Abstract

truncando mutações germinativas no gene supressor de tumores BRCA-1 associado a proteína-1 (

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) têm sido relatados em famílias com predisposição para o desenvolvimento de uma ampla gama de diferentes tipos de cancro incluindo melanoma uveal e melanoma cutâneo. Também houve uma associação entre o desenvolvimento do tumor amelanotic e germinal

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mutação sugerindo uma possível característica fenotípica de

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portadores da mutação. Embora tenha havido muitos tipos de câncer associado à linha germinal

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mutação, o espectro completo de associação a doença ainda está para ser determinado. Aqui nós descrevemos uma família dinamarquesa com melanoma uveal predominantemente mas também uma série de outros tipos de tumores, incluindo pulmão, neuroendócrino, estômago e câncer de mama; bem como lesões pigmentadas da pele. Whole-exome sequenciação identificado um

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mutação de splicing situado no c.581-2A L, o que leva a uma truncagem prematura de

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num indivíduo com melanoma uveal. Esta mutação foi realizada por vários outros membros da família com melanoma ou vários cancros. A descoberta expande o perfil crescente de

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como um uveal importante e gene supressor de tumor melanoma cutâneo e implica o seu envolvimento no desenvolvimento do pulmão e cancro do estômago

Citation:. Aoude LG, Wadt K, Bojesen A, D Crüger, Borg Å, Trent JM, et ai. (2013) A

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mutação em uma família dinamarquesa predispõe a Uveal melanoma e outros cânceres. PLoS ONE 8 (8): e72144. doi: 10.1371 /journal.pone.0072144

editor: Soheil S. Dadras, da Universidade de Connecticut Health Center, Estados Unidos da América

Recebido: 27 de fevereiro de 2013; Aceito: 05 de julho de 2013; Publicação: 19 de agosto de 2013

Este é um artigo de acesso aberto, livre de todos os direitos autorais e pode ser livremente reproduzido, distribuído, transmitido, modificado, construído em cima, ou de outra maneira usado por qualquer pessoa para qualquer finalidade lícita. O trabalho é feito disponível sob a dedicação de domínio público da Creative Commons CC0

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pela Research Alliance Melanoma, Cancer Society sueco, o Conselho de Pesquisa sueco, o Kamprad Fundação Berta, o Nacional de Saúde and Medical Research Council (NHMRC) da Austrália, ea Luta em Prol da Visão, na Dinamarca. NKH e LGA receber apoio salário através de um Diretor Sênior NHMRC Research Fellowship e ANZ Ph.D. bolsa de estudos, respectivamente. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

BRCA-1 associado a proteína-1 (

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) é um gene supressor de tumor localizado no cromossoma 3, uma região que tem sido associada ao melanoma uveal (UMM). No primeiro relatório para fazer uma associação entre

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verificou-se ser o único gene que foi mutado no cromossoma 3 em cada uma destas amostras e ambas as mutações conduziu ao truncamento da proteína. Em seguida, eles interrogaram 57 tumores UMM utilizando sequenciamento Sanger e descobriu que

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mutações ocorreram predominantemente em tumores que tinham metástase. No geral, 26/31 das metástases de tumores (alto risco) tinha inativação

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mutações somáticas em comparação com apenas 1/26 do grupo de baixo risco (não metastático). Para as 20 amostras com uma amostra de DNA normais combinados, quase todos

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mutações foram encontradas a ser adquirida somática, a exceção de um único caso com uma mutação frameshift linha germinal correspondente. Esta mutação introduzida a possibilidade de que

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defeitos poderiam predispor a UMM. Comandando a partir do estudo de Porto et. al., diversos grupos têm olhou para o risco de doença conferida pela linha germinal

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mutação. Testa e colegas investigaram

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mutações em duas famílias americanas apresentam com mesotelioma e que não teve contato com qualquer um dos fatores de risco ambientais conhecidos para esta doença [2]. Eles encontraram duas mutações diferentes de enquadramento na

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responsáveis ​​pelo elevado risco de mesotelioma nestes indivíduos. Curiosamente, essas famílias também apresentou com uma gama de cancros que incluíam UMM e melanoma cutâneo (CMM). Um segundo estudo também apoiou estas conclusões interrogando ADN da linha germinativa de uma família que se apresentou com mesotelioma, meningioma e UMM [3]. Nesta família, uma mutação nonsense causada truncagem prematura da proteína BaP1 em portadores. Um relatório da Wiesner mostrou

