da arte abstracta
Fundo
Nimotuzumab é um anticorpo monoclonal IgG1 humanizado visando especificamente EGFR. Neste estudo, teve como objetivo investigar os mecanismos moleculares de nimotuzumab em seus efeitos de reforço da radiossensibilidade de células cancerígenas.
principal achado
Lung células A549 câncer e de cancro da mama MCF-7 células foram pré-tratadas com ou sem nimotuzumabe durante 24 h antes da radiação para realizar o ensaio de sobrevivência clonogénica e para analisar a apoptose celular por ctyometry fluxo. focos γ-H2AX foram detectados por microscopia confocal para avaliar o efeito da radiação induzida nimotuzumabe em reparação do ADN. activação do EGFR foi examinada e os níveis de proteínas relacionadas com o ADN reparar danos em células A549 a diferentes pontos de tempo e em diferentes doses após exposição a radiação nimotuzumabe e tratamento foram analisadas por Western Blot. O pré-tratamento com nimotuzumabe redução da sobrevivência clonogénica após a irradiação, inibiram a activação de EGFR induzida por radiação e aumentou a apoptose induzida por radiação em ambas as células A549 e células MCF-7. Os focos de γ-H2AX 24 h após a radiação aumentaram significativamente em células pré-tratadas nimotuzumabe com doses diferentes. A fosforilação de AKT e DNA-PKcs foram significativamente inibida no grupo da combinação em cada ponto de dose, bem como ponto de tempo.
Conclusões
Os resultados revelaram que o possível mecanismo de nimotuzumab reforçar o câncer radiossensibilidade é que nimotuzumab inibiu a ativação induzida por radiação de ADN PKcs através do bloqueio da via PI3K /AKT, que em última análise afetou a reparação do ADN LAP
Citation:. Qu Yy, Hu Sl, Xu Xy, Wang Rz, Yu Hy, Xu Jy, et ai. (2013) Nimotuzumab Melhora as células Radiosensibilidade de câncer em Vitro inibindo Induzidas por Radiação de reparação DNA danos. PLoS ONE 8 (8): e70727. doi: 10.1371 /journal.pone.0070727
editor: Xianglin Shi, da Universidade de Kentucky, Estados Unidos da América
Recebido: 04 de janeiro de 2013; Aceito: 18 de junho de 2013; Publicação: 16 de agosto de 2013
Direitos de autor: © 2013 Qu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Esses autores não têm apoio ou financiamento para relatar
Conflito de interesses:. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
Radioterapia desempenha um papel importante no tratamento de vários cancros com. intenção curativa ou paliativa. Aproximadamente 50% dos pacientes que sofrem com cancros precisa radioterapia, durante o respectivo processo de tratamento. No entanto, a taxa de pacientes que receberam radioterapia sozinho ou em combinação com a quimioterapia e a sobrevivência de controlo da doença permanecem dismally baixo. agentes citotóxicos tradicionais com função radiossensibilizadora muitas vezes, simultaneamente, aumentar a toxicidade do tecido normal, o que limita a sua aplicação clínica quando combinado com radioterapia. Recentemente, as terapias dirigidas receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR) exibiram excelentes efeitos anti-cancro com efeitos adversos suavemente e significativamente melhorada radiossensibilidade cancro em estudos pré-clínicos e clínicos [1], [2]. EGFR alvo terapias combinadas com radioterapia tem sido considerada como uma estratégia muito potencial para o tratamento de alguns cancros de origem epitelial
EGFR alvo terapias consistem principalmente de duas abordagens:. 1) anticorpos monoclonais (mAb) que visam o domínio extracelular do receptor na região de ligação ao ligando, isto é, cetuximab, e nimotuzumabe panituzumab; ou 2) moléculas pequenas que inibem a actividade de tirosina-quinase intracelular do EGFR, tais como gefitinib e erlotinib [3]. A maioria destes agentes têm sido extensivamente estudadas
in vitro
e
in vivo
na sua capacidade de aumentar a radiossensibilidade do tumor. Ao bloquear a activação do EGFR e a sua sinalização a jusante, tais como as vias de PI3K-AKT e RAS-MAPK, estes agentes anti-EGFR aumentar o efeito citotóxico de radiação ionizante através da indução de paragem do ciclo celular e apoptose e inibindo a proliferação celular, metástase e angiogénese de tumores [ ,,,0],4], [5].
