Abstract

O câncer de pâncreas STAT3-dependente é uma doença muito agressiva com poucas opções terapêuticas. Neste estudo, nós investigamos o papel da proteína quinase C zeta (PKCζ) em células de câncer de pâncreas. PKCζ foi mostrado que actua tanto como um supressor de tumor ou do promotor do tumor, dependendo do contexto celular. Descobrimos que a expressão PKCζ é mantida ou elevados em tumores pancreáticos humanos primários, mas nunca se perde, consistente com PKCζ desempenhando um papel de promoção no fenótipo do cancro do pâncreas. inibição genética de PKCζ reduziu o crescimento aderente, a sobrevivência das células e crescimento independente de ancoragem de células de cancro pancreático humano in vitro. Além disso, a inibição PKCζ reduzido o tamanho do tumor in vivo por ortotópico inibição da proliferação de células tumorais e aumento da necrose tumoral. Além disso, a inibição PKCζ reduzida metástases tumorais in vivo, e causou uma redução correspondente na invasão de células do câncer de pâncreas

in vitro

. transdutor de sinal e activador da transcrição 3 (STAT3) é muitas vezes constitutivamente activa no cancro pancreático, e desempenha um papel importante na sobrevivência de células de cancro do pâncreas e metástase. Curiosamente, a inibição da PKCζ significativamente reduzida ativação STAT3 constitutiva em células de câncer de pâncreas

in vitro

e

in vivo

. inibição farmacológica da STAT3 imitou o fenótipo de inibição PKCζ, e expressão de uma construção de STAT3 constitutivamente activa resgatou o fenótipo transformado em células PKCζ-deficiente. Concluímos que PKCζ é necessária para o crescimento de células transformadas cancro do pâncreas e invasão in vitro e a tumorigénese in vivo, e que a STAT3 é um importante mediador a jusante dos efeitos pró-carcinogéneos de PKCζ em células de cancro do pâncreas

citação.: Butler AM, Scotti Buzhardt ML, Li S, Smith KE, Campos AP, Murray NR (2013) proteína quinase C Zeta Regula celular do cancro do pâncreas humano transformado Crescimento e invasão através de um mecanismo STAT3-dependente. PLoS ONE 8 (8): e72061. doi: 10.1371 /journal.pone.0072061

editor: Jingwu Xie, da Escola de Medicina da Universidade de Indiana, Estados Unidos da América

Recebido: 16 de maio de 2013; Aceito: 05 de julho de 2013; Publicação: 28 de agosto de 2013

Direitos de autor: © 2013 Butler et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Subvencionado por: NIH /NCI R03 CA143164, NIH /NCI R01CA140290 (NRM), Daniel Foundation of Alabama pós-doutorado (MLS), NIH /NCI F31 CA168117 (AMB), NIH /NCI R01 CA081436-16 (APF), a Clínica Mayo Foundation (NRM, APF). APF é a Monica Flynn Jacoby Endowed Professor de Pesquisa do Câncer. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Os autores têm as seguintes participações: A patente provisória relacionada a essa pesquisa foi arquivado (MSB, APF, NRM, métodos e materiais para tratamento de câncer de pâncreas, Pedido de Patente US # 20110190390). Co-autor Alan Fields é um editor Acadêmico de PLOS ONE. Não há mais patentes, produtos em desenvolvimento ou produtos comercializados a declarar. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

O câncer de pâncreas é o décimo câncer mais comumente diagnosticado em os EUA, e ocupa a quarta posição letalidade [1]. A taxa de sobrevida em 5 anos global do câncer de pâncreas é inferior a 5% e não melhorou significativamente ao longo dos últimos 30 anos. A letalidade do câncer de pâncreas é atribuída em parte à resistência às quimioterapias atuais [2]. Caracterização de novos caminhos de sinalização oncogénica cancro do pâncreas podem levar à identificação de alvos terapêuticos mais eficazes para o tratamento do cancro do pâncreas.