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mutações em duas famílias que tiveram uma síndrome autossômica dominante caracterizada por UMM, CMM e nevos melanocíticos benignos atípicos [4]. As duas famílias com mutações frameshift apresentados únicas que co-segregou com o fenótipo da doença. Em um relatório de acompanhamento, Wiesner e seus colegas identificaram uma terceira família com um

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mutação que co-segregou com mesotelioma e também mostrou evidências de uma lesão melanocítica em um portador de mutação [5]. Outros grupos também têm descrito

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mutações em indivíduos que apresentam tumores intradérmicos atípicos, propondo que estas lesões podem ser uma característica fenotípica de

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portadores da mutação [6], [7]. Um estudo recente de irmãos portugueses com subtipo raro de mesotelioma epitelióide descobriu uma linha germinal

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mutação como a possível causa do agrupamento familiar conhecida apenas de mesotelioma papilífero bem diferenciado. Notavelmente um dos irmãos também desenvolvido UMM [8]. Recentemente, uma mutação de emenda críptica em

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foi encontrado para co-segregar em uma família dinamarquesa com UMM, paraganglioma e atípica CMM [9].

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mutação tem também sido implicada no desenvolvimento de carcinoma de células renais e alguns dos parentes destes casos tiveram UMM ou CMM também [10]. Como evidenciado pela literatura, há um espectro grande tumor que aparece para acompanhar

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mutação germinativa.

Neste artigo relatamos uma família dinamarquesa predispostas a desenvolver UMM predominantemente mas também apresenta um ampla gama de tumores aparentemente não relacionados. Há 7 membros da família que tiveram UMM, com a idade mais jovem de início ser 20. Uma desenvolvido UMM com a idade de 30 e mais tarde passou a desenvolver cancro da mama aos 45 anos lá é um indivíduo com cancro do pulmão que tinha dois filhos que desenvolveu melanoma, um UMM e o outro CMM. Outro indivíduo desenvolveu UMM com a idade de 69 e tem dois filhos que foram diagnosticados com UMM em idades 27 e 41. Há uma única instância de infiltrativa difusa câncer gástrico e este indivíduo também teve um filho com UMM, diagnosticado aos 57 anos Finalmente , outro caso de UMM foi diagnosticado aos 56 anos Consulte a Figura 1 para uma linhagem familiar que identifica a história de câncer de cada indivíduo.

nos indivíduos de raça que têm melanoma uveal (UMM) são representados por círculos pretos (feminino) ou caixas (masculinos) e indivíduos com melanoma cutâneo (CMM) são indicados por círculos ou caixas cinzentas. A idade de diagnóstico de cada melanoma está indicada entre parêntesis. Uma linha através de um símbolo indica que a pessoa está já falecido. Se uma pessoa carrega o

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mutação de emenda é indicado por um ‘M’ e se eles são do tipo selvagem para esta variante é indicado com um ‘WT’. Quando o estado de mutação está indicada entre parêntesis, a pessoa é uma portadora obrigatória presumida, ‘(H)’. Outros tipos de cancro são também indicados no pedigree com a idade de diagnóstico entre parêntesis. Os asteriscos indicam os dois indivíduos que foram exome sequenciados. irmãos não afetados são representados por diamantes, com o número no centro indicando o número de pessoas.

Além da incidência marcante do câncer, esta família apresenta-se com outras características clínicas que se tornaram indicações de

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mutação. Quatro dos cinco indivíduos com UMM morreu de metástases do fígado derivado do UMM. Individual III: 6, que foi diagnosticado com UMM aos 20 anos, tinha uma íris isolado melanoma e mais tarde desenvolveu três carcinomas basocelulares. Ela é atualmente 61 anos de idade e bem. Individual III: 8, com CMM diagnosticado em 35 teve um tumor localizado na região occipital, que provavelmente foi um CMM primário, mas a metástase não pode ser excluída. Ela morreu aos 39 anos de idade, com CMM disseminada.

Métodos

Declaração de Ética

Aprovação ética para este projeto foi concedido pelos Comitês do Instituto Queensland de Ética em Pesquisa Humana Pesquisa médica e da Universidade de Lund. Foi obtido consentimento escrito para cada indivíduo.