Nimotuzumab é um anticorpo monoclonal IgG1 humanizado que bloqueia a EGF, TGF-α e outros ligandos de ligação a EGFR, bem como impedindo o receptor de expor seu motivo de dimerização [6]. Nimotuzumab liga a EGFR com uma afinidade de ligação moderada (Kd: 4,5 × 10
@ 8 M) em comparação com o cetuximab, que tem uma afinidade de ligação de mais de 10 vezes mais elevada [6]. Estudos in
in vitro têm mostrado que
nimotuzumabe se liga de forma bivalente (isto é, com os dois braços de anticorpos para dois alvos simultaneamente) para EGFR, com uma densidade moderada ou elevada, o que é o padrão de fixação estável [7], [8]. Em tecidos normais com baixa densidade EGFR, nimotuzumab tem menos afinidade e se liga EGFR com menos avidez, o que poupa os tecidos normais, incluindo a pele e mucosa, de citotoxicidade grave. Isto explica porque nimotuzumabe é caracterizado por pequenas toxicidades relacionadas com o tratamento em aplicação clínica enquanto exibe efeitos anti-cancerígenos semelhantes ou superiores em comparação com outros anticorpos monoclonais anti-EGFR. Como anticorpo monoclonal terapêutico promissor, nimotuzumab combinada com a radiação está sendo estudado extensivamente em sua eficácia para o tratamento de cancros de origem epitelial.
Nimotuzumab tem sido comprovada para aumentar selectivamente, os efeitos antitumorais da radiação de linhas celulares de NSCLC ionizante com alta EGFR expressão [9]. Além disso, um estudo in vivo em xenoenxertos de ratinhos transplantados com uma linha de células de glioma revelou que ambos nimotuzumabe cetuximab e aumentou radiossensibilidade de tumores subcutâneos transplantados [10]. Na fase II /III de ensaios clínicos, nimotuzumab combinada com radioterapia tem alcançado excelentes resultados no tratamento de cânceres de cabeça e pescoço localmente avançados [11], [12]. É relatado que o cetuximab inibe a translocação nuclear de EGFR induzida por radiação, e este processo está associado com a supressão da actividade de DNA-PKcs [13], [14]. Outros estudos têm mostrado que os inibidores de tirosina-quinase aumentar a radiossensibilidade celular suprimindo a capacidade de reparação do ADN-danos induzidos pela radiação [15], [16]. Estes resultados indicam que o tratamento com anticorpo monoclonal terapêutica combinada com a terapia de radiação pode ter impacto na resposta a danos no ADN induzidos por radiação. No entanto, os mecanismos subjacentes pelos quais funções nimotuzumabe em radiossensibilização ainda permanecem ainda desconhecidos. Neste estudo, utilizando duas linhas celulares de cancro cultivadas, que teve como objetivo investigar mecanismo molecular potencial da nimotuzumab no reforço radiossensibilidade celular de cancros.
Materiais e Métodos
As células, cultura de células e reagentes
A humana NSCLC linha celular A549 e a linha celular do cancro da mama MCF-7 (fornecida por Heilongjiang Institute of Cancer Research, Harbin, China) foram mantidas em meio RPMI 1640 (GIBCO) suplementado com soro de bovino fetal a 10% (FBS ) (NQBB, Austrália) sob uma atmosfera humidificada de 5% de CO2 a 37 ° C. Nimotuzumab foi fornecida por Biotech Pharmaceutical Co. Ltd (Pequim, China).
