Abstract

invasão celular Câncer é um dos principais componentes de metástases e é responsável por grande difusão celular para dentro e grande destruição de tecidos. As células apresentam modos de invasão complexos, incluindo uma variedade de comportamentos coletivos. Este fenómeno resulta em heterogeneidade estrutural da matriz extracelular (ECM) em tecidos. Aqui, nós investigamos sistematicamente a heterogeneidade ambiental facilitar a invasão de células tumorais através de uma combinação de

in vitro

experimentos de migração de células e simulações de computador. Especificamente, nós construímos um microambiente ECM em um biochip e microfabricado com sucesso criou uma interface matrigel tridimensional (3D) em forma de funil dentro. A microscopia electrónica de varrimento demonstrou que a interface foi aos defeitos interiores da orientação molecular anisotrópica nano-escala e as variações de densidade estruturais localizadas na matrigel. Nossos resultados, em particular a correlação do padrão de migração coletiva com as características geométricas da interface em forma de funil, indicam que este

in vitro

estrutura ECM heterogêneo orienta fortemente e promove a invasão celular agressiva no espaço matrigel rígida. Um modelo de autômato celular foi proposta com base em nossas observações experimentais e análise quantitativa associada indicou que a invasão da célula foi iniciado e controlado por vários mecanismos, incluindo a heterogeneidade microambiente, homotype célula-célula de longo alcance e migração celular direccional orientada para o gradiente. Nosso trabalho mostra a viabilidade da construção de um

in vitro

3D ECM microambiente complexo e heterogêneo que imita o

in vivo

ambiente. Além disso, nossos resultados indicam que a ECM heterogeneidade é essencial para controlar os comportamentos invasivos celulares coletiva e, portanto, determinar a eficiência metástase

Citation:. Zhu J, Liang L, Jiao Y, Liu L, em nome de os EUA-China Física ciências da Oncologia Alliance (2015) Invasion aumentada de células câncer metastático através de Matriz extracelular interface. PLoS ONE 10 (2): e0118058. doi: 10.1371 /journal.pone.0118058

Editor do Academic: Jung Weon Lee, da Universidade Nacional de Seul, Coreia, República da

Recebido: 12 de outubro de 2014; Aceito: 03 de janeiro de 2015; Publicação: 23 de fevereiro de 2015

Este é um artigo de acesso aberto, livre de todos os direitos autorais e pode ser livremente reproduzido, distribuído, transmitido, modificado, construído em cima, ou de outra maneira usado por qualquer pessoa para qualquer finalidade lícita. O trabalho está disponível sob a licença Creative Commons CC0 domínio público dedicação

Data Availability:. Todos os dados relevantes estão dentro do papel

Financiamento: Os autores reconhecem o apoio do Programa Nacional de Pesquisa Key básico da China (Grant 2013CB837200) e da National Science Foundation da China (Grant 11.474.345). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a fase mais risco de vida de metástase ocorre quando as células cancerígenas se espalham a partir do tecido de origem e começar a crescer em outros órgãos. No primeiro passo crítico, chamado invasão, as células metastáticas expressar metaloproteinases nas suas superfícies, promove a digestão de membrana basal e movem para dentro da matriz extracelular circundante (ECM) [1-2]. ECM desempenha um papel importante no processo de invasão de células de cancro, na qualidade de um andaime para o movimento físico das células e também como o meio de comunicação de sinal de células [3]. Nos tecidos, as células cancerosas expressar metaloproteinases de matriz (MMP) que degradam ECM na vanguarda, gerando caminhos locais e ajudando as células migram para invadir livremente [4-6].

In vivo

, padrões histológicos de células invasiva variar de invasão de célula única para a invasão da célula coletiva, mesmo dentro do mesmo tecido. Padrões variam de acini celular, cordões, glândulas, lençóis, clusters e outros [7-8]. Importante, diferentes padrões levar a diferentes eficiências de invasão celular coletivo e determinar a gravidade geral da doença e sobrevida do paciente. Portanto, é importante compreender a natureza dos padrões invasivos e os fatores que os afetam.

