e Métodos

Materiais

Os meios de cultura foram adquiridos a Invitrogen. α reconhecidos por receptores

2M * foi produzido por reacção de α

2M com metilamina como descrito anteriormente [9). Os anticorpos contra mTOR, p-mTOR

S2481, GβL, p-TSC2

T1462, Rheb, S6-quinase, p-S6-quinase

T235 /236, p-S6-quinase

T389, p-S6-quinase

T229, 4EBP1, p-4EBP1

T37 /46, Akt1, p-Akt

T308, p-Akt

S473 foram adquiridos da Cell Signaling Technology (Danvers, MA) . Os anticorpos contra rapina, Rictor, Protor eram de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). O anticorpo anti-mSIN1 foi de Bethyl Laboratories, Inc (Montgomery, TX). O anticorpo anti-actina foi de Sigma (St. Louis, MO). PHAS-1 (4EBP1) foi de Stratgene. constructo GST-S6-cinase foi expresso e purificado de acordo com o protocolo fornecido pelo Prof Blenis (Harvard University Medicai School). Os anticorpos contra o domínio do terminal carboxilo de GRP78 eram de Aventa biofarmacêutica Corp (San Diego, CA). [

3H] leucina (actividade específica 115,4 Ci /mmol) e [

33P] -γ-ATP (actividade específica 3000 Ci /mmol) era da Perkin-Elmer Life Sciences. A rapamicina e LY294002 eram de Biomol (Plymouth, PA). Todos os outros materiais eram de grau analítico e foram adquiridos localmente

.

•) tal como determinado por Western blotting. A immunoblot representante da P-Akt

T308 e P-Akt

S473 de três a quatro experiências é mostrado abaixo do gráfico. A expressão destas proteínas está mostrado em unidades de fluorescência arbitrárias e é expressa como a média ± DP de três a quatro experiências. Os controles de carga de proteína para Painel A e Painel B são mostrados abaixo dos respectivos imunotransfer�cias.

linhas celulares de cancro da próstata

Em um relatório anterior, estudamos duas linhas de cancro da próstata 1-LN e DU-145, que expressam GRP78 na sua superfície celular e a linha de cancro da próstata PC-3, que expressa pouco GRP78 na sua superfície celular [10], [12]. A linha de células 1-LN altamente metastático é derivado da linha PC-3 e foi um presente amável do Dr. Phillip Walther (Duke University Medical Center, Durham, NC). As linhas de células DU-145 PC-3 e foram obtidos a partir da American Type Culture Collection. A linha de células 1-LN foi derivado a partir de um modelo de tumor do flanco em que as células de PC-3 foram implantados em ratinhos nus. As células foram obtidas a partir de uma metástase de nódulo linfático nestes ratinhos. Uma vez que esta linha celular expressa GRP78 na superfície da célula e nenhum ou muito pouco LRP, temos usado extensivamente esta linha para estudar o papel de GRP78 superfície celular em crescimento de células de cancro. Esta linha celular está disponível para qualquer investigador que deseje usá-las. Dependendo das experiências, as células foram cultivadas quer em 6, 12, 24 ou 48 poços até à confluência em placas de meio RPMI contendo 10% de soro fetal bovino, glutamina 2 mM, 12,5 unidades /ml de penicilina, 6,5 ug /ml de estreptomicina e 10 nM de insulina (RPMI-s) num humidificada de CO

2 (5%) da incubadora. A 90% de confluência, o meio foi aspirado. As monocamadas foram lavadas com HHBSS gelada, um volume de meio fresco e as células utilizadas para as experiências descritas abaixo.