Amostras

O sangue total foi coletado de indivíduos afetados doença em famílias melanoma uveal densas. O ADN genómico foi extraído utilizando métodos padrão. Amostras de DNA foram então usados ​​para exome e seqüenciamento Sanger experimentos.

Whole-exome Sequencing

A fim de encontrar variantes associadas a doenças, a sequenciação de todo o exome foi realizado em indivíduos-chave representante da carga tumoral nesta família. Dois casos UMM que eram três meioses distante (III: 14 e III: 17, Figura 1) foram seleccionados e a sequenciação foi efectuada utilizando um Ilumina Hiseq 2000 e um Ilumina TruSeq exome Enriquecimento Kit. A lê que foram gerados foram mapeados para referenciar genoma UCSC hg19 utilizando o algoritmo de alinhamento BWA [11]. SAMTOOLS foi então usado para detectar os SNPs e indels [12]. Este processo gera grandes volumes de dados e, a fim de esculpir a longa lista de variantes resultantes em um painel gerenciável de variantes vários critérios de filtragem foram aplicadas ao conjunto de dados. Em primeiro lugar, as variantes que se viam na dbSNP (build 132) ou comunicadas pelo Projeto 1000 Genomas (Fevereiro de 2012) foram filtrados, deixando apenas novas variantes a serem consideradas. Em segundo lugar, as alterações sinónimas foram removidas, deixando apenas as variantes de proteínas de alteração. Um ponto de corte de 40 foi em seguida aplicado à pontuação de qualidade devolvido para cada variante, a fim de limitar a taxa de falso positivo entre as chamadas variantes. Um 20% de corte foi também aplicada para o número de leituras alternativo, ou seja, se uma variante não têm uma percentagem suficientemente elevada de leituras para o alelo alternativo, em seguida, foi removida a partir da consideração. O que restou após este processo de filtragem foram 140 novas variantes para indivíduo III: 14 e 145 novas variantes para indivíduo III: 17. dados exome de estes indivíduos podem ser disponibilizados para fins de investigação mediante solicitação aos autores.

exome-sequenciação descoberto um

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mutação de emenda, o que resulta na truncagem prematura da proteína, em um (III: 17) dos dois indivíduos e foi visto como um candidato provável responsável pela UMM susceptibilidade devido à literatura de apoio. O resultado foi verificado no indivíduo usando a sequenciação de Sanger (veja a Figura 2). Após isso, a análise de co-segregação foi realizada para determinar quão bem a variante segregada com a doença na família e se estava presente em indivíduos com diferentes tipos de cancro. Cada amostra de ADN de sangue disponível a partir desta família foi rastreada para a variante. Para indivíduo II: 11 de ADN foi obtida a partir de tecido de tumor. Além disso, uma nova amostra de sangue foi obtida a partir indivíduo III: 14 uma vez que a amostra inicial não mostrou presença de uma linha germinal

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mutação. A segunda amostra de sangue foi exibido para a mutação específica no

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utilizando sequenciamento Sanger.

(A) O painel esquerdo mostra o tipo cromatograma selvagem enquanto o painel direito mostra que o

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mutação emenda. (B) as sequências de tipo selvagem nucleótidos e de aminoácidos são mostradas no painel superior, enquanto o painel inferior mostra a parte da proteína truncada BaP1 resultante da perda do exão 8.

RT-PCR

RT-PCR foi realizada em ADNc a partir de um transportador (III: 6) para verificar que o

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mutação era de facto uma variante de splicing. O ARN foi convertido em cDNA usando Superscript II (Life Technologies) e iniciadores que flanqueiam os exões afectados pela putativo local de splicing foram concebidos. Posteriormente, os produtos de PCR foram corridos num gel de acrilamida (consulte a Figura 3).

A partir da esquerda, a primeira pista mostra um marcador de tamanho, as próximas duas pistas mostrar tipo selvagem

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RT produtos-PCR, e as duas últimas faixas de mostrar o produto aberrante emendados resultante da c.581-2A . mutação G

case-Control Genotipagem

Para entender melhor a papel que esta variante poderia jogar no risco de melanoma uma amostra de caso-controle australiano foi genotipados para esta nova variante. A Sequenom Iplex foi executado em 1655 probands afetados de famílias que tiveram ou CMM, UMM ou uma combinação de ambos, e 1596 controles. O conjunto de amostras incluiu uma ampla seção transversal de casos com histórias variadas de melanoma. Alguns dos afetados pela doença são de famílias de melanoma densas, enquanto outros são casos esporádicos. Esta coorte também inclui casos com um amplo espectro de idades de início, que variam de doença da infância ao melanoma início tardio.