clonogênica ensaio de sobrevivência
células em crescimento exponencial em 25 cm
2 frascos foram tripsinizadas, colhidas e contadas. Eles foram diluídas em série para densidades adequadas, e plaqueadas em triplicado com determinados números (números diferentes de células de acordo com a dose de irradiação. Por exemplo, a 200 células por balão de 2 Gy, de 500 células para 4Gy, 1000 células para 6Gy, 4000 células para 8Gy, 10000 células para 10Gy e 100 células de controlo.) em 25 cm
2 frascos contendo 5 mL de meio de cultura na ausência ou na presença de 700 nM nimotuzumabe. Vinte e quatro horas após a incubação, as células foram expostas a 2, 4, 6, 8 e 10 Gy de 4MV de raios X gerado por um acelerador linear de alta energia (Elekta sinergia, Estocolmo, Suécia) a uma taxa de dose de 3 Gy min
-1. As células foram então lavadas com solução salina tamponada com fosfato (PBS) e cultivadas em meio isento de drogas durante 10-14 dias para formar colónias. Depois disso, as colónias foram fixadas com ácido methanol:acetic (10:01, v /v), e, em seguida, coradas com violeta de cristal. As colónias contendo ≥50 células foram contadas. A fracção de sobreviventes foi calculada como: (número de colónias média) /(número de células inoculadas × eficiência de revestimento). eficiência de plaqueamento foi definida como: (número de colónias média) /(número de células inoculadas para o controle, que não foram expostas à radiação, com ou sem nimotuzumabe). Os dados foram ajustados para o clássico modelo de multi-alvo single-hit: SF = 1- (1-e
-D /D0)
N para desenhar a curva de sobrevivência da dose, a partir do qual os parâmetros (D0, dq, N e SF2) representando a radiossensibilidade celular intrínseca foram derivados. A razão de intensificação de sensibilidade (SER) foi calculada como: (D
0 radiação de células tratadas /D
0 de nimotuzumabe combinados com células tratadas de radiação)
A análise celular apoptose
As células tratadas com ou sem 700 nM durante 24 h nimotuzumabe foram expostos a diferentes doses de radiação (0, 2, ou 8 Gy), e foram colhidas 48 h após a radiação para a análise da apoptose celular. Cerca de 1 × 10
6 células em cada grupo foram coradas com anexina V-FITC e iodeto de propídio (PI) para a análise da apoptose de acordo com as instruções do fabricante (Beyotime, China). As células foram então analisadas por células activadas por fluorescência (FACS, Calibur, BD, EUA).
γ-H2AX focos detecção por microscopia confocal
Células cultivadas em lamelas em seis poços placas eram tratadas com ou sem 700 nM nimotuzumabe durante 24 h. Subsequentemente, as células foram irradiadas com doses variadas (1, 2, 4 ou 8 Gy), seguido por incubação durante 24 h. Em seguida, as células foram fixadas com etanol gelado a 70% durante 30 min, lavadas 3 vezes com PBS e bloqueadas com BSA a 3% e 0,1% de Triton-X100 em PBS durante 30 min. Após a remoção do tampão de bloqueio, as células foram incubadas com anticorpo de 2-4 ug /ml γ-H2AX conjugado com FITC (Millipore, Billerica, MA) em tampão de bloqueio durante 2 horas no escuro. Os anticorpos excessivos foram lavados pela PBS. Finalmente, o 24 h residual γ-H2AX foi examinada por microscopia confocal (Zeiss, LSM700, Alemanha). Para cada ponto de dados foram avaliados pelo menos 300 núcleos.
proteínas Detecção de fosforilação de EGFR e DNA reparação de danos relacionados pelo Western-blot
células A549 e células MCF-7 foram tratadas com ou sem 700 nimotuzumabe nM durante 24 h e foram irradiados com 4 Gy de raios-X para detectar a fosforilação do EGFR. As células tratadas foram recolhidas em 2 h após a radiação. As células A549 tratadas como descrito acima foram colhidos no 0,5, 1, 2, ou 6 horas após a radiação para análise dinâmica de proteínas relacionadas de reparação de danos no ADN. Mesmas quantidades de células A549 com o mesmo esquema de tratamento foram irradiadas com doses diferentes (0, 1, 2, 4, 6Gy), incubou-se durante 2 horas, depois foram colhidas. Subsequentemente, os sedimentos celulares foram tratadas com tampão de lise (Beyotime, China), PMSF 1 mM (Beyotime, China) e uma protease de cocktail inibidor de comprimido (Roche Applied ciência, Mannheim, Alemanha) por 10 ml de solução foi adicionada, e as proteínas totais foram isolados . Quantidades iguais de proteínas (30 ug) foram separados em 8% de gel SDS-PAGE, e depois transferidos para membranas de PVDF. As membranas foram bloqueadas com 5% de leite seco não gordo em TBS-T20 durante 1 h à temperatura ambiente e, subsequentemente, incubadas com anticorpos primários durante a noite a 4 ° C. Depois de se lavar três vezes com TBST, as membranas foram incubadas com anticorpos de peroxidase de rábano conjugado secundário (Zhongshan, China) durante 1 h. As manchas foram desenvolvidos por kit de detecção de quimiluminescência para HRP (BI, Isreal) e visualizadas com um sistema de imagem de quimiluminescência (FLuorchemFC2, Alpha Innotech, EUA)
Os anticorpos primários foram diluídos da seguinte forma:. Anti-EGFR e anti -pEGFR (Cell Signaling Technology, Denvers, MA), 1:1000; anti-DNA-PK (Cell Signaling Technology, Denvers, MA), 1:1000; anti-pDNA-PK (Abcam, Cambridge, UK), 1:500; anti-Ku70 (Epitomic, Burlingame, Califórnia), 1:4000; anti-ATM (Cell Signaling Technology, Denvers, MA), 1:1000; anti-Patm (Cell Signaling Technology, Denvers, MA), 1:1000; anti-AKT (Cell Signaling Technology, Denvers, MA), 1:1000; anti-pAKT (Cell Signaling Technology, Denvers, MA), 1:1000; anti-γ-H2AX (Cell Signaling Technology, Denvers, MA), 1:1000; e anti-β-actina (Zhongshan, Beijing, China), 1:2000.