Uma imunotransferência representativa de três a quatro experiências de mTOR, rapina, GβL, mSIN1, e Rictor presença Protor nestes respectivos imunoprecipitados é mostrado. As células foram tratadas com: (1) tampão e (2) de 50 pM de α

* 2M durante 25 min

Determinação dos Efeitos da α

2M * na síntese de proteínas. As células em 1-LN

células 1-Ln (300 × 10

3 células /poço) em placas de 48 poços foram cultivadas em meio RPMI-S num humidificada de CO

2 (5%) incubadora a 37 ° C. Em cerca de 90% de confluência, o meio foi aspirado um volume de meio RPMI-S foi adicionado seguido pela adição quer de tampão ou α

* 2M (50 pM). Adicionou-se a cada cavidade [

3H] leucina (2 uCi /ml) e as células foram incubadas durante a noite. As reacções foram terminadas por aspiração do meio e lavou-se três vezes as monocamadas duas vezes com gelada TCA a 5%, seguido de três lavagens com PBS arrefecido em gelo. As células foram lisadas num volume de 1 de NaOH (40 ° C /2 h), a proteína foi estimada e os lisados ​​foram contadas num contador de cintilação líquida. Em experiências em que a modulação de α

* síntese de proteínas induzida pelo 2M foi estudada, as células foram pré-tratadas com o inibidor de PI 3-quinase LY294002 (20 uM /20 min), a rapamicina inibidor de mTOR (100 nm /15 min) ou actinomicina D (5 ug /ml /20 min), antes de adicionar α

* 2M (50 pM /dia para o outro). Outros detalhes de quantificar [

3H] incorporação de leucina em proteínas celulares foram como descrito [41].

A fosforilação de S6-quinase e 4EBP1 foi determinada por [

33P] incorporação -γ-ATP e autorradiografia (AR) e por imunotransferência (IB). Painel A. Um diagrama de barras que mostra α

2M * ativação induzida de mTORC1 e sua modulação pelo LY294002 e rapamicina em imunoprecipitados de mTOR como determinada por autoradiografia. Os bares e pistas nas auto-radiografias são: (1) tampão; (2) α

* 2M (50 pM /25 min); (3) LY294002 (20 uM /20 min), em seguida, α

* 2M (50 pM /25 min); e (4) rapamicina (100 nm /15 min), em seguida, α

* 2M (50 pM /25 min). A autorradiografia representante (AR) de três experiências individuais é mostrado abaixo do diagrama de barras. A fosforilação da S6-quinase (▪) e 4EBP1 (□) é expressa em unidades de fluorescência arbitrárias e é a média ± de três experiências independentes. Também é mostrado abaixo AR é uma imunotransferência representante (IB) de três experiências de p-S6-cinase e p-4EBP1 obtido a partir de imunoprecipitados de mTOR de células tratadas como em análise autorradiográfica do painel A. Painel B. Um diagrama de barras que mostra o efeito de silenciamento GRP78 expressão por RNAi em α

2M * induzida por activação do mTORC1 em immunopreciptates mTOR em células 1-LN, conforme determinado por autorradiograf ia. As barras e as pistas da autorradiografia (AR) são: (1) tampão de lipofectamina +; (2) lipfectamine + α

2M (50 pM /25 min); (3) GRP78 dsRNA (100 Nm /48h), então α

2M * (para PM /25 min); e (4) mexidos ARNdc (100 nM /48 h) do que α

2 M * (a pM /25 min). A autorradiografia representativa da S6-quinase (▪) e 4EBP1 (□) de três experiências é mostrado abaixo no diagrama de barras. A fosforilação da S6-quinase (▪) e 4EBP1 (□) é expressa em unidades de fluorescência arbitrárias como média ± DP de três experiências independentes. Também é mostrado abaixo da autorradiografia (AR) é um representante de immunoblot (IB) de p-S6-cinase e p-4EBP1 obtido a partir de imunoprecipitados de células de mTOR 1-LN tratados como na análise autorradiográfica no painel B. Um representante de imunotransferência de três experiências mostrando a expressão de GRP78 em células transfectadas com ARNcd GRP78, também é mostrada. As pistas na imunotransferência são: (1) tampão de lipofectamina +; (2) lipofectamina + α

* 2M (50 horas /25 min); (3) GRP78 ARNdc (100 nM /48 h) + α

2M *; e (4) mexidos dsRNAi (100 nM /48 h) + α

2M *. Painel C. Um diagrama de barras que mostra o efeito de silenciamento de expressão GRP78 por RNAi em α