Proteína Quinase C (PKC) foi implicada na tumorigénese para mais de 30 anos, desde que foi primeiro caracterizado como um receptor para os ésteres de forbol promovendo tumor [3]. PKC é agora conhecido por ser uma família de isoformas relacionadas, e estudos recentes têm caracterizado os papéis específicos de isoformas individuais na susceptibilidade a, e o desenvolvimento de câncer [4], [5], [6], [7], [8 ], [9], [10]. Embora membros da PKC atípica (aPKC) sub-família de isoformas de PKC são incapazes de se ligar e ser activado por ésteres de forbol, o seu potencial papel no fenótipo do cancro também tem sido investigada. Os dois aPKCs, PKC iota (PKCι) e zeta PKC (PKCζ), são estruturalmente semelhantes; no entanto, knockout embrionária de cada aPKC revela fenótipos únicos, sugerindo funções não redundantes em desenvolvimento e câncer [11], [12]. PKCι promove o desenvolvimento de câncer em modelos de ratos com câncer de pulmão e cólon, e é um oncogene no cancro do pulmão e ovário [5], [6], [13], [14], [15]. Do mesmo modo, temos demonstrado um papel pro-cancerígenos para PKCι em células de cancro pancreático [16]. Em contraste, ambos os papéis PROMOTIVE tumor e supressores de tumores têm sido atribuídas a PKCζ [4], [17], [18], no entanto o seu papel no cancro pancreático não foi avaliada. No presente estudo, mostramos que PKCζ é elevado num subconjunto de tecidos humanos de tumor pancreático em comparação com epitélio pancreático normais combinados. Além disso, demonstra-se que a inibição da PKCζ em células de cancro do pâncreas prejudica significativamente o fenótipo do cancro. Os nossos dados também identificar STAT3 como um mediador importante de PKCζ no crescimento transformado e invasão de células de cancro do pâncreas.

instrução Ética Materiais e Métodos

Biospecimens foram obtidos a partir da Registro Tissue Mayo Clinic ao abrigo de um protocolo Mayo Clinic Institutional Review Board aprovado. Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê Animal Care e Use a Mayo Clinic Institucional.

As amostras dos pacientes

RNA foi isolado a partir de um conjunto de amostras de doentes com adenocarcinoma do pâncreas para os quais congelada, tumor emparelhado e não tecido do tumor do pâncreas estava disponível como descrito [16]. Hematoxilina e eosina (H E) -stained seções do tumor combinados e, não tumorais tecidos pancreáticos adjacentes foram analisadas para confirmar a histologia apropriado

Reagentes e cultura de células

células de câncer pancreático humano. linhas foram adquiridas da American Type Culture Collection e todas as experiências foram realizadas com células de subculturas menos de 6 meses. linhas celulares de cancro pancreático humano foram mantidas em 5% de CO

2 humidificada incubadora de cultura de tecidos em DMEM com FBS a 10%, tal como recomendado pela American Type Culture Collection. Os anticorpos foram obtidos a partir das seguintes fontes: PKCζ, β-actina, fosfo-STAT3 (Y705), STAT3, fosfo-ERK1 /2, ERK1 /2 e clivada da caspase-3 (Cell Signaling Technologies), PKCι (BD Transduction Laboratories), 5-bromo-2′-desoxiuridina (BrdUrd) (DakoCytomation) e FLAG (Sigma Life Sciences).

isolamento do RNA e quantitativa PCR em tempo real

O RNA total foi isolado utilizando o kit de isolamento RNAqueous (Ambion) de acordo com os protocolos do fabricante. foram usados ​​Gene TaqMan® primers Expression Assay e sonda conjuntos (Applied Biosystems) em tempo real, análise de PCR quantitativo (qPCR) de hGAPDH (Hs99999905_m1), hPKCζ (Hs00177051_m1) e 18S (Hs99999901_s1). qPCR análises foram realizadas utilizando 10 ng de ADNc (GAPDH e hPKCζ) ou 2 ng de ADNc (18S) num Applied Biosystems 7900 termociclador. Os dados foram avaliados utilizando o pacote de software SDS 2.3. a expressão do gene em tumores pancreáticos e em linhas celulares de cancro pancreático foi normalizado para GAPDH e 18S, respectivamente. Todos os dados são expressos como 2

– (

CT

(alvo) –

CT

(referência endógena)).

A imuno-histoquímica e análise de expressão

Os tecidos foram processados ​​para análise imuno-histoquímica (IHC) como descrito anteriormente [19]. PKCζ e fosfo-STAT3 coloração foi visualizada usando o Envision mais anti-coelho marcado com HRP-polímero (Dako). As imagens foram capturadas usando Aperio ImageScope e analisados ​​com software Aperio Spectrum.