Os comportamentos de células invasoras coletivas e padrões são muito influenciados pela heterogeneidade de ECM micro-estruturas. Ao nível molecular, a concentração de proteínas da MEC e componentes da matriz extracelular determinar a estrutura de sub-micron ECM e propriedades mecânicas [9-14]. Na escala de tecido, a heterogeneidade estrutural e anisotropia de tecidos nativos são causadas principalmente pelos complexos microambientes ECM localizadas e seu tamanho, densidade e orientação. Estas características físicas, bem como os ambientes químicos específicos que consiste em oxigénio, nutrição, e factores de crescimento, variam grandemente entre os tecidos e as interfaces de tecido [15]. Todas estas variações ECM influenciar polaridade celular e células colectiva grupo comportamentos individuais durante a invasão e levar a vários padrões de invasão de células que, em última análise formam a paisagem ECM e determinar a velocidade da metástase.

Devido à complexidade da heterogeneidade ECM

in vivo

, sua influência sobre o comportamento das células coletiva tem sido descrito, mas não quantificada [7].

In vitro

, estudos têm encontrado pontos de estrangulamento devido à dificuldade na construção da orientação espacial ECM e defeitos estruturais. Assim, alguns de modelagem e análises teóricas foram relatados [6, 16]. Por exemplo, o ensaio Boyden é um método vulgarmente aceite para testar a capacidade de invasão de células de cancro em três dimensões. No entanto, a câmara de só proporciona um ambiente de ECM homogénea, o que difere do ambiente do tecido heterogéneo [17-18].

Para explorar ainda mais a invasão de células, novas abordagens têm modelado o microambiente complexo com um maior grau de similaridade com

in vivo

condição usando a tecnologia microfluídica combinado com imagem óptica. Este dispositivo dispõe de uma plataforma tridimensional (3D) para a cultura celular e invasão que é semelhante ao o

In vivo

microambiente. Comparado com métodos bidimensionais convencionais, tais como ensaios de raspar, este dispositivo proporciona uma maior especificidade e com mais precisão imita o ambiente 3D para o estudo de células [19-20]. Neste artigo, relatamos a nossa recente progresso na construção de um ambiente ECM baseada em matrigel 3D para estudar os comportamentos invasivos da linha celular de cancro da mama MDA-MB-231 metastático. Além disso, construiu-se com êxito uma interface matrigel artificial no espaço 3D. A heterogeneidade das estruturas matrigel determinada grandemente os comportamentos celulares coletiva, a morfologia celular e eficiência invasão. Especialmente, o padrão de migração celular foi fortemente acoplado colectiva com as características geométricas da interface em forma de funil. Além disso, propomos um modelo de autômato celular [21-35] para inferir os possíveis mecanismos que levaram ao comportamento invasão coletiva observou. Nossa sinergia de estudos experimentais e computacionais revelou que a heterogeneidade ECM e sinalização celular, juntamente com um gradiente químico, desempenham um papel essencial na determinação da invasão da célula cancerosa.

Resultados

interface de matrigel heterogêneo

Matrigel é um gel dependente da temperatura normalmente armazenado a 4 ° C. O procedimento de rotina para a preparação de Matrigel como

In vitro

ECM é armazenar o gel a 37 ° C. O gel em seguida, forma estruturas homogéneas com densidade uniforme. Para criar uma estrutura de matrigel heterogêneo que poderia simular a não-homogênea

