Abstract

proteína caixa de Fork-cabeça A1 (FOXA1) é um “fator pioneiro” que é conhecido por se ligar ao receptor de andrógeno (AR) e regular a transcrição de genes específicos-AR. No entanto, a função exacta da FOXA1 em cancro da próstata (PC) permanece desconhecida. Neste estudo, que relatam que FOXA1 desempenha um papel crítico na proliferação de células PC. A expressão de FOXA1 foi maior no PC do que em tecidos normais da próstata (P = 0,0002), e, usando a análise imuno-histoquímica, descobrimos que FOXA1 estava localizada no núcleo. Os níveis de expressão FOXA1 foram significativamente correlacionados com ambos escores de Gleason (P = 0,016 e P = 0,031, respectivamente) PSA e. Além disso, FOXA1-regulação foi um fator significativo na falha de PSA (P = 0,011). Depleção de FOXA1 em uma linha de células de cancro da próstata (LNCaP) usando pequeno ARN interferente (siRNA) AR actividade significativamente inibido, levou à supressão-crescimento celular, e parada G0 /G1 induzida. O efeito anti-proliferativo de FOXA1 siARN foi mediada através da proteína de ligação ao factor de crescimento semelhante a insulina 3 (IGFBP-3). Um aumento no IGFBP-3, mediada pela depleção de FOXA1, fosforilação inibida de MAPK e AKT, e aumento da expressão da p21 reguladores do ciclo celular e p27. Também descobrimos que o efeito anti-proliferativo de depleção FOXA1 foi significativamente revertida pela depleção siARN simultânea da IGFBP-3. Estes resultados fornecem evidência fisiológica e molecular direta para um papel de FOXA1 no controle da proliferação celular através da regulação do IGFBP-3 expressão no PC

Citation:. Imamura Y, Sakamoto S, Endo T, Utsumi T, Fuse M , Suyama T, et al. (2012) FOXA1 promove a progressão do tumor no cancro da próstata através do Insulin-like growth factor Binding Protein 3 Pathway. PLoS ONE 7 (8): e42456. doi: 10.1371 /journal.pone.0042456

editor: Irina Agoulnik, Universidade Internacional da Flórida, Estados Unidos da América

Recebido: 27 Março, 2012; Aceito: 09 de julho de 2012; Publicação: 03 de agosto de 2012

Direitos de autor: © Imamura et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada por uma ajuda não reembolsável em-do Ministério da Educação, Ciência, Desporto e Cultura do Japão (n. 20390420, não. 22791469). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de próstata (PC), o câncer mais comum em homens, é uma segunda principal causa de morte relacionada ao câncer na maioria dos países ocidentais e está se tornando mais comum em países asiáticos também [1]. A hormona androgénio e o receptor de androgénio (AR) são essenciais para o crescimento normal, diferenciação e manutenção da glândula da próstata, e eles também desempenham um papel crítico no desenvolvimento de PC [2]. Assim, o tratamento de PC avançado envolve o bloqueio da produção de androgénios ou antagonizar AR e os seus genes-alvo [1]. No entanto, PC recaídas após a aquisição da resistência à castração. Um estudo recente mostrou que um baixo nível de androgénio intra-tumoral durante a terapia de ablação de androgénio continua a activar o AR, o que leva a uma maior progressão da PC em metástase [3]. Portanto, mesmo em um estágio avançado de PC, a regulação da atividade AR é importante para o tratamento de PC.

Com base numa análise microarray anterior, em que se comparou a expressão gênica de hiperplasia prostática benigna (BPH) e PC, identificou a proteína caixa de Fork-cabeça A1 (FOXA1) como um gene cuja expressão é significativamente regulada para cima no PC [4]. FOXA1 é um factor de transcrição que pertence à família de gene da caixa forkhead humano, e FOXA1 está envolvido na organogénese endodérmica, metabolismo e homeostase [5]. FOXA1 liga-se directamente ao AR e regula a transcrição de genes específicos da próstata [6]. FOXA1 também serve como um “fator pioneiro” para a AR em locais de regulação da transcrição [7], [8]. Assim, a ligação de FOXA1 a histona modificada associada com cromatina activo facilita o recrutamento subsequente dos receptores nucleares e de activação da transcrição [7], [8]. Diversas linhas de evidência ligaram FOXA1 com o desenvolvimento da próstata. expressão epitelial FOXA1 tem sido observada em todas as fases de desenvolvimento e a diferenciação da próstata do rato [6], [9]. O mouse FOXA1-defecient demonstraram perda de morfogênese da próstata e diferenciação [9], [10]. FOXA1 também contribui para a sinalização de estrogénio no cancro da mama e tem sido associado com o subtipo luminal e bom prognóstico [11], [12]. O aumento da expressão FOXA1 também tem sido observada em cólon, pulmão, tiróide, cancro do esófago e do cancro da próstata [13] – [15].

