Humana

Abstract

Fundo

fusão de células tumorais com medula óssea móveis células -derived (BMDCs) tem sido posta como um mecanismo para a metástase do câncer. Enquanto não há muito apoio para isso a partir de estudos de cultura de células e em animais, tem ainda a ser confirmada no câncer humano, como tumores e células derivadas da medula do mesmo paciente não podem ser facilmente distinguidos geneticamente.

Métodos

Realizamos a genotipagem de um melanoma metastático para o cérebro que surgiu após o transplante alogênico de medula óssea (TMO), usando forense curta em tandem repeat (STR) comprimento-polimorfismos de distinguir dos doadores e de genomas de pacientes. As células tumorais foram isolados livre de leucócitos por microdissecção a laser, e tumorais e pré-transplante DNAs de linfócitos de sangue foram analisadas para doadores e alelos de pacientes em 14 autossômica loci STR e os cromossomos sexuais.

Resultados

Todos os alelos nos linfócitos pré-BMT de dadores e doentes foram encontrados em células tumorais. Os alelos apresentaram abundâncias relativas desproporcionais em padrões semelhantes ao longo do tumor, indicando que o tumor foi iniciado por um evento de fusão clonal.

Conclusões

Os resultados suportam a fusão entre um BMDC e uma reprodução de células tumorais um papel na origem desta metástase. Dependendo da frequência de tais eventos, as descobertas podem ter implicações importantes para a compreensão da geração de metástases, incluindo as origens de células tumorais e iniciando o epigenoma câncer

Citation:. Lazova R, LaBerge GS, Duvall E, Spoelstra N, Klump V, Sznol M, et al. (2013) A melanoma metástases cerebrais com um genoma híbrido doador-paciente após transplante de medula óssea: primeira evidência de fusão em Câncer Humano. PLoS ONE 8 (6): e66731. doi: 10.1371 /journal.pone.0066731

editor: Eva Mezey, National Institutes of Health, dos Estados Unidos da América

Recebido: 27 de fevereiro de 2013; Aceito: 09 de maio de 2013; Publicação: 26 de junho de 2013

Direitos de autor: © 2013 Lazova et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O financiamento foi fornecida em parte por um presente irrestrita da Amway Corporation e pela Universidade de Cancer Center Support Grant NCI Colorado (P30CA046934). Os custos adicionais foram cobertas internamente pelas instituições envolvidas: Universidade de Yale, a Universidade do Colorado, ea Polícia de Denver Crime Lab. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. O financiamento para este estudo foi fornecido em parte por um presente irrestrita da Amway Corporation. Não há patentes, produtos em desenvolvimento ou produtos comercializados a declarar. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