in vivo

ECM microambiente, uma seção matrigel espacial foi preparado, curada e, em seguida, juntou-se com outra seção matrigel que foi então curado. Duas seções matrigel de concentração idêntico, mas curados em diferentes momentos criada uma interface em seu limite. FIG. 1 é uma imagem de microscopia eletrônica de varredura (SEM) mostrando os detalhes das estruturas de micro-escala conjuntas. A secção superior, Matrigel I, foi preparada e, em seguida juntou-se com a secção inferior que foi preparada 30 minutos após a secção superior. Ambas as seções matrigel tinham estruturas de malha com densidades semelhantes. No entanto, eles formaram uma interface verticais visível na articulação, como indicado pelas setas brancas. A interface possui duas características. Em primeiro lugar, as estruturas tinha pequenas cavidades que variam de 100 ~ 300 nm, que leva a baixar a densidade localizada. Em segundo lugar, as moléculas tiveram polarização horizontal ao longo da interface, o que indica que as estruturas de malha das duas secções não se sobrepõem. Experiências posteriores demonstraram e analisadas a função desta interface na determinação comportamentos invasivos de células de cancro metastáticas.

A interface tem uma orientação molecular horizontal e reduzida densidade localizada que produziu defeitos no interior do gel.

configuração microfluídicos para a invasão 3D celular

para analisar como a invasão de células metastático de interface matrigel influenciado no espaço 3D, que projetou e fabricou um chip microfluídico (Fig. 2A). As linhas tracejadas descrever a forma cúbica do chip de polidimetilsiloxano (PDMS). O chip possui duas câmaras redondas relacionadas com um túnel cilíndrico oco preenchido com curada 100% matrigel. A concentração de proteína foi de aproximadamente 10 mg /ml, que é 3-4 vezes mais elevadas do que o colagénio utilizada I a partir de caudas de rato (3-4 mg /ml) (354236, Dow Corning, MI, U. S. A). de soro bovino fetal (FBS) é um factor de crescimento utilizada para o crescimento de células de cancro. Na invasão da célula cancerosa

in vivo

, células metastáticas normalmente seguem o gradiente growth factor atractivo. O navio é mais rico em fatores nutricionais e de crescimento do que o tecido, e esses fatores formam um gradiente que orienta a direção da invasão celular. Assim, o experimento formado um gradiente FBS que imitava o

in vivo

microambiente para orientar invasão celular. meio RPMI com 1,0% de FBS foi colocada na câmara esquerda, e meio RPMI com 10% de FBS foi colocada em uma outra câmara. FIG. 2B mostra que um gradiente de FBS desenvolvido dentro do matrigel, quando os meios com diferentes concentrações de FBS foi aplicada nas duas extremidades da Matrigel a uma concentração de 100%. MDA-MB-231 células de cancro da mama metastático foram semeados sobre a superfície do Matrigel na câmara que contém o meio com 1,0% de FBS. Cada câmara foi preenchida com 180 ul de meio para assegurar mesmo diferenças de pressão entre as duas câmaras. Para as primeiras 24 horas, a câmara da célula foi cheio com meio com FBS a 10% para assegurar o crescimento normal das células MDA-MB-231. Após 24 horas, o meio foi mudado para meio com FBS a 1,0%, e o gradiente de FBS foi estabelecida. Para testar a estabilidade e estabelecimento do gradiente, dextrano-rodamina fluorescente (70 kDa proteína de peso molecular, Invitrogen) a uma concentração de 0,025 mg /ml foi usada para simular o estabelecimento do gradiente de FBS [36-37]. O peso molecular do dextrano-rodamina é semelhante à albumina do soro de bovino a 66,5 kDa. Um microscópio invertido (Ti-E, Nikon) com EMCCD (Flash 4.0, Hamamatsu) foi utilizado para capturar os sinais fluorescentes em matrigel. O chip com matrigel interior foi colocado dentro de uma incubadora de celular personalizado no palco ao vivo a 37,0 ° C, 5,0% de CO