Embora FOXA1 associado com o desenvolvimento da próstata e regulação de androgénio, o mecanismo preciso para contribuir como FOXA1 progressão PC, especialmente regulação dos genes-alvo dependente de FOXA1 em PC permanecem relativamente não identificado.

o presente estudo investigou o papel de FOXA1 na progressão PC. Identificamos insulin-like growth factor proteína 3 (IGFBP-3) de ligação como um novo alvo de FOXA1 para a regulação da proliferação celular em células PC.

Resultados

A expressão das FOXA1 na próstata Cancer tecidos e sua correlação com fatores clínicos

Nós investigamos a expressão da proteína de FOXA1 no PC por meio de análise imuno-histoquímica (IHQ) de espécimes de PC. IHC resultados representativos de expressão da proteína em FOXA1 normal adjacente ao tumor (NAT) e em tecidos de PC são mostrados na Figura 1A e B. FOXA1 imunorreactividade positiva foi detectado no núcleo e na parte do citoplasma. Um forte imunorreacção FOXA1 foi detectado nos núcleos de células do cancro da lesão, enquanto que as células na NAT apresentaram imunocoloração fraco principalmente no citoplasma. As pontuações de coloração IHC FOXA1 de NAT e de lesões PC variou 30,2-123,0 (mediana, 73,3) e 20,4-260,1 (mediana, 125,1), respectivamente. As pontuações de coloração IHC FOXA1 de lesões PC foram significativamente maiores do que os de NAT (Figura 1C, P = 0,0002). Por pontuação IHC, 62% das amostras foram positivas para PC FOXA1, mantendo-se 38% das amostras foram negativas. As correlações entre as características clinicopatológicas de pacientes com PC e o estado da expressão da proteína FOXA1 utilizando o sistema de pontuação IHC são mostrados na Tabela 1. Estes dados mostraram que os PCs FOXA1-positivos foram correlacionadas com o valor de PSA (P = 0,016), o Gleason pontuação de PC (p = 0,031) e a expressão de AR (P = 0,002) (Tabela 1). PCs que foram positivos para ambos FOXA1 e AR tinham significativamente mais elevados escores de Gleason do que PCs que eram ambos FOXA1- e AR-negativo (P = 0,027) (Tabela 2).

A expressão da proteína de FOXA1 no representante normal adjacente para tecido tumoral (NAT) (a) e tecidos de PC (B), tal como analisado utilizando IHC, é mostrada. NAT exibido expressão baixa proteína FOXA1. coloração FOXA1-positiva foi observada em casos de PC. FOXA1 imunocoloração positiva foi detectado no núcleo. ampliação original, × 400. (C) Quantificação da coloração FOXA1 de NAT e tecidos de PC. As pontuações FOXA1 IHC foram calculados como se segue: Pontuação IHC = 1 × (número de células fracamente coradas no campo) + 2 x (Número de células moderadamente coradas no campo) + 3 × (número de células intensamente coradas no campo) . As pontuações FOXA1 IHC para tecidos da próstata normais e para PCs variaram 30,2-123,0 (mediana, 73,3) e de 20,4 para 260,1 (mediana, 125,1), respectivamente. -Regulada expressão FOXA1 (D) foi significativamente associada com o fracasso PSA (P = 0,011), mas up-regulada expressão AR (E) não era (P = 0,4457). estatísticas de log-rank foram usadas para testar a diferença nos tempos de sobrevivência entre os grupos. FOXA1 (+), FOXA1-regulada; FOXA1 (-), FOXA1 regulada para baixo. AR (+), AR-regulada; AR (-), AR-regulada. ** Indica uma diferença estatística de P . 0,01

A análise da sobrevida pelo método de Kaplan-Meier mostrou que FOXA1-regulação foi um fator significativo na falha de PSA (Figura 1D ;-log rank test, P = 0,011) em comparação com AR-regulação (Figura 1E; teste log-rank, P = 0,4457). As taxas de sobrevivência de falha PSA de casos com up-regulada e FOXA1 regulada foram 50,7 e 87,7%, respectivamente. As taxas de sobrevivência de falha de PSA em casos com up-regulamentada e regulada AR foram 58,5 e 73,8%, respectivamente.