fusão de células tumorais com leucócitos motilidade, tais como células de linhagem mielóide ou de células estaminais foi colocado para a frente como uma explicação unificador para a metástase [1] – [4]. Mais de um século atrás Aichel propôs que o câncer pode resultar da fusão entre leucócitos móveis e outras células somáticas, com as diferenças qualitativas entre cromossomos causando o híbrido a ser “jogado para fora do caminho das células-mãe para formar o que veio a ser conhecido como uma célula maligna “[5]. fusão das células do cancro foi detectado pela primeira vez quando as células de glioblastoma humano foram implantados em hamsters e desenvolveram metástases com um cariótipo humano-hamster [6]. Isto foi seguido por relatórios de muitos laboratórios de fusão de células de cancro em cultura e ratinhos [1] – [3]. Mais recentemente, quando as células de melanoma de ratinho Cloudman S91 fracamente metastáticas foram fundidos com rato normal ou macrófagos humanos em cultura, híbridos implantados em ratinhos revelaram taxas elevadas de metástases, com diminuição do tempo de sobrevivência dos hospedeiros em comparação com os das células de melanoma de controlo usado como parceiros de fusão [7]. híbridos metastáticos foram altamente pigmentado, característica da linhagem de melanócitos, e também expressa numerosas características de linhagem mielóide, tais como a motilidade aumentada quimiotáctica, autofagia e padrões de glicosilação tipo macrófagos [8] – [10]. Quando macrófagos humanos foram usados ​​como parceiros de fusão com células de melanoma de ratinho, expressas genes híbridos SPARC tanto humanos como de ratinho, indicando que os epigenomas de ambos os parceiros de fusão foram activadas [11]. Do mesmo modo, quando as células derivadas de medula de rato marcado com fluorescência ósseas foram introduzidos através parabiose em ratinhos com tumores intestinais, híbridos de células de macrófagos-cancerosas formadas que expressavam transcriptomes característicos de ambos os parceiros de fusão progenitoras [12]. Da mesma forma, o implante de glioblastoma humano ou células de linfoma de Hodgkins em faces de hamster resultou em híbridos humano-hamster metastáticos com a co-expressão dos genes humanos e de hamster [13] – [14]. Assim, rato-rato, rato-humano e humano-hamster híbridos toda célula cancerosa co-expressa e genes celulares normais e mostrou capacidades melhoradas metastáticos. Em outros estudos, a fusão de células cancerosas com BMDC de na cultura induzida aneuploidia, a resistência aos medicamentos, o aumento da capacidade de invasão e tumor heterogeneidade [15] – [20]. Em melanomas humanos, células de melanoma “stealth” foram detectados em metástases linfáticas, que mostraram propriedades consistentes com os híbridos de fusão sendo [21]. Circulating células tumorais capturados a partir do sangue de pacientes com melanoma, pancreático e colo-rectal carcinoma de co-expressa e marcadores leucocitários sugerindo fusão celular BMDC-tumoral [22].

No entanto, a fusão e a hibridação genómica ainda tem que ser comprovada numa base genética no cancro humano, uma vez que as diferenças genómicas entre as células do mesmo paciente pode não ser prontamente distinguidos. Para contornar esse problema analisamos neoplasias secundárias decorrentes transplantes de medula óssea alogênico de correio (TMO). Em dois relatórios anteriores demonstramos alelos doadores em células cancerosas do paciente, mas não havia nenhuma provisão para identificar alelos de pacientes e de fusão poderia, portanto, não ser provado [23] – [24]. Aqui usamos STR comprimento polimorfismos e técnicas de genética forense para analisar o ADN genómico de uma metástase de melanoma cérebro de um paciente que tinha recebido anteriormente uma BMT de seu irmão. Os resultados demonstram a presença de dadores e doentes alelos em células cancerosas por todo o tumor, o que indica que um evento de fusão de células BMDC-cancro tinha iniciado a geração deste tumor. Patologia análises e modelagem matemática de padrões alélicas apoiou esta conclusão.

Métodos

declaração

Ética

Todas as amostras utilizadas neste estudo foram pré-existentes e De-identificado antes de ser recebido pelo equipe de pesquisa de Yale. Isenção foi concedida sob Yale IRB protocolo número 070900309 (JP e RL) do Programa de Proteção de Pesquisa Humana da Universidade de Yale, Institutional Review Board.

Fonte dos tecidos

O paciente era um 68-ano- velho homem que recebeu um TMO alogênico de seu irmão para o tratamento de linfoma de células B. Seu último perfil de enxerto /quimerismo foi Destinatário 3%; Doador de 97%. Seis anos mais tarde, o doente foi diagnosticado com melanoma metastático envolvendo nódulos linfáticos, fígado e cérebro, derivadas de um tumor primário desconhecido. Analisamos uma metástase cerebral (designada “MH3”), constituído por um tecido de 0,5 × 0,2 × 0,3 centímetros fixado em formol embebido em parafina (FFPE). O tumor foi removido cirurgicamente, fixadas em formalina e embebidas em parafina por processos histológicos padronizados. linfócitos do doador e do paciente pré-transplante foram armazenadas a -90 ° C no Hospital Yale-New Haven Stem Cell Bank e recuperados após as análises de tumor foram concluídos.