2 e 80,0% de umidade, um ambiente normal de incubação celular. O software Micro-gerente controlava o microscópio para adquirir imagens de lapso de tempo das distribuições de dextrano-rodamina fluorescentes dentro do matrigel a cada 10 min durante 48 horas. FIG. 3C mostra a distribuição de dextrano-rodamina 48 horas após o gradiente foi estabelecida. Um gradiente visível foi estabelecido no gel. Esta imagem lapso de tempo mais tarde foi quantitativamente analisados ​​pelo software ImageJ. Os valores de cinzentos médios foram obtidos e analisados ​​a partir das imagens, que representam as intensidades de fluorescência de rodamina-dextrano em locais específicos. Estes valores foram então normalizados e representados graficamente com locais e tempo para o gráfico de software Origin, como é mostrado na Fig. 3D. Uma série de imagens de difusão de dextrano-rodamina foram tomadas a intervalos de 10 min. Cada imagem foi normalizado com o máximo eo mínimo obtido a partir de cada imagem da série [38]. Os perfis de gradiente foram analisadas por um rectângulo média horizontal ao longo da região do gel e representada graficamente contra a sua posição no canal. FIG. 2D indica que o gradiente de FBS simulado foi estabelecido no prazo de 3 horas e mantida durante até 48 horas. O teste de inclinação indicam que matrigel poderia estabelecer um gradiente linear e estável. Além disso, quando o meio com ou sem FBS foi aplicada simultaneamente para os dois lados, um gradiente eficaz formado na zona de Matrigel.

(A) Diagrama esboço do chip PDMS. O cilindro horizontal de canal entre as duas câmaras é preenchido com Matrigel (vermelho). A câmara esquerda foi preenchido com o meio com FBS a 1,0%, ao passo que a câmara direita é preenchido com o meio com 10,0% de FBS. (B) O meio com 10,0% de FBS e 1,0% de FBS estabelecido um gradiente de FBS ao longo da matrigel ensanduichada. (C) imagem fluorescente da zona de Matrigel. A linha azul indica o matrigel. O lado esquerdo com o valor mais baixo cinza em mostra a RPMI 1640 sem dextrano-rodamina, e na zona direita com o valor de cinza maior representa o 1640 RPMI com dextrano-rodamina. A zona de matrigel tem uma cor cinzenta, diminuindo gradualmente, indicando o estabelecimento de um gradiente de dextrano-rodamina. (D) A análise quantitativa do gradiente de dextrano-rodamina no estabelecimento tempo e dependente do espaço no matrigel. O gradiente foi estabelecida em 3 horas e manteve-se estável após 9-48 horas.

(A) As células MDA-MB-231 ligada à parede da superfície do lado de matrigel a 0 horas. A linha vermelha mostra a parte dianteira do grupo de células. (B) a invasão de células MDA-MB-231 em matrigel a 96 horas. As células e matrigel digestão causados ​​encolhimento gel em comparação com a parte dianteira da célula às 0 horas. (C) poucas células na Fig. 3B esticada e exibiram ligeira invasão em matrigel, como as setas brancas indicam, indicando que as células MDA-MB-231 não pode invadir o Matrigel rígida da concentração de 100%.

