Abstract

A associação epidemiológica entre o uso de estatina e diminuição do risco de cancro da próstata avançado sugere que as estatinas podem inibir o desenvolvimento de câncer de próstata e /ou progressão. Foram realizados estudos para determinar os efeitos de um modelo de estatina, atorvastatina (ATO), na proliferação e diferenciação de células de cancro da próstata, e para identificar possíveis mecanismos de acção ATO. ATO inibiu o

in vitro

proliferação de células cancerosas da próstata humana, tanto LNCaP e PC3 de maneira dose e tempo-dependente. A actividade inibidora maior do ATO, em células PC3 foi associada com a indução de autofagia em que a linha de células, como demonstrado por um aumento da expressão de LC3-II. miR-182 foi consistentemente regulada positivamente pela ATO, em células PC3, mas não em células LNCaP. ATO regulação positiva de miR-182 em células PC3 era p53-independente e foi revertida por geranilgeraniol. A transfecção de inibidores de miR-182 diminuiu a expressão de miR-182 em 98% e atenuou a actividade antiproliferativa de ATO. miR-182 a expressão em células PC3 também foi aumentada em resposta ao stress induzido por retirada de soro, sugerindo que o miR-182 sobre-regulação pode ocorrer devido ao stress nutricional. BCL2 e p21 foram identificados como potenciais genes alvo de miR-182 em células PC3. Bcl2 foi regulada negativamente e p21 foi regulado positivamente em células PC3 expostos a ATO. Estes dados sugerem que miR-182 pode ser um miRNA tensão-sensível que medeia ação ATO em células de câncer de próstata

Citation:. Peng X, Li W, Yuan L, Mehta RG, Kopelovich L, McCormick DL (2013 ) inibição da proliferação e indução de autofagia por atorvastatina em células de cancro da próstata PC3 Correlacionar com regulação negativa do Bcl2 e regulação positiva de miR-182 e p21. PLoS ONE 8 (8): e70442. doi: 10.1371 /journal.pone.0070442

Edição: Natasha Kyprianou, da Universidade de Kentucky College of Medicine, Estados Unidos da América

Recebido: 21 de março, 2013; Aceito: 18 de junho de 2013; Publicação: 01 de agosto de 2013

Direitos de autor: © 2013 Peng et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi suportado por contrato N01-CN-43303 da Divisão de Prevenção do Cancro, Instituto Nacional do Câncer, do Departamento de Saúde e Serviços Humanos. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

as estatinas são amplamente utilizados para a prevenção e tratamento da hipercolesterolemia; a actividade de redução do colesterol das estatinas é efectuada através da sua inibição da 3-hidroxi-3-metil-glutaril coenzima A (HMG-CoA) redutase, uma enzima chave na biossíntese do colesterol [1], [2]. Além de efeitos sobre a biossíntese do colesterol, as estatinas, como a atorvastatina (ATO) têm atraído um interesse considerável para a sua possível utilidade para a prevenção e terapia do cancro [3], [4].

Os resultados de vários estudos epidemiológicos e meta -analyses sugerem uma relação inversa entre o uso de estatinas eo risco de câncer de próstata, especialmente o risco de câncer de próstata avançado ou metastático [5], [6], [7]. Dados recentes a partir de estudos em modelos experimentais de cancro da próstata demonstraram que a co-administração de estatinas com outros agentes podem produzir efeitos aditivos ou sinérgicos anticancerígenos [4], [8]. Vários mecanismos potenciais foram identificados por meio do qual as estatinas podem modular a progressão do cancro; estes mecanismos incluem a inibição da proliferação celular, indução de autofagia e apoptose, e a inibição da angiogénese [3], [9], [10]. As estatinas são inibidores potentes da biossíntese do mevalonato [11], resultando na inibição da prenilação de proteínas; os efeitos antiproliferativos e anticancerígenos das estatinas poderiam ser afetados por essa via. No entanto, o mecanismo bioquímico específico (s) através do qual ATO e outras estatinas exercer preventiva do cancro e /ou actividade terapêutica na próstata permanecem largamente indefinida.