A inibição da expressão PKCζ

lentivirais expressando interferência curto RNA hairpin (RNAi) As construções de direccionamento PKCζ humanos foram gerados e utilizados para obter estável transfectantes como descrito anteriormente [20]. PKCζ ARNi # 1 construto tem como alvo uma sequência na região de codificação de PKCζ (GTTGTTCCTGGTCATTGAGTA) e PKCζ ARNi # 2 construto tem como alvo uma sequência na região não traduzida 3 ‘de PKCζ (GACAGACGCTTGCGCCGAGAC). populações de células que transportam as construções de lentivirais foram seleccionadas e mantidas por inclusão de puromicina no meio de cultura.

quantificação celular ensaio

A viabilidade celular foi avaliada por um ensaio MTT (CellTiter 96 Aqueous One Solution, Promega) , tal como recomendado pelo fabricante. células de cancro do pâncreas, Panc-1 (1 × 10

3 células /poço) e MiaPaCa-2 (1 × 10

2 células /poço) foram cultivadas numa placa de 96 poços durante 1, 3, 5 e 7 dias antes do ensaio.

a morte celular ensaio

a morte celular foi testada usando o celular ensaio de morte detecção ELISA Plus (Roche) de acordo com o protocolo do fabricante.

Anchorage- Os ensaios de crescimento independente

Panc-1 e células MiaPaCa-2 (5 x 10

3) foram plaqueadas em agar mole e avaliada para o crescimento independente de ancoragem, como descrito anteriormente [21].

modelo de tumor ortotópico

Panc-1 células cancerosas pancreáticas humanas (1 × 10

6) transportando um vector que codifica a luciferase do pirilampo retroviral pSIN-Fluc [22] e que manifestou o NT [16] ou PKCζ RNAi foram misturou-se com o factor de crescimento reduzida de Matrigel (Becton Dickinson) e injectado no pâncreas proximal de murganhos de 4-6 semanas de idade atímicos macho (

N

= 16). Todas as cirurgias foram realizadas sob anestesia de isoflurano, e os ratinhos foram administrados como um analgésico de buprenorfina imediatamente antes e ~18 horas após a cirurgia, para minimizar o desconforto dos animais. ratinhos portadores de tumor foram monitorizados diariamente para sinais de sofrimento e duas vezes por semana para perda de peso. O crescimento do tumor foi monitorizado semanalmente por imagiologia de fluorescência. Resumidamente, os ratinhos foram injectados intraperitonealmente com uma solução de D-luciferina (Xenogen) a uma dose de 150 mg /kg de peso corporal, anestesiados com isoflurano e fotografada utilizando um sistema de imagem de bioluminescência (Caliper Life Sciences-Xenogen, Hopkinton, MA). Uma hora antes do sacrifício, os ratos foram injectados por via intraperitoneal com 100 mg /kg BrdUrd.

tumor ortotópico análise

Os tumores de murganhos injectados com células PKCζ de ARNi foram fixadas em formalina e analisados ​​para a proliferação (BrdUrd incorporação) por imuno-histoquimica (IHC), tal como anteriormente descrito para NT ARNi tumores [16]. A apoptose foi avaliada por detecção da clivagem de caspase-3, como descrito anteriormente [19], [23]. de necrose de tumor foi identificado em H E de tecido manchado. software Spectrum foi usado para calcular a percentagem de área do tumor necrosado dividindo-se a área do tumor necrosado em área total do tumor. metástases tumorais foram identificadas por avaliação anatómica bruto de abdominais e torácicas órgãos após a conclusão do estudo, e verificada por H E coloração das lesões metastáticas, tal como descrito para os tumores NT ARNi [16]

ensaio de invasão celular

invasão celular foi ensaiada utilizando câmaras de invasão de Matrigel-revestidas (BD Biosciences) de acordo com o protocolo do fabricante. Resumidamente, 5 x 10

4 células de cancro pancreático humano foram plaqueadas em meio isento de soro na câmara superior, e DMEM contendo 2,5% de FBS foi usado como o quimioatractivo na câmara inferior. As células foram deixadas a invadir durante 24 horas a 37 ° C e as células foram então fixadas, coradas e quantificada como descrito anteriormente [20].

Expressão da STAT3 constitutivamente activa (STAT3-C)

As células foram infectadas com adeno-nulo ou FLAG marcado-adeno-STAT3-C [24]. A expressão da proteína foi determinada por análise de imunotransf erência de lisados ​​de células totais. A análise de imunotransferência foi realizada em células isoladas a 60-80% de confluência.