comportamento de invasão MDA -MB-231 células em um ambiente ECM homogénea

em seguida, a influência da interface matrigel heterogénea na invasão celular colectiva foi analisada. Para efeitos de comparação, a experiência de controlo analisados ​​invasão de células num microambiente ECM homogénea. FIG. 3A mostra o canal de ligação cilindrados preenchido com Matrigel homogénea a uma concentração de 100%. A 0 horas, as células MDA-MB-231 ligado de modo uniforme para o lado esquerdo do matrigel. Ambas as câmaras foram cheias com meio com FBS a 10%, o que assegurou a fixação de células e crescimento normal. Após 24 horas, o meio na câmara esquerda foi substituído com meio contendo 1,0% de FBS. Na Fig. 3B, a sombra negra ao longo da superfície de matrigel que indica o número de células aumentou significativamente devido à proliferação celular rápida. Após 96 horas, o matrigel foi deformada, e à frente de células MDA-MB-231 (linhas vermelhas) avançou para a direita, como eles preso à superfície do matrigel. A deformação matrigel foi causado pelas MMPs segregadas pelas células MDA-MB-231, que degradam o Matrigel [39], e a força da interacção entre as células MDA-MB-231 e Matrigel microestrutura [40-42]. A primeira representa uma acção química, ao passo que o último é um processo físico. Embora as forças convergentes foram significativas e causado deformação matrigel, as células não, obviamente, colectivamente invadem as estruturas 3D de matrigel. FIG. 3C mostra a secção ampliada da frente da célula na Fig. 3B. A imagem mostra a invasão de células em matrigel 3D 520 uM sobre a parte inferior do canal. As setas azuis indicam que as células MDA-MB-231 invadiram o matrigel apenas ligeiramente. Tal como mostrado, apenas algumas células na parte da frente formada formas elípticas no Matrigel, representando as suas pequenas invasões. A maioria das células por trás destas células apresentaram crescimento compacto. Em geral, as células MDA-MB-231 não pode invadir o matrigel, provavelmente devido à rigidez do matrigel 100%. Este experimento de controle confirmou que as células só podiam exibir crescimento intensivo na superfície do gel, sem comportamento invasivo 3D, se o gel rígida tinha uma densidade uniforme.

Construção de um microambiente ECM heterogêneo com uma interface matrigel

experiência de controlo anteriores demonstraram que as células metastáticas MDA-MB-231 foram mal capaz de invadir o matrigel ECM-like devido à sua rigidez. Para estudar os comportamentos invasivos celulares coletiva em ECM com um microambiente heterogêneo, geramos uma estrutura conjunta matrigel espacial no canal de gel. FIG. 4A mostra que o canal matrigel cilindrados foi preenchido com duas seções dos géis: matrigel I (vermelho) e matrigel II (azul). Especificamente, Matrigel II foi inserido em Matrigel I e ​​formada uma estrutura em 3D em forma de funil. Durante a preparação, o canal cilíndrico foi injectado em primeiro lugar com 8 um de 100% de matrigel. Em seguida, o chip foi inclinado 30 ° ~ 45 ° graus em relação ao nível da plataforma durante 30 min, enquanto o gel curado (Fig. 4B). À medida que o Matrigel não tinha solidificado durante este tempo e o Matrigel macio aderiu fortemente ao canal de PDMS, gravidade manada o gel para a extremidade direita, criando uma estrutura em forma de funil, até totalmente solidificado. Neste ponto, a gravidade combinada com gel de adesão desempenhou um papel importante na formação da morfologia 3D do matrigel I. Finalmente, mais 3 mL de 100% de matrigel II foi adicionado à cavidade. O chip foi então colocado dentro de uma incubadora para o nível de gelificação completa. Assim, Matrigel I e ​​II em conjunto e formada uma interface em forma de funil, como mostrado na Fig. 4B. Estas duas secções têm densidade gel idêntico, mas a interface tinha diferenças estruturais. Como mostrado na Fig por SEM. 1, a densidade e orientação da molécula de gel de locais variou entre as secções uniformes. As propriedades físicas da interface foram, portanto, diferente do matrigel homogénea. As variações também conduziu a alterações nas propriedades ópticas, incluindo o índice de reflexão. Figura C mostra a imagem de campo brilhante imaginada pelo microscópio invertido. A interface 3D em forma de funil é claramente visível no canal, como indicado pelas setas vermelhas.

(A) dos desenhos mostra que o Matrigel heterogénea é composta de Matrigel I (vermelho) e Matrigel II (azul). As duas seções formam uma interface 3D em forma de funil. (B) A inserção superior mostra a preparação estrutura de gel de matrigel. Depois de Matrigel I no canal gelificado durante 30 min, o chip foi inclinado 30 ° -45 °. O matrigel formei uma estrutura funil devido à gravidade e adesão gel. Em seguida, Matrigel II foi injectado na cavidade. A inserção inferior mostra a interface da vista lateral. (C) As setas vermelhas indicam a interface de gel no experimento.