Laser Microdissecção

manuseamento e processamento de amostras de tecidos foi realizada utilizando equipamento UltraClean, livre de ADN. Cinco cortes histológicos u-espessura foram cortadas e histoquímica para LCA /CD45 (clone 2B11 + PD7 /26, Dako, catálogo N1514) usando um Autostainer (Dako, Carpinteria, CA) no Yale Dermatopathology Laboratories. O anticorpo foi testado para a coloração de eficiência, tal como descrito em S1 Ficheiro. As células tumorais foram microdissectados livre de células CD45-positivas LCA /a partir de 9 regiões tumor utilizando um sistema de microscópio de dissecção de laser Arcturus XT. Cada amostra foi composta por células tumorais dissecados agrupados de uma ou mais áreas de uma mesma seção.

DNA extração

extração de DNA e análises STR foram de Denver Police Department Crime Unit DNA do Laboratório usando forense padrão operação e procedimentos valided [25]. As amostras foram recolhidas em tubos GeneAmp reacção de parede fina (0,5 mL; Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA). DNA de linfócitos foi extraído na plataforma BioRobot EZ1 com o protocolo de DNA traço kit EZ1 DNA Investigator (Qiagen nos EUA). humana total e DNA masculino foram avaliados com o Quantifiler Duo DNA Quantificação Kit (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, EUA). Foram utilizados dois procedimentos de extração de DNA. Para as amostras de tumor de 1-4, o ADN foi extraído utilizando o Chelex a 5% com o procedimento de proteinase K [26]. Para as amostras 5-9, o ADN foi extraído utilizando o Kit RECOVERALL totais Ácido Nucleico Isolante para tecidos FFPE (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, EUA), o que melhora o rendimento de ADN de aproximadamente 5 vezes (não mostrado). O número de células tumorais MICRODISSECADO por amostra foi registado automaticamente pelo sistema Arcturus XT.

amplificação por PCR

A PCR foi realizada com o Kit AmpFlSTR Identifiler Amplificação por PCR (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, EUA ). De um modo geral, de 1 ng de ADN total foi orientada em cada amplificação por PCR. Em amostras com menos ADN ( 0,1 ng /mL), as amostras foram concentrados 5-20 vezes utilizando um filtro de centrífuga (Ultracel Microcon YM-100, Millipore, Billerica, MA, EUA)

análises genéticas forense. de loci STR

para cada locus STR foi selecionado para ser neutras em relação a outros ligação genética ou associações com qualquer mendeliana ou distúrbios não-mendeliana. Os loci foram polimórficos e exibiu níveis aceitáveis ​​de heterozigosidade, normalmente 70% ou superior. Eles podem ser ensaiadas em conjunto como uma PCR multiplex e eram robustas para o ADN degradado [25]. A genotipagem dos produtos de PCR e interpretação dos alelos Curto repetição em tandem-STR foram realizadas utilizando electroforese capilar num ABI Prism 3130 Genetic Analyzer com GeneMapper ID Software versão 3.2 (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, EUA). Cromossomas X e Y foram detectadas utilizando o ensaio simultâneo com a amelogenina autossómica analisa STR [25]. limiares qualitativos e quantitativos de sinal-para-ruído foram determinados com o Kit ABI Identifiler. Todos os picos 50 unidades de fluorescência relativas foram classificados como verdadeiros alelos com base em a) de altura e b) morfologia pico [25]

Allelic gagueira

picos de sinal dos alelos podem se sobrepor “gagueira” técnico. posições de outros alelos. estudos de validação têm estabelecido diretrizes de interpretação para os marcadores forenses para distinguir os sinais de alelos verdadeiros de gagueira para qualquer alelo em qualquer lugar [27] – [28]. Todas as chamadas alelos considerado significativo neste estudo conformes com estas orientações e não foram gaguejar sobreposições.

Modelagem Estatística e Análise

modelos estatísticos Bayesian de contaminação de fusão e célula doadora foram montados e comparados por meio da cadeia de Markov métodos de Monte Carlo [29] implementado usando JAGS [30] e R [31] software conforme descrito no S2 Arquivo.