A análise estatística

Two-way ANOVA e Student

t

-test foram usadas para avaliar a significância estatística dos resultados.

p

. 0,05 foi considerado estatisticamente significativo

Resultados

PKCζ é elevada em um subconjunto de tumores pancreáticos humanos

Começamos nosso estudo avaliando PKCζ expressão em tumores pancreáticos humanos primários e tecido circundante não tumoral (Figura 1). As informações clínicas e demográficas para esta população de pacientes é publicado [16]. detecção imuno-histoquímica da proteína PKCζ em tecidos tumorais pancreáticas representativos revelou um nível de expressão variável PKCζ que se localizou a ambos o núcleo e no citoplasma (Figura 1A). PKCζ expressão foi também detectada a um nível variável, mas inferior em não-tumoral, os tipos de células pancreáticas (Figura 1B). Ilhotas e acinar células do pâncreas não-tumor mostraram baixa expressão PKCζ (Figura 1B, painéis da esquerda). A expressão de PKCζ em células ductais foi semelhante ou ligeiramente maior do que, a expressão em células de ilhéus e acinares (Figura 1B, painéis direitos). A seguir avaliada a expressão de ARNm em PKCζ um painel de adenocarcinoma pancreático humano 28 emparelhado e adjacente, pâncreas não-tumor. a expressão de ARNm PKCζ foi detectada em todos os 28 tumores pancreáticos primários analisados ​​(dados não mostrados). Análise de amostras emparelhadas revelou que a expressão PKCζ foi significativamente maior nos tumores do que em emparelhado tecido, não-tumorais (Figura 1C). a expressão de ARNm PKCζ foi significativamente elevados em 25% dos tumores do pâncreas, em comparação com a expressão de ARNm PKCζ média no pâncreas não-tumoral, e não há tumores exibiram uma redução significativa na expressão de ARNm de PKCζ (Figura 1D). A análise da relação entre a expressão do ARNm PKCζ e a sobrevivência do paciente foi realizado, mas neste pequeno coorte foi observada nenhuma correlação

A e B) de detecção de expressão de IHC PKCζ em tumores pancreáticos humanos representativos (A;. Tumor) e tecido adjacente não-tumoral (B; normal). B) Cortes seriados corados com H E são fornecidas para diferenciar acinar, ilhéu (imagem superior esquerda, ilhotas pancreáticas é descrito) e células ductais (top imagem à direita). Todas as imagens no mesmo painel são a mesma ampliação. Barras = 100 fim. C) A análise quantitativa por PCR da expressão de ARNm PKCζ foi realizada em 28 amostras de adenocarcinoma pancreático e não-tumorais do doente correspondentes. expressão PKCζ foi normalizado para 18S abundância; * P = 0,001 calculada pela emparelhado

t

-teste. D) PKCζ expressão é significativamente elevada em um subconjunto de tumores pancreáticos. PKCζ foi sobre-expresso em 25% dos tumores pancreáticos analisados, tal como definido pela abundância de ARNm de tumor maior do que 2 desvios-padrão acima da média de ARNm PKCζ abundância em todas as amostras de tumor de pâncreas não-adjacentes.

regula o PKCζ fenótipo transformado das células de cancro do pâncreas in vitro

para avaliar directamente o papel de PKCζ no fenótipo do cancro do pâncreas, utilizou-se duas construções diferentes de ARNi para inibir a expressão PKCζ em duas linhas celulares de cancro bem caracterizados humanos pancreáticos, Panc- 1 (Figura 2A) e MiaPaCa-2 (Figura S1A). populações de células seleccionadas de forma estável consistentemente apresentaram 70% ou mais de inibição da expressão de ARNm PKCζ, com uma diminuição correspondente na expressão da proteína PKCζ (Figura 2A e S1A). Selectividade do ARNi PKCζ-alvo construções é confirmado pela falta de efeito destas construções sobre a expressão da intimamente relacionada isozima PKCι atípica (Figura 2A e S1A). A inibição da expressão PKCζ resultou num pequeno decréscimo, mas significativo, no registo de fase, o crescimento de células aderentes (Figura 2B e S1B) e um aumento na morte de células basais (Figura 2C). Além disso, PKCζ knock down (KD) diminuiu significativamente o crescimento de células de cancro pancreático independente de ancoragem (a formação de colónias de agar mole) (Figura 2D e S1C), indicando que PKCζ é crítica para a sobrevivência de células do cancro pancreático e do fenótipo transformado.