Avaliação de FOXA1 Protein Expression em linhas celulares derivadas de PC

A seguir, investigou ARNm FOXA1 e a expressão da proteína no PC por análise quantitativa reacção em cadeia com transcrição reversa-polimerase (qRT-PCR) e Western blotting, respectivamente, de quatro linhas de células derivadas de PC, incluindo a linha celular independente de androgénio, de células sensíveis androgénio (PC-3 e DU145) A linha (LNCaP), linha celular insensível androgénio (C4-2) estabelecido a partir de acolhimento castrados de LNCaP e linha de células de próstata não-tumorigénico (RWPE-1) [16] – [19] (Figura 2A). O peso molecular de FOXA1 por transferência de Western foi de 49 kDa. Ambos FOXA1 ARNm e a expressão de proteína foram significativamente mais elevados nas células LNCaP sensíveis de androgénios e de células C4-2 do que nas outras linhas de células.

(A) A expressão de ARNm e a expressão da proteína de FOXA1 em quatro PC- linhas celulares derivadas (PC-3, DU-145, LNCaP, C4-2) e na linha de células de próstata não-tumorigénico (RWPE-1) foram analisados ​​por meio de qRT-PCR e Western blotting, respectivamente. (B) As células LNCaP foram transfectadas com um ARNsi de controlo negativo (Nega) ou com um dos três diferentes ARNsi FOXA1 siFOXA1 (# 1-3). Após 48 horas da transfecção, o ARN foi extraído e FOXA1 ARNm foi analisada utilizando análise de qRT-PCR. a expressão de ARNm FOXA1 é expressa em relação à expressão de ARNm de GAPDH na mesma célula. Os resultados apresentados são as médias ± S.E.M. de três experiências independentes. As proteínas foram extraídas de 72 h após a transfecção e FOXA1 proteína e GAPDH foi examinado por análises Western blot. células LNCaP (C, D) foram transfectadas com o pGL3-PSAP 5,8 luciferase do plasmídeo repórter e com um dos três siRNAs FOXA1 diferentes. (# 1-3) e foram, em seguida, cultivadas em meio RPMI Fenol-1640 isento de vermelho de contendo 5% de CS-FBS. (C) Após 72 horas da transfecção, as actividades da luciferase foram medidas usando o sistema de ensaio de repórter de luciferase dupla. actividades de luciferase são expressos em relação ao controlo, o que foi atribuído um valor de 1. As proteínas foram extraídas de 72 h após a transfecção e a expressão de AR e de GAPDH foi examinada por análise de Western blot. (D) As células transfectadas foram incubadas com as concentrações indicadas de di-hidrotestosterona, durante 72 h, e as actividades da luciferase foram medidas como em (C). (E, F) células não transfectadas LNCaP foram tratadas com as concentrações indicadas de di-hidrotestosterona (E) ou bicalutamida (F) durante 48 horas e a expressão de ARNm FOXA1 foi então analisado utilizando qRT-PCR. a expressão de ARNm FOXA1 é expressa em relação à expressão de ARNm de GAPDH na mesma célula. Os valores mostrados são as médias ± DP de pelo menos 3 experiências independentes, cada uma realizada em triplicado. * E ** indicam diferença estatística de P 0,05 e P . 0,01, respectivamente

Para obter células em que a expressão FOXA1 foi transitoriamente derrubado, nós transfectadas células LNCaP com um dos três diferentes siRNAs FOXA1 (siFOXA1 # 1-3) plasmídeos ou com um controlo negativo siRNA (nega) plasmídeo. Em seguida, analisamos FOXA1 ARNm e a expressão da proteína nestas células siFOXA1 transfectados utilizando qRT-PCR e análises de Western blot, respectivamente. SiFOXA1 células transfectadas mostra a redução do nível de ARNm FOXA1 por quase 90% em comparação com células transfectadas que em-Nega (Nega). Os níveis de proteína em células FOXA1 siFOXA1 transfectadas foram também fortemente diminuiu em comparação com células transfectadas-nega (Figura 2B).