Autophagy é um processo celular através do qual macromoléculas e organelos são degradados durante períodos stress de celular associada com a depleção de nutrientes, infecção, ou apoptose [9].

in vitro

Dados recentes demonstram que ATO pode induzir a autofagia e morte celular associada a autofagia em células de câncer de próstata PC3 [9]. Nesta base, a indução de autofagia fornece um mecanismo potencial pelo qual a inibição da progressão do cancro da próstata pela ATO pode ser efectuada. Em células cancerosas da próstata PC3, ATO induz fluxo autofágica, parada do ciclo celular e, em seguida, a morte celular [9]. Neste processo, a indução de autofagia parece ser necessário um passo anterior à morte da célula [9], [12].

miARNs são pequenos RNAs não-codificantes que controlam a expressão do gene pelo desencadeamento repressão tradução ou a degradação de ARNm [13], [14]. miARNs parecem estar envolvidas na regulação de uma grande variedade de processos celulares, e padrões alterados de expressão de miARN são vistas em um certo número de condições patológicas. Evidências sugerem que a expressão de miRNA é alterada em cancros em vários locais, incluindo o de próstata [15], [16], [17]; alterações na expressão de miARN específicos poderia fornecer um mecanismo através do qual os agentes farmacológicos e manipulações dietéticas podem inibir a indução e /ou a progressão do cancro. Além disso, os perfis de miARN pode ser útil na caracterização de assinaturas moleculares de neoplasias [18] e na identificação de potenciais alvos para o desenvolvimento de fármacos anticancerígenos [19]. Por exemplo, a expressão de miARNs em células cancerosas é modulada pela terapêuticos para o cancro, tais como doxorrubicina e trastuzumab [20], [21]. Do mesmo modo, a modulação da expressão de miARN por componentes alimentares, tais como folato, retinóides, e curcumina pode ser a base das suas actividades preventivas do cancro [18]. Nesta base, a hipótese de que alterações na expressão de miARN pode ser responsável por, ou associada com, a acção ATO, em células de cancro da próstata, e que a expressão alterada de miARNs específicos está associada à indução de autofagia pela ATO.

materiais e Métodos

Reagentes

a atorvastatina (ATO) foi fornecidos pelo Repositório agente quimiopreventivo mantido pela Divisão de Prevenção do Cancro, Instituto Nacional do Câncer, Rockville, MD. ATO foi dissolvido em DMSO (50 mM) e foi armazenada a -20 ° C antes de usar. Geranilgeraniol (GGOH), farnesol (FOH), CoQ10, esqualeno, e MTT (brometo de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazólio) foram adquiridos da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO ).

linhas celulares, cultura de células e de Proliferação celular Ensaio

as células humanas do cancro da próstata (células PC3 e células LNCaP) foram comprados na American Type Culture Collection (Manassas, VA). Sublinhas de células PC3 (clones 7, 19 e 20) que foram estabelecidas através da selecção clonal [22] foram gentilmente cedidas pelo Dr. Ann R. Kennedy, da Universidade da Pensilvânia. Todas as linhas celulares de cancro da próstata foram cultivadas em meio RPMI contendo 10% de FBS. A proliferação celular foi quantificada utilizando o ensaio de MTT ou do ensaio de violeta de cristal (CV), ou por contagem directa usando um Contador de Partículas Coulter Z2 (Beckman Coulter, Brea, CA). Estudos preliminares realizados em nosso laboratório demonstraram que a absorvância (valor OD) tanto para MTT e ensaios CV é proporcional ao número de células.

Análise Western Blot

a 40-50% de confluência, as células foram expostas a ATO durante 24 h, 48 h ou 72 h. Após a exposição, os lisados ​​celulares foram preparados e 50 ug de proteína total foi carregado para análise de Western blot. anticorpo policlonal LC3-II foi comprado de Abgent (San Diego, CA). Os anticorpos monoclonais de ratinho e p21 Bcl2 eram de NeoMarker (Fremont, CA). anticorpo policlonal de actina e α-tubulina, p53 e PCNA anticorpos monoclonais e os anticorpos secundários foram adquiridos a partir de Santa Cruz Biotech (Santa Cruz, CA).