Resultados

Whole-exome-sequenciação identificou um

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mutação de splicing (c.581-2A G), num indivíduo com UMM a partir de uma família dinamarquesa predispostas a desenvolver UMM, bem como uma série de outros cancros. análise de co-segregação mostrou que três dos quatro casos UMM com DNA disponíveis para fins de investigação eram portadores desta mutação, o que faz com que o truncamento prematuro da

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. Além disso, houve outros quatro indivíduos com diferentes tipos de cancro que também tinham a mutação. Estes cancros foram CMM, câncer de pulmão e câncer de estômago. Para confirmar que o indivíduo III: 14 era do tipo selvagem para o

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mutação uma amostra de sangue recém-obtido foi exibido. De fato, a análise confirmou a ausência de

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mutação sugerindo que neste caso é um fenocópia. Perda de heterozigosidade (LOH) do

também foi observada BaP1

mutação no DNA a partir de tecido tumoral a partir II:. 11

De acordo com dados do Projeto 1000 Genomas, resultados de genotipagem mostrou que esta variante só estava presente na família atual, que é de apenas 1/1655 probands melanoma realizada a variante e 0/1596 controles. Os dados do GO exome projeto de sequenciamento NHLBI (ESP) também reflete este achado como esta variante de emenda não é encontrado em qualquer um dos 6500 indivíduos sequenciados dos EUA [13]. dados exome de 200 controles dinamarqueses saudáveis ​​também foi examinado para

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mutação e nenhuma variante alterando proteína foi visto [14]. Isto sugere que os indivíduos descritos aqui provavelmente carregam uma mutação ‘private’ a esta família.

Discussão

Houve vários tipos de câncer associados com

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mutações germinativas, mas o espectro de susceptibilidade tumor ainda está para ser determinado. Nós relatamos aqui uma família dinamarquesa com UMM e lesões pigmentadas da pele, bem como cancros do pulmão, neuroendócrinos, estômago e mama. Whole-exome sequenciamento de um caso UMM identificou um

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mutação de emenda (c.581-2A G), o que leva ao truncamento prematuro da

BaP1

. Esta aberração frameshift é consistente com mutações germinativas publicados visto em outras famílias predispostas a UMM. De acordo com outros

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portadores germinativas escandinavo, também observamos uma idade mais jovem no momento do diagnóstico da UMM (Tabela 1). No presente e as famílias escandinavos previamente publicados, a média de idade no momento do diagnóstico da UMM foi de 42 anos para os nove indivíduos afectados, em comparação com 53 anos para as transportadoras UMM em famílias não-escandinavos (Tabela 1 e referências). Isso se compara a uma média de idade no momento do diagnóstico para UMM de entre 58-62 anos em casos esporádicos de base populacional na Escandinávia [15] e os Estados Unidos [16]. O papel de

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como um gene supressor de tumor foi ainda apoiada por LOH do alelo de tipo selvagem em tecido de tumor de UMM II: 11. O tipo de indivíduo selvagem que é afetado com UMM mostra que nas famílias densas, é possível observar fenocópias mesmo com um tipo de tumor tão raro quanto UMM. Os dados da sequência exome da pessoa com UMM e tipo selvagem

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não revelou mutações em outros genes de predisposição de câncer conhecidos.

Em resumo, esta descoberta expande o perfil crescente de

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como um uveal importante e gene supressor de melanoma cutâneo. A família aqui descrito, também tinham uma variedade de outros tipos de cancro, alguns dos quais têm sido implicados com

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mutação (pulmão) e algumas que não têm (estômago, neuroendócrino). Para avaliar o possível envolvimento de

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na predisposição para esses tipos de câncer não-melanoma e compreender mais plenamente o espectro da doença associada a essas mutações, grandes estudos populacionais são necessários.

Apoiando informações

Métodos S1. informações

Adição de sequenciamento de todo o exome, sequenciamento Sanger e métodos Sequenom Iplex

doi:. 10.1371 /journal.pone.0072144.s001

(DOCX)

Reconhecimentos

Agradecemos aos membros da família para a sua participação neste estudo.