invasão celular Matrigel guiada interface coletiva MDA-MB-231

MDA MB-231 foram carregados em o lado esquerdo da matrigel heterogénea com interfaces e cultivadas durante 48 horas (Fig. 5D). O procedimento foi exactamente o mesmo que o descrito para a experiência de controlo representado na Fig. 3. Na Fig. 5D, a sombra é o limite do canal de matrigel e piscina redonda e é causada pela projecção de luz da parede do PDMS. O plano focal da imagem é sobre o substrato de câmara. A sombra do lado esquerdo é o compartimento de meio onde as células MDA-MB-231 foram previamente carregado e se acalmou e proliferaram sobre o substrato. O lado direito é a zona de Matrigel, em que as células fixado à parede esquerda. A maioria das células na superfície de matrigel verticais permaneceu na área sombreada e não são visíveis na figura. A cor inferior direito do quadro indica que, depois de células MDA-MB-231 tinha anexado ao lado do matrigel por 48 horas, algumas células esticados para fora e começou a invadir a matrigel interior seguindo estritamente a interface. As células que estiveram em contacto com a interface no espaço não invadir, semelhante à experiência de controlo. Estes resultados indicam que as células tinham resposta mecanotransdução à estrutura e pode detectar e seguir a interface. A interface desempenha um papel importante na orientação invasão de células, que não poderiam ocorrer em matrigel rígida homogénea. Como mostra a SEM, as fibrilas de ECM teve polarizações e defeitos na interface que possivelmente guiada invasão direcional celular. Além disso, os constrangimentos e tensões físicas heterogêneos poderia induzir redistribuição receptor âncora na membrana celular. Assim, o resultado estiramento mecânico das membranas pode controlar extensões Pseudópodes e motivam a invasão de células ao longo da interface. Para esclarecer este processo, o esquema acima explica a invasão celular após a interface matrigel espacial.

(A-C) Cartoons explicando as diferentes fases de invasão celular coletiva. (D) mostra que as células MDA-MB-231 detectada a interface e começaram a invadir o matrigel em 48 horas; (B) ramos invasivas das células MDA-MB-231 ‘aumentaram depois da interface de matrigel a 96 horas. Alguns ramos ligar e formar uma rede, tal como indicado pelo círculo vermelho. (C) após a interface parcial foi preenchido com as células, as células da fronteira escapado do confinamento interface e produzido invasões semelhantes a dedos, no matrigel homogénea, confirmando a forte invasão das células MDA-MB-231 no espaço de gel heterogéneo.

Após 96 horas, a invasão de células tornou-se mais evidentes, tal como mostrado na Fig. 5E. Mais células MDA-MB-231, formação de ramos individuais, começaram a invadir o Matrigel ao longo da interface, tanto a partir do lado e da parte inferior. As células invadidas ao longo da interface lado, revelando que a invasão ainda seguidas à risca a interface em velocidades rápidas. Além da influência da interface, o sinal de célula também desempenhado um papel vital na aceleração invasão celular. Comunicação celular ajudou o 3D invadir as células formam uma rede e se conectar com outros ramos invasores, como indicado pelo círculo esboçado com linhas tracejadas vermelhas. Esta conexão ajudou as células formam um grande grupo e invadir o espaço gel coletivamente. Simultaneamente, o gradiente FBS também contribuiu e células para invadir para o lado direito [43-44] levou.