Microarray Analysis

células PC3 e LNCaP foram semeadas em placas de cultura de células de modo a que atingiu -30% de confluência no dia 2. Nessa altura, o meio de cultura foi substituído e as células foram expostas a ATO (10 uM) durante 24 h. O ARN total a ser utilizada em ambos os ensaios de ARNm e de miARN foi isolado e purificado utilizando o kit de isolamento de ARN Ribopure (Invitrogen, Grand Island, NY). microarray mRNA e miRNA variedade de perfis foram realizados por género BioSystem (Northbrook, IL) usando matrizes GE 4x44K Agilent Humanos v2 e Agilent miRNA Humano matrizes v14 Rev. 2, respectivamente; microarray paralelo e miARN perfis foram realizados utilizando as mesmas amostras de ARN total. Os dados foram analisados ​​usando o Feature Extraction Agilent e pacotes de software v7.3.1 GeneSpring GX. arquivos de microarranjos para as 4 amostras analisadas neste relatório estão disponíveis no GEO, adesão GSE46376.

RT-PCR quantitativo

O RNA total foi extraído com o reagente Trizol (Invitrogen), e analisa mRNA foram realizados tal como descrito anteriormente [23]. Duas reacções de RT de cada amostra foram reunidas e diluídas com uma quantidade igual de DNase /RNase água livre. PCR em tempo real foi realizado com o produto de RT 2 mL diluído em um MyiQ Real-Time PCR System Detecção (Bio-Rad, Hercules, CA), utilizando o IQ ™ SYBR Green PCR Supermix (Bio-Rad) de acordo com as instruções do fabricante [24] . iniciadores específicos para o gene foram concebidos com o iniciador de 3 (https://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi). Actina foi utilizado como um gene de referência para a normalização dos dados. induções dobra foram calculados utilizando a fórmula 2

– (ΔΔCt), onde ΔΔCt é ΔCt

(tratamento) – ΔCt

(controle), ΔCt é Ct

(gene alvo) – Ct

(actina) e CT é o ciclo em que o limiar foi ultrapassado

para a análise de miARN, 20 ng de ARN total foi usada para a síntese de ADNc por o kit Taqman MicroRNA Transcrição reversa (Invitrogen).; Os níveis de expressão de miARN foram quantificados usando o ensaio TaqMan MicroRNA (Invitrogen) seguindo as instruções do fabricante. os níveis de expressão relativa de miARN foram normalizados para U6 snRNA e calculado como descrito previamente [25].

miARN Transfecção

miARN transfecções foram conduzidas em células PC3 utilizando lipofectomine 2000 (Invitrogen) seguindo o protocolo do fabricante . células PC3 foram cultivadas durante a noite em meio de crescimento normal, em seguida, transfectadas com miR-182 mímico (Sigma) ou o miR-182 inibidor ou controlo negativo em OPTI-MEM (Invitrogen) contendo 3% de FBS durante 18-28 h. A mímica miARN, inibidor de miR-182, e de controlo negativo (Invitrogen) foram cada um utilizados numa concentração final de 20 nM. As células transfectadas foram então cultivadas em meio de crescimento normal, com ou sem tratamento ATO para diferentes períodos de tempo.