A análise estatística
Os dados foram analisados por meio de teste t pareado de e descritas como média ± SD. A diferença foi considerada significativa se P . 0,05
Resultados
tratamento Nimotuzumab reforçada radiossensibilidade celular na sobrevivência clonogênica ensaio
Para examinar se nimotuzumab aumentou o efeito anticancerígeno do ionizante radiação, foi realizado o ensaio de sobrevivência clonogénica com A549 e células MCF-7 (Figura 1; radiobiológicos parâmetros foram resumidos na Tabela 1). Nós não encontrou que a eficiência de plaqueamento de ambos A549 e as células MCF-7 foram diminuiu significativamente após pré-tratamento com nimotuzumab (P: 0,256 e 0,063, respectivamente, mostrado como Figura 1B). As curvas de dose-de sobrevivência indicaram que o pré-tratamento com nimotuzumabe diminuiu a sobrevivência clonogénica de ambas as células A549 e MCF-7 depois de doses variadas de radiação (Figura 1A). O rácio de aumento de dose foi de 1,36 e 1,47, respectivamente, o que sugere que nimotuzumabe foi mais eficaz na radiossensibilizadora células MCF-7 de células A549 in vitro.
células A549 (A) e células MCF-7 foram pré-incubadas com e sem 700 nM nimotuzumabe durante 24 h, e depois irradiadas com doses de radiação ionizante entre 2 e 10 Gy. dias After10-14, as colónias foram coradas e contadas. fracções sobreviventes foram calculados com base no número de colónias e eficiência de plaqueamento. Os dados foram apresentados como média ± DP de três experiências independentes. As curvas foram ajustadas com SF = 1- (1-E
-D /D0)
N. (B) chapeamento eficiência das células A549 e células MCF-7. Plaqueamento eficiência = (número de colónias média) /(número de células inoculadas, as quais foram pré-tratadas com ou sem nimotuzumabe). Não houve significância estatística entre nimotuzumab pré-tratados A549 /células MCF-7 e controle, com P:. 0,256 e 0,063, respectivamente
Nimotuzumab inibiu a activação de EGFR após a radiação
Para comprovar a capacidade de nimotuzumabe na inibição da activação do EGFR, a fosforilação do EGFR em Tyr1173 foi detectado por western-blot (Figura 2). Como se mostrou, com radiação 4Gy induzida activado fosforilação do EGFR em ambos A549 e células MCF-7. Com o pré-tratamento de nimotuzumabe, os níveis de EGFR fosforilado diminuiu significativamente após a radiação.
células A549 e células MCF-7 foram pré-tratadas com ou sem nimotuzumabe durante 24 h antes da radiação com 4 Gy. As células foram colhidas e lisadas em 2 h após a radiação. Os lisados foram submetidos a electroforese e foram incubadas com anticorpos contra EGFR, pEGFR e β-actina. Os gráficos de colunas a seguir são quantificação das bandas com base na análise densitométrica. Cada barra representa a média ± DP de taxa de densidade em relação ao controlo. * Indica diferença significativa (P 0,05).