O Efeito da FOXA1 no receptor de andrógeno atividade eo efeito da AR Activation em FOXA1 Expressão

Para determinar o efeito do knockdown FOXA1 sobre a actividade de AR, que as células transfectadas LNCaP transfectadas com siFOXA1 com um plasmídeo de expressão de luciferase conduzido pelo promotor de antigénio específico da próstata (PSA), pGL3PSAp-5.8. Embora não houve diferença na expressão de proteína de AR nas células siFOXA1-transfectadas ou em células transf ectadas com Nega, as células transf ectadas mostrou-siFOXA1 redução de quase 80% da actividade do promotor PSA comparação com a das células transfectadas com Nega (Figura 2C). Quando as células de controlo de LNCaP que só foram transfectadas com pGL3PSAp-5,8 foram tratadas com o ligando de AR di-hidrotestosterona (DHT), a actividade do promotor PSA foi aumentada de uma maneira dependente da dose. No entanto, a co-transf ecção destas células com siFOXA1 reduziu significativamente a actividade do promotor PSA após o tratamento com várias concentrações de DHT (Figura 2D). A olhar para a influência de FOXA1depletion na expressão PSA endógeno, como atos FOXA1 para remodelar cromatina, analisamos a expressão do mRNA PSA em células siFOXA1-transfectadas utilizando qRT-PCR. A Figura mostra que a depleção de S1A FOXA1 mediada redução significativa do nível de ARNm de PSA em relação ao que em células transfectadas-nega.

Para determinar se a expressão do mRNA FOXA1 é mediada pela actividade de AR, testou-se o efeito do tratamento de células com LNCaP DHT e ou com o antagonista de AR em bicalutamida expressão de ARNm FOXA1. QRT-PCR A análise mostrou que não houve diferença na expressão de ARNm de FOXA1 em células LNCaP sensíveis-andrógenos após crescimento em meio contendo DHT ou em meio contendo bicalutamida (Figura 2E e F). Estes resultados indicaram que FOXA1 medeia a activação de AR, no entanto, a expressão de si FOXA1 não é regulado por andrógeno.

FOXA1 regula a proliferação celular em células PC

Para investigar o efeito do knockdown FOXA1 no celular proliferação, o crescimento celular de células LNCaP siFOXA1-transfectadas foi monitorizada ao longo de 4 dias. As células siFOXA1-transfectadas mostraram uma diminuição significativa no crescimento celular em comparação com células transfectadas com Nega (Figura 3A). Por outro lado, as células que sobre-expressam FOXA1 aumentou significativamente o crescimento celular em comparação com células transfectadas com Nega (Figura S1C). Para investigar efeitos de FOXA1 na progressão do ciclo celular, analisou-se as fases do ciclo celular de células siFOXA1-transfectadas utilizando análise de citometria de fluxo. A percentagem de células siFOXA1-transfectadas na fase G0 /G1 mais elevada do que a de células transfectadas com Nega (Figura 3B), sugerindo que a sub-regulação de FOXA1 inibiu a proliferação celular pela indução da paragem G0 /G1.

(a) foram transfectadas com um ARNsi de controlo negativo (Nega) ou com um dos três diferentes ARNsi FOXA1 (# 1- # 3), e foram, em seguida, re-semeadas numa placa de cultura de 24 poços. A proliferação celular foi então testada ao longo de 4 dias através da contagem do número de células para cada uma das condições de transfecção, conforme indicado. (B) a fase do ciclo celular das células foram analisados ​​utilizando coloração com iodeto de propidio e análise de FACS 24 horas após a transfecção siRNA e a percentagem de células em cada população transfectada que foi, em cada fase do ciclo foi calculada. células LNCaP (C) foram transfectadas com um ARNsi de controlo negativo (Nega) ou com um dos três diferentes ARNsi FOXA1 siFOXA1 (# 1-3). Depois de 48 horas de transfecção de IGFBP-3 a expressão de mRNA foi analisada por qRT-PCR. A IGFBP-3 a expressão do mRNA é expresso em relação à expressão de ARNm de GAPDH na mesma célula. (D) As células LNCaP foram transfectadas com um ARNsi de controlo negativo (Nega) ou com um dos três diferentes ARNsi FOXA1 siFOXA1 (# 1-3). Após 72 h de transfeco, a concentração de IGFBP-3 do meio foi analisada por ELISA. (E) As proteínas foram extraídas de 72 h após a transfecção e a expressão de IGFBP3, do receptor de insulina sinalização proteínas relacionadas (quantidade total de MAPK, fosfo-MAPK, quantidade total de Akt e fosfo-Akt), de G0 /G1 arrest- proteínas reguladoras do ciclo celular relacionada (p21Cip1, p27kip1) e de GAPDH foi examinada por análise de western blot. pesos moleculares de proteínas são indicadas pelo lado direito do painel. Estes resultados são as médias ± S.E.M. de três experiências independentes. ** Indica uma diferença estatística de P . 0,01