Análise Estatística

Normalmente distribuídos dados paramétricos são apresentados como média ± SD, e foram analisados ​​por t de Student -teste ou one-way ANOVA;

post-hoc

análises foram realizadas com teste de comparação múltipla de Tukey. As análises estatísticas foram realizadas utilizando GraphPad Software (San Diego, CA) e Microsoft Office Excel. As diferenças entre as médias foram consideradas significativas para p . 0,05

Resultados

Efeitos diferenciais de atorvastatina em LNCaP e PC3 células cancerosas da próstata

Quando administrado em concentrações que variam de 0 -20 uM, ATO inibiu a proliferação de células em ambas as células LNCaP e PC3 em uma dose e modo dependente do tempo; a dose eficaz mais baixa em ambas as linhas de células foi de 2,5 uM (dados não apresentados). As curvas de crescimento representativos para LNCaP e PC3 células cultivadas na ausência e na presença de ATO (10 uM) são fornecidos na Fig. 1A. A uma concentração de 10 uM, induziu uma inibição ATO contínua, dependente do tempo, da proliferação de células LNCaP durante o período de exposição de 6 dias; nenhuma evidência da morte celular foi observada em células LNCaP expostas a OOp a 10 uM para este período. Em células PC3, a inibição da proliferação de células ATO foi visto no dia 2; morte celular substancial em células PC3 foi visto nos dias 4 e 6, tal como contagem de células nos grupos tratados com ATO nestes momentos foram abaixo do número de células inicialmente semeadas. Estes dados sugerem que (a) as células PC3 são mais sensíveis do que a ATO são células LNCaP, e (b) os mecanismos de acção da ATO nas duas linhas celulares de cancro da próstata pode ser diferente.

(A) LNCaP e células PC3 foram semeadas em placas de 6 cavidades (36000 células /poço) e incubadas durante a noite e, em seguida, tratada com DMSO (controlo) ou 10 uM para ATO 2, 4 e 6 dias. Os números de células são expressos como média ± DP, n = 3. (B) Microscopia de LNCaP e células PC3, após tratamento With10 uM ATO durante 2 e 4 dias. C: LNCaP e PC3 células foram tratadas com ATO 5 uM durante 24 e 48 h, os lisados ​​celulares foram recolhidos para análise de expressão LC3-II, utilizando Western blot. ATO expressão induzida LC3-II só em células PC3.

Os efeitos da ATO (10 uM) sobre a densidade celular e morfologia celular em células LNCaP e PC3, após dois e quatro dias de exposição, são mostrados na figura 1B. alterações morfológicas estiveram presentes em ambas as células LNCaP e PC3 expostos a ATO; mudanças de densidade celular foram consistentes com as alterações no número de células acima relatados. No processo de formação autophagosome, citosólica associada a microtúbulos cadeia leve da proteína 3 (LC3) é conjugado com f osf atidiletanolamina (PE) no seu terminal carboxilo [26], [27]. A LC3 conjugado (identificado como LC3-II) é então inserido na membrana da vesícula autophagic. LC3-II pode ser detectada por imunotransf erência ou imunocoloração, e é amplamente usado como um marcador bioquímico para autofagia celular [28], [29]. Usando LC3-II, como um biomarcador de autofagia, análises de Western blot demonstrou que a ATO autofagia induzida em células PC3, mas não em células LNCaP (Fig. 1C). Estes resultados estabelecem ligação a indução de autofagia pela ATO em células de cancro da próstata PC3 com a morte celular nessas células; nem autofagia nem a morte de células foram induzidas pela ATO em células LNCaP.

Efeitos da atorvastatina sobre a proliferação celular e LC3-II expressão em células PC3

Para confirmar a associação entre autofagia e morte celular no PC3 células de cancro da próstata expostos a ATO, que caracterizado pela primeira vez os efeitos de ATO na contagem de células em células PC3 parentais e vários sublinhas PC3 [22]. A exposição de células PC3 parentais a ATO (5 uM) inibiu a proliferação celular em 38% no dia 2 (p 0,01) e 85% (p 0,001) no dia 4 (Fig. 2A). Todas as sub-linhas (clone 19, 7, e 20) (Fig. 2B-D) foram sensíveis ao tratamento ATO, mas clone PC3 19 era mais sensível ao ATO entre os três clones testados: após dois e quatro dias de exposição, a ATO ( 5 uM) inibiu a proliferação de células do clone PC3 19 em 70% e 95%, respectivamente (p 0,001 para ambas as comparações; Fig. 2B); ao passo que outros dois clones (clone 7 e 20) responderam a ATO de uma forma semelhante como células parentais com alguma variabilidade. Além disso, observou-se a morte celular significativa em todas as linhas de células no dia 4. Portanto parental e o clone mais sensíveis foram seleccionados para posterior caracterização da expressão LC3-II. Em ambos os PC3 parentais e PC3-clone 19 de células, expressão induzida ATO LC3-II de um modo dependente do tempo (Figura 2E.); No entanto, nas células sensíveis PC3-clone 19, LC3-II demonstrou indução mais rápida e quantitativamente maior pela ATO. Estes dados sugerem que a ATO actividade induzida autofagia se correlaciona com a sensibilidade celular em resposta a ATO, e que autofagia pode estar envolvido na morte celular induzida pela ATO, em células PC3.