células Panc-1 transportando estavelmente lentivírus expressando quer controle, não-alvo (NT) ou PKCζ de metas de RNAi (Z1 e Z2) foram avaliados para a) a expressão da proteína PKCζ e PKCι por análise de imunotransferência (em cima), e mRNA PKCζ abundância por análise qPCR (parte inferior); B) a viabilidade das células (MTT ensaio colorimétrico); C) morte celular (detectado por ELISA Cell Death Detection) e D) o crescimento independente de ancoragem (a formação de colónias em agar mole). Para cada uma das barras do painel = média de 3 ou mais repetições ± DP e gráfico é representativa de 3 ou mais experiências independentes. * P . 0,05 vs NT

PKCζ desempenha um papel crítico na tumorigênese pancreático

A seguir, investigou o efeito da PKCζ KD sobre a formação de tumor pancreático e crescimento usando um Panc- descrito anteriormente 1 modelo de tumor ortotópico [16]. Panc-1 de células que expressam o gene de luciferase de pirilampo (pSIN-Fluc) e ou NT ou PKCζ ARNi foram injectados no pâncreas de ratinhos nus para formar tumores ortotópicos. O crescimento do tumor foi monitorizado por detecção de bioluminescência (Figura 3A), e os ratinhos foram colhidos 5 semanas após a inoculação. formação do tumor foi observada em todos os ratinhos injectados com células Panc-1 que expressam tanto ARNi construir; No entanto, o peso final pâncreas foi significativamente menor em ratinhos portadores de tumores PKCζ ARNi, devido à redução do tamanho do tumor (Figura 3B e 3C). Colocámos a hipótese de que, semelhante ao efeito de PKCζ KD in vitro (Figura 2B-D), o tamanho do tumor reduzido de células KD PKCζ Panc-1 in vivo era devido à proliferação das células do tumor e reduziu a morte celular tumoral melhorada. O nível de incorporação BrdUrd, uma medida da proliferação do tumor, foi avaliada em Panc-1 e ARNi PKCζ tumores em comparação com o nível de incorporação BrdUrd em Panc-1 tumores NT ARNi [16]. Como previsto, a proliferação do tumor foi significativamente reduzido em tumores PKCζ de ARNi em comparação com tumores de ARNi NT (Figura 4A). Curiosamente, não foi observado um efeito significativo de PKCζ KD na apoptose de tumor, detectado por caspase-3 (Figura 4B). No entanto, os tumores de ARNi PKCζ tinha um nível significativamente mais elevado de necrose de tumores NT RNAi (Figura 4C e 4D). resultados de necrose tumoral a partir de uma acumulação de morte de células tumorais, o que pode ocorrer quando um tumor supera o seu fornecimento de sangue. Embora os tumores PKCζ RNAi são drasticamente menor do que os tumores de ARNi NT, eles não apresentam uma diminuição no tumor densidade de vasos sanguíneos tal como quantificado por coloração de CD31 (Figura 4E). Estes dados sugerem que o volume do tumor reduzido de tumores pancreáticos PKCζ ARNi é o resultado do efeito cumulativo da diminuição da proliferação e sobrevivência celular ao longo do tempo da experiência in vivo.

A) imagiologia bioluminescente representativas de murganhos com tumores pancreáticos ortotópicos Panc-1 NT e PKCζ RNAi. B) Representante H E seções manchadas de tumores pancreáticos ortotópicos Panc-1 NT e PKCζ RNAi. O pâncreas de camundongos normais restante é circulado em azul. C) Inibição de PKCζ diminuiu significativamente o peso do tumor do pâncreas e ortotópico; n = 16; * P . 0.001

A) Análise quantitativa da proliferação do tumor detectado por BrdUrd incorporação; * P 0,003. B) A análise quantitativa da apoptose tumoral detectada por caspase-3 clivada coloração. C) Representante H E manchado tumores pancreáticos ortotópicos Panc-1 NT e PKCζ RNAi com áreas de necrose identificados (contorno amarelo) (bar = 1 mm). linha verde delineia tecido tumoral. D) A análise quantitativa de necrose tumoral plotado como percentagem da área total do tumor; * P 0,0002. E) Análise quantitativa da vascularização do tumor, tal como determinado pela área percentual CD31 coloração. A-E)

n

= 16 tumores NT RNAi e 15 tumores PKCζ RNAi. F) 1 Panc-NT e as células PKCζ RNAi (Z1 e Z2) foram avaliados quanto à invasão celular por meio de câmaras de matrigel-revestidos. Barras = média de 3 ou mais repetições +/- SD e gráfico é representativa de 2 ou mais experiências independentes. * P . 0,05 vs NT