Nimotuzumab aumento da apoptose celular induzida pela radiação
Taxas de celular de apoptose foram analisadas rotineiramente para avaliar os efeitos anticancerígenos da radiação. Neste estudo, as taxas de apoptose de A549 e MCF-7 tratadas com nimotuzumabe foram maiores do que os das células de controlo após ter recebido diferentes doses de radiação (Figura 3). O resultado indicou que nimotuzumabe aumentou o efeito citotóxico da radiação ionizante por indução de apoptose de células.
As células foram pré-tratadas com e sem 700 nM nimotuzumabe durante 24 h, e, em seguida, irradiada com 0, 2 ou 8 Gy. Quarenta e oito horas após a radiação, as células foram recolhidas e a apoptose de células foi examinado por citometria de fluxo. Uma representativos de três experiências independentes de ambas as células é mostrada (A, C). As comparações das taxas de apoptose de células A549 e MCF-7 entre os grupos niomtuzumab pré-tratados e de controlo são mostradas (B, D). Cada barra representa a média ± DP de taxa de apoptose. * Indica diferença significativa (P 0,05).
Pré-tratamento de nimotuzumab aumentou γ-H2AX formação em resposta à radiação
A quantificação da formação de γ-H2AX é um indicador chave para a radiação ADN induzida por rupturas dos filamentos duplos (LAP). Para avaliar os efeitos do tratamento combinado com radiação e nimotuzumabe na reparação do ADN, que quantificaram o focos γ-H2AX residual 24 h após a radiação com doses variadas por microscopia confocal. Observou-se que o pré-tratamento com nimotuzumabe sozinho não aumentou a geração γ-H2AX em ambos A549 e células MCF-7 em comparação com o controlo, enquanto que o tratamento de radiação com diferentes doses em ambas as linhas de células pré-tratadas com nimotuzumabe deixou mais formação γ-H2AX após 24 h do que células com radiação sozinha (Figura 4).
células A549 e MCF-7 foram pré-tratadas com ou sem 700 nM nimotuzumabe durante 24 h, e, em seguida, foram irradiadas com 1, 2, 4 e 8 Gy. Vinte e quatro horas após a radiação células foram fixadas e incubadas com anticorpo γ-H2AX conjugado com FITC. Cada barra representa a média ± DP de focos residual γ-H2AX por célula. Para cada ponto de dados foram avaliados pelo menos 300 núcleos. * Indica diferença estatisticamente significativa (P 0,05). As imagens abaixo são núcleos representativos com focos γ-H2AX sob microscopia de imunofluorescência, tratada com 1Gy ou 1Gy combinado com nimotuzumab.
Pré-tratamento de nimotuzumab regulada a reparação de danos ao DNA em resposta à radiação em células A549
reparação de danos do ADN induzidos por radiação é caracterizada pela expressão de várias proteínas relacionadas de reparação do ADN-danos. Estudámos, portanto, algumas das expressões de proteínas relacionadas e suas formas activadas em tratamento combinado com nimotuzumab e radiação em células A549.
Em primeiro lugar, nós comparamos a mudança cinética destas proteínas DNA reparação de danos relacionados em nimotuzumab tratados e não células tratadas após a exposição à radiação (ver Figura 5). Nesta experiência, γ-H2AX em ambos os grupos de células mostraram uma tendência de aumento dependente do tempo. No grupo nimotuzumabe pré-tratados, os níveis de γ-H2AX foram significativamente mais elevados do que aqueles no grupo de controlo em 1 h, 2 h e 6 h (Figura 5B). DNA-PKCS, o Ku70, ATM e AKT após a radiação não alterou em cada ponto de tempo nos dois grupos nimotuzumabe pré-tratados e controle de. No entanto, a forma fosforilada de ADN-PKcs em Thr2609 e a forma fosforilada de AKT em Thr308, os quais são activadas as formas das duas proteínas induzidas por radiação, foram expressos em níveis mais baixos no grupo pré-tratado nimotuzumabe do que os que controlam a diferentes pontos de tempo . Infelizmente, ambos os níveis de fosfo-PKcs e ADN-fosfo-AKT faltava a tendência crescente regulares em correspondência com o tempo (Figura 5C, D). A forma fosforilada da ATM em Ser1981 mostrou pouca alteração em ambos os grupos, assim como em diferentes pontos de tempo (Figura 5E).
células A549 (A) pré-tratadas com ou sem nimotuzumabe durante 24 h foram irradiados com 4 Gy . As células foram colhidas e lisadas em tempos indicados. Os lisados nos tempos indicados foram submetidos a electroforese e foram incubadas com anticorpos contra γ-H2AX, AKT, pAKT, a DNA-PKcs, pADN-PKcs, Ku70, ATM, Patm e β-actina. (B-E) Quantificação de bandas com base na análise densitométrica. Os resultados são taxa de densidade relativamente ao controlo não irradiado. Cada barra representa a média ± DP de três experiências independentes. * Indica diferença estatisticamente significativa (P 0,05).