2M * fosforilação induzida de S6-quinase (▪) e 4EBP1 (□) em imunoprecipitados de células rapina 1-LN, conforme determinado por autorradiograf ia. As barras e as pistas na autorradiografia (AR) são idênticos aos do diagrama de barras e autorradiografia no Painel B. A autorradiografia representativa (AR) da S6-quinase e 4EBP1 de três experiências é mostrado abaixo no diagrama de barras. A fosforilação da S6-quinase (▪) e 4EBP1 (□) é expressa em unidades de fluorescência arbitrárias como a média ± DP de três experiências. Também é mostrado abaixo da autorradiografia (AR) é um representante de immunoblot (IB) de três experiências de p-S6-cinase e p-4EBP1 obtido a partir de imunoprecipitados de células de rapina 1-LN tratados como na análise autorradiográfica no Painel C. Painel D. autorradiografia mostrando α

2M * fosforilação induzida de S6-quinase e 4EBP1 em DU-145 células de cancro da próstata, mas não em células PC-3 de cancro da próstata. As pistas da auto-radiografia são: (1) tampão; (2) α

2M *. Para mais detalhes seção “Procedimentos Experimentais” ver. A autorradiografia mostrada é representativos de quatro experiências. Painel E. Um diagrama de barras que mostra que os anticorpos contra o domínio do terminal carboxilo de GRP78 inibição α

2M * fosforilação induzida de S6-quinase (▪) e 4EBP1 (□) em imunoprecipitados de células de mTOR 1-LN. As barras são: (1) tampão; (2) α

* 2M (50 pM /25 min); (3) os anticorpos contra o domínio do terminal carboxilo de GRP78 (3 ug /ml /h 1), em seguida, α

2M *. A fosforilação da S6-quinase e 4EBP1 foi determinado por análise autorradiográfica e é expressa em unidades arbitrárias e representa a média ± DP de três experiências. Os valores significativamente diferentes de 5% para α

* 2M e mexidos células tratadas com ARNdc são indicados por um asterisco (*) em todos os painéis A a E.

Efeitos de 1-LN a incubação de células com α

2M * em p-mTOR

S2481, p-TSC2

T1462, Rheb, Raptor, Rictor, GβL, p-S6-quinase, p-4EBP1, p-Akt

T308, e P-Akt

S473

células

1-Ln (300 × 10

3 células /poço) em meio RPMI-S em placas de 6 cavidades foram incubadas como acima. A 90% de confluência, o meio foi aspirado, um volume de meio RPMI-S adicionados a cada poço. Num conjunto de experiências, as células foram estimuladas com várias concentrações de α

* 2M e incubou-se durante 30 min. Num outro conjunto de estudos, as células foram estimuladas com 50 pM de α

* 2M e incubados durante vários tempos a 37 ° C num humidificada de CO

2 (5%) da incubadora. As reacções foram terminadas por aspiração do meio, de um volume de tampão de lise A contendo 50 mM de Tris • HCl (pH 7,5), NaOH a 120 mM, NP40 a 0,1%, fluoreto de 25 mM de sódio, pirofosfato de sódio 1 mM, ortovanadato de sódio 0,1 mM, 1 mM PMSF, benzamidina 1 mM e leupeptina (10 ng /ml) adicionada e colocada sobre gelo durante 15 min. Os lisados ​​foram transferidos para tubos de Eppendorf e centrifugou-se a 1000 rpm durante 5 min a 4 ° C para remover os restos celulares. Os sobrenadantes foram removidos para novos tubos e o seu conteúdo de proteína foi determinada [42]. Para uma quantidade igual de proteína, num volume de amostra de 4 × tampão adicionado, tubos fervidas durante 5 min e centrifugadas. As amostras foram sujeitas a electroforese em géis de poliacrilamida (12,5%, 10% ou 4-20% de gel de gradiente, se necessário). As bandas de proteína nos géis foram transferidos para membranas de Hybond-P e experimentos em membranas separadas imunotransferidas com anticorpos contra a P-mTOR