(A-D) PC3 parentais (A) e clone 19 PC3 (B), 7 (C) e 20 células (D) foram cultivadas em placas de 6 poços e tratadas com 5 uM ATO durante 2 ou 4 dias. Os números de células são expressos como média ± DP, n = 3 (C) PC3 parentais e PC3-clone de células 19 foram tratados com o lado ATO 5 uM a lado com o ensaio de proliferação (A B) durante 24 h, 48 h ou 72 h. lisados ​​celulares foram coletadas para análise western blot de expressão LC3-II.

Efeitos da atorvastatina sobre a expressão gênica em LNCaP e PC3 Cells (Estudos Microarray e análise Pathway)

analisa

Microarray foram realizada para determinar os efeitos de ATO sobre a expressão do gene e a expressão em células de miARN LNCaP e PC3; comparações lado a lado foram realizadas utilizando amostras de ARN total isolado a partir de células tratadas com a ATO (10 μ M), durante 24 h. ATO induziu alterações estatisticamente significativas na expressão de 1427 genes em células LNCaP e 3755 genes em células parentais PC3 (Fig. S1). KEGG vias análise dos 1427 genes diferencialmente expressos em células LNCaP 7 identificadas vias funcionais para os quais a expressão diferencial de genes componente foi estatisticamente significativa a

P

≤0.01 (Tabela S1). Algumas vias (

por exemplo, a biossíntese de colesterol, biossíntese de esteróides.) Eram previsíveis na base da actividade conhecida de ATO como um inibidor da HMG Co-A redutase; outros podem ser especificamente relacionada com a actividade anti-proliferativa em células de ATO LNCaP. Como seria de esperar, um número muito maior de vias funcionais alteradas (46 vias) foi identificado através de análise KEGG de genes diferencialmente expressos em células PC3 expostos a ATO (Tabela S2). Além de caminhos que se sobrepunham aos identificados em células LNCaP, ATO modulada várias vias com ligações claras com a proliferação celular e morte celular; estas vias funcionais incluídas a replicação do ADN, do ciclo celular, e a sinalização MAPK.

Microarray Estudos de atorvastatina e Mirna Expressão em Células LNCaP e PC3

ATO induzida a expressão diferencial de numerosas miARNs em células LNCaP e PC3 . Usando valores de corte de 1,5 para diferenças dobra-mudança na expressão e p 0,05 para a significância estatística, 131 miARNs foram diferencialmente expressos em células LNCaP expostas a ATO, e 111 miARNs foram diferencialmente expressos em células PC3 expostos a ATO (Fig S1.).

para identificar miARNs cuja expressão diferencial podem estar subjacentes ATO citotoxicidade em células PC3, uma mudança de corte de dobra ≥2.00 foi aplicada aos dados de PC3, seguido por remoção de miARNs cujas mudanças de direcção na expressão foram os mesmos em PC3 e LNCaP células. Esta estratégia identificou um total de 42 miRNAs que foram diferencialmente regulados pela ATO especificamente em células PC3 (Tabela S3).