Resultados

Patologia analisa

Realizamos extensas análises de patologia para garantir que as amostras de tumor de laser dissecados não estavam contaminadas por infiltração de leucócitos de dadores. Para detectar leucócitos foi utilizado um anticorpo para o antigénio de leucócitos comum (LCA /CD45) expressa sobre a superfície de leucócitos maduros e as células progenitoras hematopoiéticas. Em experiências de controlo positivo o anticorpo mostrou . 99% eficiência de coloração contra casos de teste de dermatite e linfoma (. Figs S1 e S2, Tabela S1 S1 Ficheiro)

Coloração de melanoma MH3 para LCA /CD45 revelou que algumas regiões contidas LCA leucócitos /CD45-positivas misturadas com células LCA /CD45-negativas melanoma (Fig. 1A). Estas foram consideradas como não adequado para microdissecção a laser. No entanto, outras áreas contidas populações puras de LCA /células de melanoma CD45-negativo em grupos de dezenas a centenas que eram adequados para microdissecação (Fig. 1B-D). Da mesma forma, quando o tumor foi corado para S100 para detectar células de melanoma [32], algumas regiões tumorais foram infiltradas com leucócitos S100-negativas, enquanto outros continham células de melanoma única S100-positivas (Fig. 2A e B). Assim, duas análises imunoquímica diferentes mostrou que o tumor MH3 continha áreas de células de melanoma maligno praticamente puros que podem ser limpa microdissecados com 1% contaminando leucócitos. Uma análise mais detalhada de coloração S100 é apresentado nas Figs. S3 e S4 no S1 Arquivo.

A. Uma área com leucócitos marrom LCA /CD45-positivo (seta) misturadas com células cancerígenas azul LCA /CD45-negativas. B-D. áreas adjacentes da mesma seção contendo as células cancerígenas CD45-negativo apenas azul LCA /.

a. Uma área de células tumorais positivas S100-S100 misturado com infiltrando-negativo leucócitos (setas). B. Uma área contendo apenas células de tumor S100-positivos. análises mais detalhadas de patologia são apresentados nas figuras S3 e S4 no S1 Arquivo.

microdissecção a laser e analisa STR

secções de tumor foram manchadas com LCA /CD45 antes da dissecção laser e células tumorais foram dissecados livre de leucócitos /CD45-positivas LCA. As células tumorais foram isolados a partir de 9 regiões em todo o tumor (amostras 1-9) e o ADN foi extraído e amplificado para alelos em loci STR 14. Todos os alelos encontrados no doador de pré-transplante e linfócitos sanguíneos de pacientes também foram detectadas em células tumorais. Para cada locus houve pelo menos um alelo comum a ambos o dador e do paciente, consistente com a relação fraterna. Oito loci exibido pelos doadores alelos específicos e seis deles exibiu dador e específicos de pacientes-alelos. Isto indicou que as células tumorais foram híbridos doadores pelo paciente (Fig. 3, Tabela 1). Notavelmente, os rácios alélicas tumorais diferiam entre loci, mas para qualquer determinado locus os rácios alélicas foram semelhantes em todos os 9 regiões do tumor. Isto sugeriu um genótipo relativamente estável e susceptível de origem clonal a metástase. Os loci restantes foram informativo sobre fusão com alelos específicos apenas partilhadas ou de pacientes e nenhum alelo doadores (Tabela 2; Fig. S5 em Arquivo S1).

Mostrado são “informativo” loci exibindo doadores e alelos específicos de pacientes em pré linfócitos -BMT. loci tumor são listados em ordem de abundância relativa dos alelos específicos de doadores (asterisco vermelho) em comparação com especificas do paciente (azul asterisco) e alelos comuns (asterisco preta). picos de alelos 50 unidades de fluorescência relativas foram censuradas como “nenhuma chamada” (círculos abertos). Loci sem alelos detectáveis ​​após a amplificação PCR (-).