PKCζ desempenha um papel importante na invasão de células do câncer de pâncreas

No modelo de tumor pancreático ortotópico, as células Panc-1 formam ambos os tumores primários e lesões metastáticas [16]. Metástases para o rim, o fígado, o diafragma, e o mesentério foi observado em mais de 50% dos ratinhos com tumores NT RNAi (Tabela 1, [16]). Em contraste, nenhuma metástase tumoral ao mesentério ou diafragma foi identificada em ratos portadores de tumores PKCζ ARNi; apenas 2 de 15 ratos portadores de tumores PKCζ RNAi (13%) tinham metástases para os seus rins, e apenas 1 de 15 ratos portadores de tumores PKCζ RNAi (6%) teve uma metástase hepática (Tabela 1). Estes dados são consistentes com um efeito inibidor de PKCζ KD nas metástases de tumor pancreático. No entanto, não se pode descartar a possibilidade de que a metástase diminuição observada em tumores PKCζ RNAi pode ser secundária ao tamanho significativamente reduzido dos tumores. Se PKCζ regula a metástase do tumor in vivo, é provável que também regulam aspectos do fenótipo metastático, tais como invasão celular, in vitro. Com efeito, invasão celular foi significativamente reduzido em células PKCζ ARNi, quando em comparação com células de cancro do pâncreas NT RNAi (Figura 4F e S2). Estes resultados demonstram um papel para PKCζ na invasão de células do cancro do pâncreas, e são consistentes com um papel para PKCζ no fenótipo metastático de células cancerígenas pancreáticas in vivo.

PKCζ regula a activação da STAT3

transdutor de sinal e activador de transcrição-3 (STAT3) é um factor de transcrição que integra vários sinais extracelulares para regular processos celulares promotoras de cancro [25], [26]. activação STAT3 constitutiva é uma marca registrada de muitos cancros humanos, incluindo o cancro do pâncreas [27]. activação STAT3 promove o fenótipo oncogénico de câncer pancreático, e perda de STAT3 impede o desenvolvimento do câncer de pâncreas e progressão em um modelo de mouse

Kras

câncer de pâncreas mediada [27], [28]. Além disso, a inibição da actividade de STAT3 nas células de cancro do pâncreas, também reduz a sobrevivência celular, invasão e crescimento tumoral [28], [29]. Dada a semelhança entre o fenótipo relatado de inibição STAT3 e o fenótipo foi observado com a inibição da PKCζ, pedimos se a expressão PKCζ regula a atividade STAT3 em linhas celulares de cancro do pâncreas. Observou-se uma redução significativa na ativação STAT3, detectado como fosforilação de STAT3 em Tyr705, em células de câncer de pâncreas expressam PKCζ RNAi (Figuras 5A e S3A). Além disso, a activação da STAT3 foi significativamente reduzido em tumores PKCζ de ARNi quando comparados com os tumores de ARNi NT (Figura 5b), o que indica que PKCζ regula a activação da STAT3 em células de cancro do pâncreas, tanto in vitro e in vivo. Desde PKCζ também tem sido implicado na regulação da ERK1 2 activação /em cancerosas e células não cancerosas tipos [30], [31], [32], [33], analisou-se o efeito de PKCζ RNAi em ERK1 /2 de fosforilação em células de cancro pancreático humano. Ao contrário da STAT3 fosforilação, ERK1 /2 fosforilação não foi alterado por uma redução significativa na expressão PKCζ (Figuras 5A e S3A), sugerindo que a expressão PKCζ não regula a sinalização através da via de ERK1 /2 de sinalização.