O esgotamento dos FOXA1 Regula IGFBP-3 e IGF sinalização

Para obter uma visão sobre genes que são regulados positivamente pela depleção FOXA1 de células PC, foi realizada análise de expressão de genes de microarranjos de células esgotadas de FOXA1 (Tabela 3 e 4). Foram identificados 421 genes que foram mais fortemente expressos em células empobrecido-FOXA1 do que nos transfectantes de controlo negativo. Clustering dos genes supra-regulados em categorias funcionais indicaram que a proporção mais elevada de genes regulados positivamente estavam relacionados com a proliferação de células, seguido de resposta da formação da ferida, os processos do sistema muscular, respostas de defesa, respostas inflamatórias, a regulação negativa da proliferação celular, resposta a hipóxia e a maturação de células (Tabela 3). Os genes regulados que estão relacionados com regulação negativa da proliferação de células são listadas na Tabela 4. destes genes regulados positivamente, estudou-se ainda mais insulina-like growth factor de ligação a proteína 3 (IGFBP-3), uma vez que este gene é um bem gene do tumor-supressor -established no PC [20] – [23]

Para confirmar o aumento da regulação do IGFBP-3 em células LNCaP por esgotamento FOXA1 que foi indicado pelo microarray. dados, analisámos ARNm de IGFBP-3 e a expressão da proteína em células LNCaP transfectadas com plasmídeos siFOXA1 ou com o plasmídeo de controlo negativo siRNA, utilizando qRT-PCR e análises de Western blot, respectivamente. A Figura 3C mostra que a IGFBP-3 a expressão de ARNm em células siFOXA1-transfectadas foi significativamente mais elevado do que em células transfectadas-nega. Os níveis de proteína IGFBP-3 em células siFOXA1-transfectadas foram também fortemente aumentada em comparação com o nível em células transfectadas-nega (Figura 3E). Além disso, para avaliar alterações nos níveis de IGFBP-3 secretada, foram realizados testes ELISA. A Figura 3D mostra que a concentração de IGFBP-3 no meio de células siFOXA1-transfectadas foi também fortemente aumentada (mais de 30 vezes) em comparação com a das células transfectadas-nega. Uma vez que a IGFBP-3 modula a sinalização do IGF-1, o próximo investigado se a regulação FOXA1 de expressão de IGFBP-3 foi associado com a modulação do nível de expressão ou activação estado de IGF-1 a jusante sinais nestas células (Figura 3E). A análise por Western blot indicou marcada sobre-regulação de IGFBP-3, a sub-regulação da fosforilação da MAPK e AKT, e a sobre-regulação da expressão de proteínas dos inibidores de cinase dependente de ciclina (p21Cip1, p27kip1) em células siFOXA1-transfectadas em comparação com células transfectadas com Nega (Figura 3E). Além disso, a depleção FOXA1 bloqueou significativamente a activação de AKT em resposta a IGF-1 no tratamento de LNCaP (Figura S1E). Estes resultados mostraram que a regulação FOXA1 de IGFBP-3 é acompanhada por regulamentação do IGF-1 sinais a jusante.

A fim de determinar a importância de IGFBP-3 para a regulação da proliferação FOXA1 PC, comparamos o crescimento de siFOXA1 células LNCaP -transfected e que as células de siIGFBP-3-transfectadas. A IGFBP-3 foi transitoriamente derrubado por transfecção de células de LNCaP com o siRNA (-3 siIGFBP) plasmídeo e de IGFBP-3 ARNm e a expressão da proteína nas células siIGFBP-3-transfectadas foi avaliada por meio de qRT-PCR e análise por transferência de IGFBP-3 ocidental , respectivamente. A Figura 4A mostra que a IGFBP-3 ARNm e a expressão da proteína nas células siIGFBP-3-transfectadas foi significativamente menor do que nas células transfectadas-nega. Embora as células-siFOXA1 transfectadas mostraram uma diminuição significativa no crescimento celular em comparação com células transfectadas com Nega (Figura 3A e 4B), o efeito anti-proliferativo de siFOXA1 foi revertida pela dupla transfecção de siFOXA1 e siIGFBP-3 (Figura 4B). Este resultado indicou que FOXA1 regula a proliferação celular de um modo dependente da IGFBP-3-.