S2481, p-TSC2

T1462, rapina, Rictor, GβL, Rheb, p-S6-cinase

S235 /236, P-4EBP1

T37 /46, P-Akt

T308 ou P-Akt

S473 durante 16 h a 4 ° C com rotação. A detecção e quantificação de imunotransferências para os respectivos antigénios foram realizadas por ECF e tempestade 860 Phosphorimager. As respectivas membranas foram sondado para os controles de carga de proteína, proteína alvo não fosforilada ou actina, neste e nos seguintes estudos. A especificidade dos anticorpos utilizados aqui e nas experiências descritas abaixo foi determinada por tratamento das células com anticorpos não-imunes e lisados ​​de células transformadas como acima. Sob as condições experimentais, não foi observada nenhuma reactividade destes controlos [10], [43], [44].

Painel A. diagrama de barras que mostra os níveis de rapina em células transfectadas com ARNcd de rapina e estimuladas com α

2M * ou insulina. As barras são: (1) tampão de lipofectamina +; (2) lipofectamina + α

* 2M (50 pM /25 min); (3) lipofectamina + insulina (200 nm /20 min); (4) mexidos ARNdc (100 nM /48 h) + insulina; (5) rapina ARNdc (100 nM /48 h); (6) Raptor dsRNA (100 nm /48 h), então α

2M *; (7) rapina ARNdc (100 nM /48 h), em seguida, insulina (200 nm /20 min); (8) rapamicina (100 nm /20 min), então a insulina. Os valores são média ± DP de três a quatro experiências independentes e estão expressos como unidades de fluorescência arbitrárias. Os valores significativamente diferentes ao nível de 5% para α

2M *, insulina e mexidos ARNdc tratadas células são indicados por um asterisco (*). A immunoblot representante do Raptor de três para quatro experimentos, juntamente com a sua actina controle de carga de proteína é mostrado abaixo do diagrama de barras. Painel B. Um diagrama de barras que ilustra a activação mTORC1 em células tratadas com α

* 2M e a insulina e o efeito da transfecção com rapina ARNdc sobre a sua activação, como medido pelo ensaio de fosforilação de cinase-S6 por autorradiografia. Os bares e faixas em auto-radiografia são: (1) lipofectamina + tampão; (2) lipofectamina + α

* 2M (50 pM /25 min); (3) rapina ARNdc (100 nM /48 h); (4) Raptor dsRNA + α

2M *; (5) lipofectamina + insulina (200 nm /20 min); (6) mexidos ARNdc (100 nM /48 h) + insulina; (7) rapina ARNdc (100 nm /20 min), então a insulina; (8) rapamicina (100 nm /20 min), em seguida, α

2M *; (9) LY294002 (min a 20 mM /20), então a insulina; (10) rapamicina (100 nm /20 min), então a insulina. A autorradiografia representativa de três experiências da S6-quinase fosforilação é mostrado abaixo no diagrama de barras. Os valores são a média ± DP de três experiências e foram expressos em unidades arbitrárias. Os valores significativamente diferentes níveis em 5% para α

2M *, insulina e mexidos ARNdc tratadas células são indicados por um asterisco (*). Painel C. Um diagrama de barras que mostra os níveis de S6-quinase fosforilada no T389 (▪); T229 (ver quadrado cinza) e T 235/236 (□) em células estimuladas com α

2M * ou insulina e transfectadas com Raptor dsRNA. Os bares são como em imunotransfer�cias Painel A. representativos de p-S6-quinase

T389, p-S6-quinase

T229 e p-S6-quinase

T235 /236 de três experiências, juntamente com a sua carga de proteína controle é mostrado abaixo do diagrama de barras. Os valores são a média ± DP de três experiências e são expressos em unidades de fluorescência arbitrárias. Os valores significativamente diferentes em nível de 5% para α