A) Inibição de expressão PKCζ diminui activação constitutiva de STAT3 (detectado como fosfo-STAT3 Y705), mas não de ERK1 /2 de activação (detectado como fosfo-ERK1 /2). A análise de imunotransferência foi realizada em lisados ​​celulares totais de células PKCζ RNAi (esquerda) e análise de detecção de immunoblot expressão Panc-1 NT e foi realizada (à direita)

n

= 3. B) Detecção Representante IHC de p-STAT3 em tumores pancreáticos ortotópicos Panc-1 NT e PKCζ RNAi (à esquerda), bar = 50 mm. A análise quantitativa de coloração IHC pSTAT3 (à direita). C-E) O efeito inibidor de STAT3 (S3I-201) em C) fosforilação STAT3, D) o crescimento independente da ancoragem em ágar mole e E) invasão celular através de câmaras de matrigel-revestidos. Em todos os ensaios, S3I-201 foi utilizado em 100 ^ m e um volume igual de DMSO utilizada como diluente de controlo. Para o ensaio de invasão, as células foram pré-tratadas com S3I-201 ou DMSO durante 48 horas antes do início do ensaio. Barras = média de 3 ou mais repetições +/- DP, e gráfico é representativa de 2 ou mais experiências independentes. * P . 0,05

inibição STAT3 reduz o fenótipo transformado de células de câncer de pâncreas

Para determinar se reduziu a ativação STAT3 pode ser responsável por alguns dos efeitos da PKCζ KD, avaliamos o efeito de um inibidor da STAT3 farmacológica sobre o fenótipo transformado das células de cancro do pâncreas. O tratamento de células de cancro do pâncreas com S3I-201, uma molécula pequena que perturba as interacções da STAT3-SH2-fosfo tirosina [34], reduziu a activação da STAT3 (Figura 5C e S3B) e reduziu significativamente o crescimento (Figuras 5D) independente de ancoragem e invasão celular ( Figura 5E e S3C), semelhante ao efeito de inibição PKCζ. Tomados em conjunto, estes dados demonstram que a inibição da expressão PKCζ reduz a actividade da STAT3 em células de cancro do pâncreas, e que a actividade de expressão PKCζ e STAT3 regular positivamente o crescimento das células transformadas e invasão do cancro do pâncreas.

STAT3 constitutivamente activa pode reconstituir o fenótipo transformado em PKCζ RNAi células cancerosas no pâncreas

Para testar a hipótese de que STAT3 é um efector a jusante crítica de PKCζ em células de câncer de pâncreas, avaliamos se a expressão de uma construção STAT3 constitutivamente activo (STAT3-C) poderia resgatar os efeitos da PKCζ inibição em células Panc-1. células Panc-1 e NT PKCζ de ARNi foram infectadas com adenovírus expressando marcado com FLAG, o adenovírus de controlo (nulo) STAT3-C ou (Figura 6A). Expressão da STAT3-C recuperado significativamente o crescimento independente de ancoragem de células Panc-1 PKCζ ARNi, sem afectar significativamente o crescimento independente de ancoragem de células NT RNAi (Figura 6B). Além disso, a reduzida fenótipo invasão celular de células PKCζ ARNi foi significativamente recuperados por expressão da STAT3-C (Figura 6C). Tomados em conjunto, estes dados demonstram que o aumento da atividade STAT3 celular pode resgatar o fenótipo anti-oncogénica das células PKCζ RNAi, e demonstrar que PKCζ medeia a transformação de células de câncer pancreático, pelo menos em parte, através da regulação da atividade STAT3.

células Panc-1 expressando NT ou PKCζ RNAi foram infectadas com construções adenovirais que expressam quer nula (controle), ou constitutivamente activa, FLAG-marcado STAT3 (STAT3-C). A) Análise de imunotransferência de p-STAT3, STAT3, FLAG, PKCζ e expressão β-actina. As células foram avaliadas para B) o crescimento independente de ancoragem em ágar mole e C) invasão celular através de câmaras de matrigel-revestidos. Para cada gráfico: Barras = média de 3 ou mais repetições ± DP e gráfico é representativa de 2 ou mais experiências independentes. * Significativamente reduzida em comparação com NT /null, p 0,05; ** Aumentou significativamente em comparação com tratados com null, p . 0,05

Discussão

Estudos funcionais têm demonstrado que o papel de PKCζ na regulação do fenótipo do câncer varia de acordo com o tipo de tumor, modelo sistema e estágio da doença. Por exemplo, a inibição da expressão PKCζ em uma linha de células de cancro do cólon em tamanho reduz a proliferação in vitro e in vivo do tumor; No entanto, a inibição genética de PKCζ no epitélio intestinal de rato não afecta o modelo de tumorigénese em APCmin /+ rato de início e progressão do cancro intestinal [7], [35]. Em contraste, a inibição da genética PKCζ num modelo de ratinho de