células LNCaP (A) foram transfectadas com um ARNsi de controlo negativo (Nega) ou com uma IGFBP-3 siRNA (siIGFBP-3) e, 48 h mais tarde, a IGFBP-3 ARNm e os níveis de proteína foram analisados ​​por meio de qRT-PCR e análise de Western blot. A IGFBP-3 a expressão do mRNA é expresso em relação à expressão de ARNm de GAPDH na mesma célula. (B) As células LNCaP foram transfectadas com um ARNsi de controlo negativo (Nega) ou com um dos três siRNAs FOXA1 (siFOXA1 # 1- # 3) e /ou a uma IGFBP-3 siRNA (siIGFBP-3), e foram re-semeadas em um 24 placa de cultura -bem. A proliferação celular foi medida ao longo de 4 dias e o número de células para cada população transfectada é indicado. (C, D), as células LNCaP foram transfectadas com um controlo negativo de siRNA (Nega) ou com um siRNA AR (Si AR) e /ou um ARNsi FOXA1 (Si FOXA1 # 1) e, 48 h após a transfecção, AR ARNm e proteína ( C) ou os níveis de ARNm de IGFBP-3 (D) foram analisados ​​por meio de qRT-PCR e /ou análise de transferência de western. Os níveis de ARNm são expressas em relação à expressão de ARNm de GAPDH na mesma célula. Os resultados apresentados são as médias ± S.E.M. de três experiências independentes. ** Indicam diferença estatística de P . 0,01

Desde a ativação do AR foi relatado para regular negativamente a IGFBP-3 expressão [24], estudamos o efeito do AR em FOXA1 mediada regulação da utilizando células transfectadas Siar-IGFBP-3 (Figura 4C e 4D). Esgotamento de AR fez aumentar a IGFBP-3 a expressão do mRNA (2,8 vezes). No entanto, o aumento no IGFBP-3 expressão observada em células transfectadas-siFOXA1 era muito superior (16,4 vezes) do que nas células Siar-transfectadas. Além disso, a depleção simultânea de AR e FOXA1 resultou num novo aumento no IGFBP-3 expressão (24,0 vezes) em comparação com a depleção de FOXA1 sozinho, sugerindo que AR cooperativamente FOXA1 e regular a expressão de IGFBP-3 (Figura 4D).

papel do FOXA1 sobre Modelos de castração resistentes do cancro da próstata (CRPC)

Foi avaliado o papel da FOXA1 sobre o câncer de próstata andrógeno-independente utilizando C4-2 células, estabelecidas a partir de acolhimento castrados de células LNCaP. Depleção de FOXA1 crescimento celular de células significativamente inibida C4-2, mesmo no ambiente de baixo-androgénio (5% de carvão filtrada FCS) comparar com células transfectadas com Nega (Figura 5A). Overexpresssion de FOXA1 em células C4-2 promovida de forma significativa o crescimento de células (Figura S1D). Quando as células de controlo C4-2 foram tratados com baixas doses de DHT (1-100 pM), a atividade do promotor PSA foi regulada a uma concentração DHT de 100 pM. No entanto, a transfecção de FOXA1 ARNip bloqueado a sobre-regulação da actividade do promotor de PSA que ocorreu em resposta ao tratamento DHT a 100 pM em células C4-2 (Figura 5B). Da mesma forma, a depleção de FOXA1 inibiu significativamente a expressão de ARNm de PSA em qRT-PCR (Figura S1B). Foram também analisadas a IGFBP-3 a expressão de ARNm em células transfectadas com plasmídeos C4-2 siFOXA1 ou com o controlo negativo, utilizando qRT-PCR. A Figura 5C mostra que a IGFBP-3 a expressão de ARNm em células siFOXA1-transfectadas foi significativamente mais elevado do que em células transfectadas-nega. A Figura 5D mostra que a concentração de IGFBP-3 no meio de células siFOXA1-transfectadas foram também fortemente aumentada (mais de 40 vezes) em comparação com o nível em células transfectadas-nega. siFOXA1 inibiu significativamente a fosforilação de Akt após estimulação com IGF-1 em células C4-2 semelhante ao de células LNCaP, indicando regulação negativa de IGF-1 após a depleção de sinalização FOXA1 (Figura S1F).