Finalmente, nós nos encaixamos modelos estatísticos para comparar a probabilidade de fusão de células de doadores BMDC-tumoral contra a contaminação de doadores de leucócitos (Fig . 4), descrito em pormenor nas Figs. S6, S7, S8, S9, Tabela S2 no arquivo S2. O modelo de fusão encaixar melhor os dados, como demonstrado pelos seus desvios menores (Fig. 4A e B) e o seu mais elevado o log pseudo-marginal probabilidade (LPML), que excedeu a LPML para o modelo de contaminação por uma diferença de 71,4 (Fig. 4C e D, linha vermelha). . Um procedimento de calibração [33] – [34] para avaliar o significado dessa diferença rendeu probabilidades

P Art 0,005 para a contaminação e

P Art 0,3 para a fusão (Figuras 4C e D ), mostrando que o observado LPML diferença é muito raro sob o modelo de contaminação, mas não raro sob o modelo de fusão. Assim, estes dados apoiam fortemente a fusão sobre a contaminação de células de doadores como a explicação para as dosagens alélicas observadas

Painéis A e B:. Desvios sob modelos de contaminação e de fusão; desvios menores indicam um melhor ajuste. Painéis C e D: Um procedimento de calibragem mostra a LPML diferença observada (linhas vermelhas) é raro sob o modelo de contaminação, mas típico sob o modelo de fusão. análises estatísticas mais detalhadas são apresentadas em S2 Arquivo.

Discussão e Conclusão

STR análise do tumor DNA revelou que doadores e pacientes alelos estavam presentes em conjunto em vários loci e que havia desequilíbrios alélicas generalizada e aneuploidia. Um problema foi a incapacidade de realizar análises STR em células tumorais individuais, mas para este tumor o limite inferior para a recuperação de DNA para STR análises foi de cerca de 500 células, mesmo usando o procedimento de extração de DNA para células FFPE que melhoraram a recuperação do DNA. Assim, não foi possível excluir definitivamente que os padrões podem ser devido a uma mistura quimérico de células tumorais de pacientes e dadores BMDCs. Contudo, é improvável, pelas seguintes razões: 1) Para um determinado locus os rácios alélicas eram semelhantes em todo o tumor. É difícil de explicar estes padrões repetidos como devido às misturas quiméricas como isso exigiria que os diferentes tipos de células existia em conjunto nas mesmas proporções em todo o tumor. Notavelmente, enquanto a maioria dos locos tumor informativo tinha alelos paciente e partilhados em maior abundância relativa de alelos específicos de doadores, locus de tumor D13S317 foi revertida, com o alelo específico do paciente ausente e o alelo específico do doador em destaque. Uma vez que a dose inicial de ADN genómico para cada amostra era determinante para a intensidade do produto de PCR e variou largamente entre as amostras, tendo em conta a consistência em proporções alélicas de amostra para amostra a reversão de dosagem de ADN em D13S317 local não pode ser explicado por PCR preferencial ou contaminação de leucócitos. 2) As células tumorais foram dissecadas a partir de regiões livre de células LCA-positiva (Fig. 1). 3) É improvável que os resultados foram devidos à contaminação do ADN a partir de fontes exógenas. Qualquer ADN contaminante teria de vir do doador ou do paciente uma vez que todos os alelos detectados nas células tumorais podem ser contabilizados de linfócitos pré-transplante a partir de um ou outro desses indivíduos. Uma fonte de tal contaminação pode ser os linfócitos-se como eles continham grandes quantidades de ADN em comparação com os das amostras de tumor. No entanto, esta foi descartada porque os linfócitos foram recuperados a partir do armazenamento de longo prazo no líquido N

2 somente depois foram completadas as análises tumorais. Além disso, se houvesse uma fonte generalizada de contaminação de DNA no tumor, que deveria ter sido presente em níveis semelhantes nas áreas necróticas e este não era o caso, como discutido acima. 4) Nossas análises estatísticas dos padrões alélicas fortemente favorecido fusão celular BMDC-melanoma em relação aos modelos de contaminação de leucócitos.