2M *, a insulina ou mexidos dsRNA são indicados por um asterisco (*). Painel D. Um diagrama de barras que mostra os níveis de fosforilação de 4EBP1, em células tratadas com α

2M * e insulina ou transfectada com Raptor dsRNA. Os bares são como no painel A. A immunoblot representante da p-4EBP1 de três experiências, juntamente com o seu controlo carga de proteína é mostrado abaixo do diagrama de barras. Os valores são a média ± DP de três experiências e são expressos em unidades de fluorescência arbitrárias. Os valores significativamente diferentes em nível de 5% para α

2M *, insulina e mexidos células tratadas com dsRNA são indicados por um asterisco (*).

Caracterização dos Componentes de mTORC1 e mTORC2 Complexos em 1-LN células cancerosas da próstata estimulado com α

2M *

células 1-Ln (3 × 10

6 por poço em placas de 6 poços) incubadas durante a noite em meio RPMI-S foram lavadas duas vezes com gelada HHBSS e um volume de meio RPMI-S adicionados a cada poço. Depois de se equilibrar a temperatura, de células nos poços foram expostas a tampão ou α

* 2M (50 pM /25 min) e incubou-se como acima. As reacções foram interrompidas por aspiração do meio e um volume de tampão CHAPS lise (tampão B) contendo HEPE 40 mM (pH 7,5), 120 mM de NaCl, 1 mM de EDTA, 10 mM de pirofosfato de sódio, 10 mM de β-glicerofosfato, ortovanadato de sódio 0,5 mM , 0,3% CHAPS e um comprimido cocktail inibidor de protease Roche (1 comprimido /10 ml) foi adicionado e as células foram lisadas em gelo durante 15 min. Os lisados ​​foram transferidos para separar tubos Eppendorf, centrifugou-se (1000 rpm /5 min /4 ° C) e os sobrenadantes utilizados para a estimativa de proteínas e imunoprecipi tacão. Quantidades iguais de proteína de lisado (200-250 g) em experiências separadas foram utilizadas para imunoprecipitação com anticorpos rapina (01:50, gato Santa Cruz # sc81537) anticorpos, ou rictor (1:50, Santa Cruz cat # 81538), seguida pela adição de 40 ul de proteína a agarose e incubadas com conteúdo de rotação durante a noite a 4 ° C. Raptor e rictor imunoprecipitados foram recuperados por micro-centrifugação (2000 rpm /5 min /4 ° C) e lavou-se duas vezes com tampão de lise frio B. Para rapina e Rictor imunoprecipita um volume de 4 × tampão de amostra foi adicionada, tubos fervida durante 5 min , centrifugados, a electroforese (4-20%, 12,5% ou 10% de geles de acrilamida), transferidos para membranas Hybond-P e as membranas coradas imunologicamente com anticorpos específicos para mTOR, rapina, Rictor, GβL, mSIN1 e Protor. As bandas de proteínas nas membranas foram quantificados como acima [43], [44].

Painel A. Um diagrama de barras que mostra α

2M * fosforilação induzida de Akt no T308 (▪) e S473 ( □) em ensaios de cinase de imunoprecipitados de mTOR. Os bares e pistas no immunoblot são: (1) tampão; (2) α

* 2M (50 pM /25 min); (3) LY294002 (20 uM /25 min), em seguida, α

2M *; (4) rapamicina (100 nm /20 min), em seguida, α

2M *. Os valores são a média ± DP de quatro experiências independentes e estão expressos como fmol [

33P] /mg de proteína celular -γ-ATP incorporada. Os valores significativamente diferentes ao nível de 5% para α

2M células tenha sido tratada com * são indicados por um asterisco (*). Painel B. Um diagrama de barras que mostra α

2M * fosforilação induzida de Akt no T308 (▪) e S473 (□) em ensaios de cinase de imunoprecipitados rictor. Os bares e faixas em immunoblot são: (1) tampão; (2) α

* 2M (50 pM /25 min); (3) LY294002 (20 mM /25 min), em seguida, α

* 2M e (4) rapamicina (100 nm /20 min).