Kras

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induzida tumorigénese pulmão revela um papel supressor de tumores [4], enquanto que a inibição da expressão PKCζ em células de cancro do pulmão não tem efeito sobre transformado crescimento in vitro [20]. No presente estudo, avaliamos o papel específico de PKCζ na biologia de células de câncer de pâncreas, usando RNAi específicos de isotipos PKC para inibir a expressão PKCζ. Nós demonstramos que PKCζ KD reduziu a proliferação de células de cancro do pâncreas e a sobrevivência das células in vitro. Mostramos ainda que PKCζ KD em células de cancro do pâncreas reduziu significativamente o crescimento transformado in vitro, correspondente a uma redução significativa no tamanho do tumor in vivo. Estes dados sugerem fortemente que PKCζ é necessária para a manutenção do fenótipo transformado de células de cancro do pâncreas.

PKCζ tem sido implicado no fenótipo invasivo de cancros humanos [36], [37], [38]. RNAi-mediada, a inibição específica de PKCζ reduz o cancro da mama e a invasão de células de glioblastoma in vitro [37], [38] e reduz a invasão de células do cancro da próstata in vitro e in vivo [36]. Interessantemente, cada um destes atributos PKCζ relatórios para uma via de sinalização distinta invasiva, o que sugere um papel para PKCζ ampla na invasão de células de cancro [36], [37], [38]. Consistente com o fenótipo observado em outros cancros, determinou-se que a inibição da expressão PKCζ não só inibiu o crescimento de células transformadas com cancro pancreático, mas também reprimido seu potencial invasivo in vitro. Além disso, PKCζ KD reduziu significativamente a metástase do tumor do pâncreas, indicando que PKCζ regula a invasão da célula tumoral pancreática in vivo, assim como in vitro

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O valor prognóstico da expressão PKCζ no cancro não está bem documentada. No entanto, vários relatórios recentes têm implicado PKCζ como um preditor de mau prognóstico para pacientes com câncer. Alta PKCζ prevê pior sobrevida específica da doença de pacientes com sarcoma dos tecidos moles [39]. Da mesma forma, PKCζ é elevada no cancro da próstata, e elevada expressão PKCζ prevê pior sobrevida de pacientes com câncer de próstata [36]. Nós avaliamos a expressão de PKCζ em câncer pancreático, e determinou que PKCζ foi claramente elevada em um sub-conjunto dos cânceres de pâncreas. No entanto, o nosso pequeno tamanho da amostra juntamente com o mau prognóstico global de pacientes com câncer pancreático impedido determinação de uma eventual papel prognóstico de expressão PKCζ. colecções de tecidos em curso irá facilitar futuras investigações da capacidade de expressão PKCζ para prever o resultado em uma coorte maior de pacientes com câncer pancreático.

Enquanto expressão PKCζ tem sido caracterizada recentemente para ser elevada e prever a sobrevivência pobre em vários tipos de câncer [36 ], [39], pouco se sabe sobre a regulação da expressão PKCζ. No entanto, PKCζ foi mostrado para ser activada por várias vias de sinalização conhecidos para promover a sinalização oncogénica em cancro do pâncreas. Fosfatidilinositol-3,4-5-trifosfato (PtdIns-3,4,5-P3), o produto da fosfoinositida 3-cinase, pode ligar-se e activar directamente PKCζ, e também activa PtdIns-3,4,5-P3-activada cinase 1 mediada por fosforilação dependente de fosfoinositida e activação de PKCζ [40], [41], [42]. Na cabeça e pescoço células de carcinoma epidermóide, PKCζ é a tirosina fosforilada e activada por receptor do factor de crescimento epidérmico [31]. Estudos futuros irá investigar se qualquer um desses caminhos, ambos freqüentemente desregulada em câncer pancreático, modula PKCζ sinalização em linhas celulares de cancro do pâncreas.

Em contraste com a nossa observação de que a inibição da PKCζ reprimido o crescimento do tumor pancreático e metástase, a inibição genética de PKCζ em

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induzida por tumores de pulmão promove o crescimento e progressão tumoral [4]. O papel de supressor de tumor do pulmão PKCζ na tumorigénese-K-ras mediadas é mediada pela repressão da activação da STAT3 nas células tumorais [4].