Com o benefício da orientação interface, células MDA-MB-231 rapidamente invadiram o matrigel. A 192 horas, as células MDA-MB-231 apresentou fortes comportamentos invasivos colectivos e padrões de invasão no gel. FIG. 5F mostra que o grupo a invasão de células formado em duas secções do matrigel. Early-células invasoras que formaram ramos invasores ao longo da interface continuou a invadir, proliferar e a fusão até que eles ligado e formado um plano célula 350 um de comprimento e 100 mm de largura, como indicado pela seta preta. Este plano de células foi confinado pelo painel de interface. Em seguida, um denso aglomerado de células surgiu na sua frente e continuou a evoluir para uma forma alongada que invadiu na ECM frente. Referimo-nos a este aglomerado de células alongadas como um “dedo” célula. O dedo invadido horizontalmente para a direita do gel, indicando que as células tinham escapado do confinamento da interface de matrigel e invadido para a secção de Matrigel I. Em outras palavras, as células não invadiram o gel ao longo da interface, mas directamente no ambiente de matrigel homogénea. A linha a tracejado representa o preto frente da interface funil e mostra o dedo de células gerado antes de as células preenchidas a interface. O limite das células em o dedo não é visível, o que indica que o grupo de células tinham estruturas muito compactas com junções célula-célula fortes. Comparada com o comportamento de invasão de células na experiência de controlo, em que apenas algumas células exibido invasão ligeira e de curta distância à frente do grupo de células, a invasão dedo maciça implica que as células MDA-MB-231 teve comunicações de sinal fortes uns com os outros que dominou seus comportamentos coletivos, o que pode explicar por que o grupo de células aqui poderia invadir a 100% do espaço matrigel, ao contrário do grupo controle no matrigel com a mesma densidade. Além disso, o gradiente de FBS contribuiu grandemente e dirigido a invasão dedo para a direita [45].

Discussão

De um modo geral, o processo de invasão de células metastáticas de MDA-MB-231 em Matrigel com um interface de 3D em forma de funil pode ser considerado ter três fases. Na fase 1

r, as células invadiram o matrigel em poucos fluxos, guiado principalmente pela superfície de interface curva (48 horas). No 2

ND fase, mais fluxos de células apareceu na interface. Nesta fase, sinalização celular dominada, permitindo fluxos invadidas para se comunicar com os outros e redes celulares formulário. Durante o 3

rd fase (192 horas), a rede celular transformado em um grupo de células continuamente invadindo que gerou a forma de dedo e colectivamente invadido na parte da frente. Simultaneamente, o gradiente químico e células de sinalização FBS foram os fatores dominantes que dirigem a invasão da célula para a direita no espaço matrigel rígida e homogênea.

Para analisar teoricamente a invasão celular colectivo em um microambiente matrigel heterogêneo, que propôs o seguinte mecanismos que induzem as principais características do comportamento invasão de 3 fases observada aqui: (i) micro-ambiente heterogeneidade; (Ii) de longo alcance atração homot�ica através da comunicação célula-célula (principalmente de natureza química); e (iii) direccional migração celular orientada por gradiente. Para verificar esses mecanismos e obter uma compreensão mais profunda de como eles são acoplados, eu inventei um modelo de autômato celular (CA) [22-35] que incorporou os mecanismos acima mencionados para

qualitativamente

simular a migração celular coletiva em um ambiente heterogêneo. Notamos que, embora o sistema actual é em três dimensões, utilizamos um modelo bidimensional (2D). Isto é porque os nossos estudos anteriores mostraram que os modelos CA 2D são suficientes para reproduzir qualitativamente a dinâmica celulares coletivos em tumores invasivos sólidos [46-48] e tumores malignos passivas [49].

Seguindo estudos anteriores [46- 49], um domínio de simulação rectangular (com uma proporção de aspecto 2) foi dividido em polígonos discretos utilizando disposição de Voronoi associado com um enchimento desordenado de discos circulares (Fig. 6). A embalagem foi gerado através de adição sequencial aleatória de 80.000 discos circulares rígidos [46]. O tamanho linear do domínio de simulação foi de 4000 um x 2000 uM. Assim, o tamanho linear média de cada polígono de Voronoi era de aproximadamente 10 um, consistente com o tamanho típico de uma célula. Na nossa simulação, um polígono de Voronoi pode ser ocupada por macromoléculas de ECM, uma célula, ou um espaço vazio. Cada ECM associado polígono de Voronoi possuía um valor de densidade ECM eficaz

ρ

, e por um polígono vazio-espaço,

ρ = 0

. Notamos que este valor de densidade é um parâmetro de simulação que é proporcional, mas geralmente diferente da densidade ECM real (ou seja, número /massa de macromoléculas ECM por unidade de volume /área)

Painel direito:. Associado disposição de Voronoi do plano em polígonos.