Em segundo lugar, para investigar se o aumento da dose de radiação mais desencadeada expressão de proteínas relacionadas com danos de ADN, e se nimotuzumabe poderiam inibir a activação de ADN-PKcs e AKT, que radiada nimotuzumabe pré-tratados células A549 e as células de controlo com doses variadas. γ-H2AX mostrou um aumento dependente da dose em ambos os grupos controle e nimotuzumabe pré-tratada, e o pré-tratamento nimotuzumabe resultou num aumento significativo de γ-H2AX (Figura 6B). Os níveis de ADN-PKcs, Ku70, ATM, Patm e AKT não se alterou apesar da dose de radiação intensa e pré-tratamento com nimotuzumabe (Figura 6A, E). pADN-PKcs e pAKT foram, obviamente, menor no grupo pré-tratado nimotuzumabe do que aqueles no grupo de controlo, mas não mostrou qualquer variação significativa para cada dose em ambos os grupos (Figura 6C, D).
células A549 (A) pré-tratadas com ou sem nimotuzumabe foram irradiadas com doses indicadas. Duas horas após a radiação células foram colhidas e lisadas. Os lisados foram submetidos a electroforese e foram incubadas com os anticorpos descritos na Figura 5. (B-E) Quantificação de bandas com base na análise densitométrica. Cada barra representa a média ± DP de três experiências independentes. * Indica diferença significativa (P 0,05).
Discussão
Apesar de monoterapia de anti-EGFR mAbs exibe uma eficácia limitada em ensaios clínicos, a sua combinação com a radioterapia e /ou quimioterapia tem mostrado resultados promissores no tratamento de câncer de células escamosas avançado de cabeça e pescoço, câncer de pulmão de não pequenas células e cancro colorectal [17] – [22]. O sucesso desta terapia combinatória é grandemente atribuída aos efeitos sensibilizadores de mAbs anti-EGFR a radiação ionizante e /ou agentes citotóxicos. Nimotuzumab, um humanizados mAb anti-EGFR, tem demonstrado a sua capacidade única em gerar efeitos radiosuscetível enquanto causando toxicidades leves de tecidos normais em ensaios clínicos [8], [12]. Embora os efeitos anticancerígenos de nimotuzumab foram confirmados in vitro e in vivo [23], os mecanismos moleculares potenciais de nimotuzumab para radiossensibilizar células cancerosas ainda precisa ser explorado.
No presente estudo, confirmamos que a radiossensibilidade do cancro linhas de células pode ser melhorada por pré-tratamento com nimotuzumabe. Desde nimotuzumabe por si só não afectou a formação de colónias, que desempenhou um papel aditivo sensibilizantes mas não quando combinados com radiação. À medida que o alvo de nimotuzumabe, a activação do EGFR induzida por radiação foi obviamente inibida, uma vez que era esperado. Além disso, foi demonstrado que nimotuzumabe aumento da apoptose induzida por radiação das duas linhas de células. Crombet-Ramos
et al [23] relataram que células A431 incubadas com imotuzumab durante 48 h não exibiram sinais evidentes de apoptose e concluiu que o agente actuou essencialmente como citostático, em vez de citotóxico. No nosso estudo, no entanto, verificou-se que nimotuzumabe aumentou a taxa de apoptose de ambas as células A549 e células MCF-7, fundamentalmente, o que sugeriu que nimotuzumabe como um agente terapêutico poderia induzir a apoptose celular, pelo menos in vitro. Como radiação combinada com nimotuzumabe resultou num efeito sinérgico sobre a apoptose celular maior do que a soma da apoptose induzida por nimotuzumabe e por radiação sozinha (isto é, um 1 + 1 2 efeito), evidencia-se que nimotuzumabe tem a capacidade de radiossensibilizadora estas células cancerosas . Além disso, em nosso estudo, embora nimotuzumab aumentou a apoptose das células cancerosas, ele não prejudicar a formação de colónias. Especulamos que as células clonogénicas de cancros foram mais resistentes e difícil de ser afectado por nimotuzumabe, e foi as células proliferativas que foram induzidos a apoptose por nimotuzumabe.