(A) C4 -2 células foram transfectadas com um ARNsi de controlo negativo (Nega) ou com um dos três siRNAs FOXA1 (# 1- # 3) e foram, em seguida, re-semeadas numa placa de cultura de 24 poços com fenol meio RPMI-1640 isento de vermelho de 5% contendo CS-FBS. A proliferação celular foi então medido ao longo de 4 dias e é apresentada como o número de células para cada população transfectada. células (B) C4-2 foram transfectadas com o pGL3-PSAP repórter da luciferase de 5,8 e com um siRNA FOXA1 (# 1) e foram cultivadas em meio de fenol-vermelho livre de RPMI-1640 contendo 5% de CS-FBS com as concentrações indicadas de dihidrotestosterona (1-100 pM). Após 72 horas da transfecção, a actividade de luciferase foi medida utilizando o sistema de ensaio de repórter de luciferase dupla. (C) células de C4-2 foram transfectadas com um ARNsi de controlo negativo (Nega) ou com um dos três diferentes ARNsi FOXA1 siFOXA1 (# 1-3). Depois de 48 horas de transfecção de IGFBP-3 a expressão de mRNA foi analisada por qRT-PCR. A IGFBP-3 a expressão do mRNA é expresso em relação à expressão de ARNm de GAPDH na mesma célula. (D) As células foram transfectadas C4-2 com um siRNA controlo negativo (Nega) ou com um dos três diferentes ARNsi FOXA1 siFOXA1 (# 1-3). Após 72 h de transfeco, a concentração de IGFBP-3 do meio foi analisada por ELISA. Os resultados apresentados são as médias ± S.E.M. de três experiências independentes. * E ** indicam diferença estatística de P 0,05 e P . 0,01, respectivamente

Discussão

O presente estudo investigou o papel de FOXA1 na progressão PC. Identificou-se a supressor de tumor IGFBP-3 como um novo alvo de FOXA1, e mostraram que FOXA1 segmentação de IGFBP-3 desempenha um papel essencial na regulação da proliferação das células PC.

IGFBP-3 tem sido conhecida por funcionar como um supressor de tumor ou um inibidor do ciclo celular em células PC [21], [24]. O aumento da expressão de IGFBP-3 sobre a depleção FOXA1 inibiu a fosforilação da MAPK e de Akt e a paragem do ciclo celular mediada através de um aumento da expressão da p21 reguladores do ciclo celular e p27 em células PC. FOXA1 foi recentemente relatado para regular o ciclo celular e a proliferação celular em células LNCaP [15]. Os nossos dados indicam que a IGFBP-3 pode ser um regulador principal da proliferação celular dependente de FOXA1 em células LNCaP. Com base em nossos resultados, não só a AR, mas também IGFBP-3 pode ser um fator chave na FOXA1 mediada sinalização no PC.

FOXA1 é um fator de transcrição que modula a função dos receptores de hormônios esteróides. Na próstata, FOXA1 interage com o AR e controla androgénio induz a activação de genes específicos da próstata [6]. Recentemente, AR e de ligação FOXA1 sítios adjacentes têm sido são encontrados em vários promotores em células prostáticas [7], [25]. Semelhante à função de AR, FOXA1 expressão é necessária para o desenvolvimento normal, bem como para a regulação de androgénio PC [26]. A expressão aumentada de FOXA1 tem sido observada em todas as fases de desenvolvimento da próstata num modelo de rato [27]. Descobrimos que FOXA1 foi sobre-expresso nos núcleos de células PC, e que esta sobre-expressão foi associada com o aumento de PSA, Gleason Pontuações e expressão do AR. Além disso, a sobre-expressão de FOXA1 era um factor importante na insuficiência PSA. Aqueles resultado são consistentes com o relatório anterior, indicando que a intensidade da coloração FOXA1 foi significativamente mais fraco no adjacente não-cancerosas do que o tecido canceroso [28] e que a forte coloração FOXA1 associado com mau prognóstico, mais elevados estágios PT e aumento Gleason Grau [15], [28 ]. Um elevado nível de FOXA1 foi anteriormente encontrada em 89% de PC metastático e a expressão de FOXA1 foi positivamente correlacionada com o tamanho do tumor, invasão extraprostática, AR e nó de linfa invasão [29]. FOXA1 contribui para o crescimento dependente de androgénios dos PC [30]. FOXA1 também desempenha um papel essencial na expressão de conjugação de ubiquitina-enzima E2C (UBE2C), um gene que inactiva o ponto de controlo M-fase, e UBE2C é sobre-expresso em linhas celulares PC independente de androgénios e casos clínicos [31]. estudos de associação do genoma indicou a presença de um único polimorfismo de nucleótidos (rs119986220) no local de ligação FOXA1 8q24 dentro de alelos que está associada a risco de PC [25]. As provas combinadas suporta a conexão entre FOXA1 e progressão do tumor em PC.