Para imitar o micro-ambiente heterogêneo observado nos experimentos, consideramos duas regiões ECM com diferentes densidades, ou seja, uma região macio com

ρ

b

e uma região duro com

ρ

h

Nós usamos uma curva de Gauss para aproximar a fronteira das duas regiões. Os polígonos de Voronoi na interface das duas regiões ECM tinha uma densidade muito menor

ρ

b

do que as regiões de ECM em massa devido a possíveis defeitos na interface. Os valores da densidade são fornecidos na Tabela 1. Em adição, um gradiente químico uniforme aplicada ao longo da direcção horizontal foi incorporado implicitamente no nosso modelo, que inclinado a migração das células ao longo da direcção horizontal (como detalhado abaixo). Notamos que, em geral, um prolife inclinação é muito mais complexa do que um uniforme. No entanto, esta aproximação foi suficiente para o nosso estudo qualitativo.

No início da simulação, as células são liberados e podem entrar no domínio de simulação do lado esquerdo do domínio. tempo de simulação é então discretizado em horas. Ao entrar no domínio de simulação, uma célula ocupa um polígono de Voronoi e degrada as macromoléculas ECM originalmente no polígono. Em cada passo de tempo, cada célula está marcada para a migração. Quando um migra celulares, salta dos atuais polígono de Voronoi a um polígono de Voronoi vizinha com uma probabilidade

P

m

, que é um parâmetro chave de simulação que depende da densidade ECM do polígono vizinha, a direcção do gradiente químico e as posições de outras células. Especificamente, as seguintes regras CA são empregados para determinar

P

m

:

ECM densidade

: Após estudos anteriores [46-49 ], assumimos que é mais fácil para as células a migrar em ECM suave do que o ECM duro. Assim, consideramos a probabilidade de que uma célula salta em um Voronoi polígono

j

com

ρ

j

ser proporcional ao

e

-ρj

, ou seja,

P

m

~ e

–

ρj

gradiente químico

: Consideramos que a direção da migração de uma célula é influenciado pela gradiente químico. Esta regra foi implementada mediante a imposição de uma probabilidade de migração maior se a direção da migração era mais alinhado com a direção do gradiente. Suponha que uma célula originalmente ocupa uma Voronoi polígono

i

, a probabilidade de que a célula salta para uma vizinha Voronoi polígono j é então proporcional ae

(

r

ij

∇

c

), ou seja, P

m

~

e

(

r

ij

∇

c

), onde

r

ij

denota o vetor deslocamento apontando de polígono

i

para

j Comprar e ∇

c

é o gradiente químico aplicado, que é selecionado para ser o vetor de unidade ao longo da direcção horizontal

Homotype atração

:. Nós consideramos que a direcção da migração também é afectada por outras células através da comunicação célula-célula que podem ser de natureza química. Sem entrar em detalhes sobre a comunicação célula-célula envolvida no comportamento coletivo observado, o que requer estudos exaustivos nível sub-celular, só implementou o efeito global da comunicação em nosso modelo, ou seja, atração homotype. Esta atração implica que as células migram para o outro e foi implementado da seguinte forma: suponha que uma célula originalmente ocupa uma Voronoi polígono

i

, construímos um círculo de raio

R

c centrado em polígono

i

, onde

R

c é o alcance efetivo de comunicação célula-célula. Em seguida, as posições de todas as células dentro do círculo de influência são em média, dando a posição de um centro efectivo de atracção. Deixe o vector r

ic

denotar o deslocamento de polígono

i

para a posição de célula média (isto é, centro de atracção). A probabilidade de que a célula salta para uma vizinha Voronoi polígono

j

é considerada proporcional e

(

r

ij

∙

r < FIG.