Em biologia de células-tronco, tanto transdiferenciação e fusão parecem ser operativa na transformação de células-tronco em células somáticas diferenciadas [ ,,,0],35] – [38]. No entanto, a origem do tronco do câncer células /células tumorais iniciar é controversa. Em dois relatórios anteriores de malignidade secundária que surgem em pacientes pós-transplante de medula óssea alogênico, genes doadores foram encontrados em células tumorais, sugerindo fortemente fusão [23] – [24]. Mas em nenhum dos casos foram genes específicos do paciente também identificados nas células tumorais e mecanismos alternativos para a fusão não poderia ser descartada, como a transdiferenciação de células-tronco de doadores em células cancerosas. No entanto no tumor aqui descrito, forense STR análises revelaram que o dador e alelos de pacientes estavam presentes nas células tumorais e em todo o tumor apareceu consistir em grande parte, se não exclusivamente de híbridos de células BMDC-tumorais. Além disso, os padrões de alelos de repetição para cada locus em todo o tumor indicaram uma origem clonal da metástase e sugeriu que o tumor foi gerado a partir de um evento de fusão entre um doador antes BMDC e uma célula de tumor do paciente. Assim, pelo menos neste caso, conclui-se que a célula de iniciação do tumor foi um híbrido de células de tumor-BMDC. A medida em que este mecanismo é operativo em outros tumores continua a ser determinado.

Em estudos anteriores, os híbridos de tumor experimental gerado

in vitro

entre células cancerosas, incluindo melanoma e células epiteliais normais ou fibroblastos foram geralmente suprimida na tumorigenicidade e a expressão de funções diferenciadas, que levou à descoberta de genes supressores de tumor [39] – [40]. Mas, mais tarde, utilizando macrófagos como parceiros de fusão com células de melanoma, resultante híbridos expressos genes e características diferenciadas de ambos os pais e metástase foi realçada [7] – [11]. Isto indicou a co-expressão de epigenomas entre as duas linhagens parentais. expressa-co genomas híbridos poderia explicar a complexidade dos padrões de expressão gênica em células cancerosas e também como células malignas poderia ter um grande repertório tão grande de recursos mielóides-like, como angiogênese, alterações da matriz, motilidade, quimiotaxia e vias de sinalização do sistema imunológico, bem como sofrem transição epidérmico-mesodérmica [1], [41].

Um modelo para a metástase resultante da fusão de células derivadas de medula óssea é diagramado esquematicamente na Figura 5. enquanto isso, em grande medida foi verificada em modelos de tumores animais e cultura de células, a evidência para a fusão no câncer humano até agora tem faltado. Os nossos resultados mostram pela primeira vez num cancro humano que a geração de uma metástase e de aquisição dos seus padrões aberrantes genéticos resultou da fusão e hibridação genómica entre um BMDC e uma célula de cancro. Dependendo da frequência de tais eventos, as descobertas podem ter implicações importantes para a compreensão metástase, incluindo as origens de células tumorais e iniciando o epigenoma câncer.

A BMDC móveis (vermelho) tal como um macrófago ou célula-tronco é atraídos para uma célula cancerosa (azul). As membranas celulares exteriores das duas células tornam-se em anexo. A fusão ocorre com a formação de um heterocarionte bi-nucleada tendo um núcleo a partir de cada um dos parceiros de fusão. O heterocário passa por hibridização genômica criando um híbrido melanoma-BMDC com epigenomas co-expressa, a divisão celular desregulada conferindo e competência metastática ao híbrido.

Informações de Suporte

arquivo S1.

Figuras S1, S2, S3, S4, S5 e Tabela S1

doi:. 10.1371 /journal.pone.0066731.s001

(PDF)

S2 Arquivo.

Figuras S6, S7, S8, S9 e Tabela S2

doi:. 10.1371 /journal.pone.0066731.s002

(PDF)

Reconhecimentos

Agradecemos Prof. Douglas Brash, Escola de Medicina de Yale, para o primeiro sugerindo o uso de segundas neoplasias seguintes BMT e por sua ajuda com o manuscrito.