Mir-182 é regulado para cima por Ato Em Pc3 Cells

Para confirmar a dados de matriz de miARN em células PC3, qRT-PCR (Taqman técnica) foi utilizada para confirmar a expressão diferencial de três miARNs (miR-555, o miR-654 e miR-182) identificados como sobre-regulada por ATO e três miARNs (miR- 494, miR-1255a e miR-550A), que foram sub-regulada pelo ATO. Estes miARNs específicas foram seleccionadas para estudo adicional com base em diferenças dobra-mudança na expressão observados em estudos de microarray. miR-182 (o qual foi regulado para cima por quatro vezes em células PC3 expostos a ATO) também foi seleccionado devido a sua conhecida relação ao stress celular [29].

ATO sobre-regulação de miR-182 em células PC3 foi confirmada por qRT-PCR (Fig. 3A); outros miARNs foram encontrados para ser expresso apenas em níveis muito baixos, e os níveis de expressão destes miARNs demonstraram variabilidade substancial entre as amostras. expressão de miR-182 foi aumentada em 56% (p 0,01) às 24 h e 66% (p 0,01) às 48 horas em células PC3 expostos a ATO (Fig. 3A). Em contraste, ATO regulada negativamente o miR-182 em células LNCaP de 24% (p 0,01) às 48 horas (Fig 3B.). Estes dados sugerem que o miR-182 pela ATO regulação em células de cancro da próstata é específico da célula, e que a sobre-regulação de miR-182 pode estar envolvido na acção ATO, em células PC3.

(A) As células foram PC3 expostos a 5? M ATO durante 24 h e 48 h. O ARN total foi isolado e submetido a análise de Taqman qRT-PCR utilizando conjuntos de iniciadores para miR-182. (B) As células LNCaP foram expostas a 5 ^ M ATO durante 48 h, seguido por análise de miR-182 de expressão. Os dados são resumidos a partir de 3 experiências independentes e expressos como média ± SD. ** P . 0,01

Mir-182 Upregulation por Ato em células PC3 é revertido pelo geranilgeraniol co-tratamento e é independente de P53 Expressão

Nós relatado anteriormente que miR-182 é um miARN responsivos ao estresse nas células epiteliais da mama [29]. Desde miR-182 é regulada pelo ATO e ATO pode causar estresse celular através da inibição da biossíntese de mevalonato [3], [9], a hipótese de que o miR-182 regulação positiva pela ATO pode ser devido ao estresse celular induzida pelo ATO. Se esta hipótese estiver correta, a remoção de estresse ATO reverteria miR-182-regulação. Para avaliar esta hipótese, o miR-182 foi quantificada a expressão em células PC3 tratadas com ATO ± vários metabolitos do mevalonato cuja síntese é inibida, como resultado da supressão da biossíntese de mevalonato ATO. Agentes estudados geranilgeraniol incluído (GGOH), farnesol (FOH), co-enzima Q10 (CoQ10), e esqualeno. Num estudo preliminar, única GGOH reverteu os efeitos sobre a expressão de ATO miR-182 em células PC3. Nesta base, uma série definitiva de experiências foi realizada utilizando GGOH e FOH. Consistente com os resultados do estudo preliminar, GGOH inverteu o efeito da ATO em miR-182 de expressão; FOH não teve nenhum efeito (Fig. 4A). Nós também avaliado o efeito da GGOH e FOH na inibição mediada por ATO da proliferação celular e na indução de autofagia em células PC3. Como mostrado na Fig. 4B, GGOH também inverteu o efeito da ATO sobre a proliferação celular e expressão LC3-II; FOH não teve nenhum efeito. Estes dados indicam claramente que a inibição da biossíntese de geranilgeraniol ATO-mediada, mas não o farnesol, resulta na regulação positiva de miR-182, a supressão da proliferação e indução de autofagia.

células PC3 (A) foram tratados com 5 jiM ATO durante 48 h, na presença e ausência de metabolitos incluindo geranilgeraniol (10 uM) e farnesol (10 uM), a expressão miR182 foi então detectado por qRT-PCR. (B) As células PC3 foram tratadas com ATO 5