Através de análise de expressão gênica, identificamos IGFBP-3 como um alvo a jusante de FOXA1. A IGFBP-3 é um factor de crescimento semelhante a insulina proteína cuja função principal é associado com IGF entrega e disponibilidade [32] de ligação. A IGFBP-3 tem uma afinidade maior para o IGF-1 do que o receptor de IGF-1 e bloqueia o IGF-1 via mediada. A IGFBP-3 pode, por conseguinte, reduzir a biodisponibilidade de IGF-1 e IGF-1 inibe a interacção com o receptor de IGF-1, funcionando, assim, como um supressor de tumores [21], [24]. Uma função independente de IGF-IGFBP-3 foi também recentemente identificadas. A IGFBP-3 liga-se ao receptor de tipo V-factor de crescimento transformante β e, assim, inibe o crescimento celular independente dos seus efeitos sobre o IGF [20], [33]. A indução de apoptose através da interacção sinérgica de IGFBP-3 com um receptor nuclear, tais como o receptor do retinóide X (RXR) -alfa também tem sido observada em células PC [24], [34]. A nossa sequência também indicaram que o aumento da expressão de IGFBP-3 sobre a depleção de FOXA1 proliferação PC significativamente inibida em células LNCaP sensíveis de androgénios, provavelmente por meio da via de sinalização de IGF-1. O aumento de IGFBP-3 sobre a depleção FOXA1 inibiu a fosforilação de sinalização mediadores na via de sinalização de IGF-1, incluindo Akt e MAPK, e a paragem do ciclo celular mediada por p21 e p27 em células PC. Os últimos resultados são consistentes com um relatório anterior que FOXA1 foi regulado para cima em lesão de cancro da tiróide e que a depleção de FOXA1 induziu a paragem do ciclo celular e uma redução na proliferação celular através de um mecanismo dependente de p27 [14].

Aquisição de resistência andrógeno no PC, o que é chamado de resistência à castração, é um grande problema que limita a qualidade de vida do paciente, bem como a expectativa de vida. Embora tenha sido proposto um certo número de mecanismos para explicar o desenvolvimento de PC resistente à castração (CRPC), a principal via de esta resistência ainda parece envolver a AR, mesmo durante a terapia anti-androgénio. A amplificação da AR, a mutação da AR, a sobre-expressão de coativadores Ar ou desregulação de factores de crescimento /citocinas podem ocorrer em todos CRPC e induzir uma alteração na resposta ao AR antagonistas. Outro mecanismo de CRPC é através da fuga da apoptose devido à perda do gene do tumor PTEN-supressiva e a supressão do gene anti-apoptótico de BCL-2 [35]. Uma outra causa conhecida da CRPC é que a AR pode ser activado em células PC humanos na ausência de androgénios por IL-6 [36], [37]. Existência de tantas vias complexas associadas à regulação da ativação do AR torna difícil de controlar o crescimento da CRPC. Com base em nossos dados, a segmentação de FOXA1 pode fornecer uma abordagem prática para a infra-regulação da atividade AR no CRPC. Depleção de FOXA1 significativamente regulada negativamente a activação dependente do ligando de AR (até 80%) em células LNCaP e células C4-2. Além disso, a depleção de FOXA1 sobre-regulada de IGFBP-3 e inibiu a expressão de IGF-1 de sinalização, que é a principal via para a activação independente do ligando de AR [38]. No entanto, uma outra linha de evidência indicou duplo papel de FOXA1. Embora FOXA1 serve como um fator pioneiro promover AR e interação cromatina, ele também cria complexos corepressor inibindo AR e cromatina vinculativo. Assim, os resultados de depleção FOXA1 na aparência de um grande número de novas ligações que BRAs para androgénio regulação de genes próximos [28], [39]. Desde FOXA1 regulação mediada por AR não é totalmente caracterizada, uma análise mais aprofundada irá revelar o significado terapêutico de FOXA1 no CRPC.

Como próximo passo, na determinação da função FOXA1, estamos atualmente estudando os mecanismos precisos pelos quais FOXA1 regula a expressão de IGFBP-3. Para evitar a ligação não-específica, foi realizado um péptido de bloqueio imunizantes experimento. 2+, moderada; de três experiências independentes.