Com base nos resultados acima, que depois se concentrou sobre a mecanismos moleculares potenciais efeitos de radiossensibilizadora de nimotuzumabe. É bem sabido que a radiossensibilidade do cancro é determinada, principalmente, pela capacidade de células cancerígenas para reparar danos de forma eficiente no DNA induzidos por radiação. Portanto, a hipótese de que nimotuzumab pode radiossensibilizar células cancerosas afetando o mecanismo LAP reparo. γ-H2AX formação é um marcador sensível para lesões DSB e é rotineiramente utilizada para avaliar radiossensibilidade celular. Mais γ-H2AX focos significa mais LAP reparado. A detecção quantificada de γ-H2AX por imunofluorescência e imunoblot demonstrou que mais LAP DNA foram reparado após a radiação em células nimotuzumabe pré-tratados, o que levou à apoptose celular, e mostrou uma correlação linear com doses de radiação ou tempo pós-radiação.
Em seguida, investigamos como nimotuzumab inibiu a reparação de LAP induzida por radiação. DNA-PKcs é uma proteína crítica envolvida na reparação de junção de extremidade não-homóloga de DSB de ADN. A activação de DNA-PKcs modula directamente a reparação de DSB induzidos por radiação. No presente estudo, o nível de expressão de ADN-PKcs após a radiação não alterou se pré-tratados com nimotuzumabe ou não. Mas a forma fosforilada de ADN-PKcs em Thr2609, que está relacionada com a reparação de DSB e radiossensibilidade celular, fortemente elevada após a radiação, indicando um atributo radioresistent de células A549 e diminuiu significativamente no grupo de pré-tratamento nimotuzumabe. Além disso, foram examinados uma das subunidades reguladoras de Ku70 complexo de ADN-PK. No entanto, Ku70 não alterou em qualquer dos grupos. Coletivamente, nossos resultados demonstraram que nimotuzumab inibiu a função do ADN PKcs de reparação DSB suprimindo a sua activação.
Toulany
et al
[24] relatou que a via EGFR-PI3K-AKT foi envolvidos na regulação de ADN PKcs. Eles sugeriram que tanto o EGFR inibidor de tirosina cinase ou um inibidor de AKT revogada induzida por radiação de DNA-PKcs fosforilação em Thr2609 em células de tumor mutante K-RAS. Uma vez que a sinalização a jusante de EGFR nimotuzumabe blocos, é possível que nimotuzumabe modula a fosforilação de DNA-PKcs através da supressão da activação AKT. Descobrimos que a forma fosforilada de AKT em Thr308, que é a forma activada associados com sobrevivência celular, altamente aumentada em células A549 irradiada, mas semelhante ao fosfo-DNA-PKcs (Thr2609), foi totalmente inibida após pré-tratamento com nimotuzumabe. Assim, concluiu-se que nimotuzumabe mediada seus efeitos sobre vias de reparação de ADN por meio de supressão da via da PI3K-AKT. Voltar para a análise da apoptose celular, ele confirmou que a inibição da ativação de AKT por nimotuzumab está relacionada com a promoção da apoptose celular. O mecanismo potencial é através da inibição da activação de ADN-PKcs, a reparação de DSB de ADN induzidos por radiação, foi impedido, que em última análise induzida apoptose celular.
ATM, uma importante proteína participar na reparação de danos no ADN induzidos por radiação, foi estudados para identificar se a sua expressão ou atividade pode ser afetada por pré-tratamento com nimotuzumab. ATM e sua forma ativada, a forma fosforilada de ATM em Ser1981, não alterar se pré-tratados com nimotuzumab ou não. Ambas as ADN-PKcs e ATM fosforilar γ-H2AX após a radiação [24] ionizante, [25]. No nosso estudo, uma vez que a activação de DNA-PKcs após a radiação foi inibida por nimotuzumabe através do bloqueio via PI3K-AKT, a fosforilação de H2AX pode ser devida à actividade da ATM.
Em resumo, mostrou que o anti-EGFR mAb nimotuzumab radiosensitizes células cancerosas através da indução de apoptose mais e LAP não reparados. O mecanismo subjacente a este efeito sensibilizador está relacionada com a inibição de ADN-PK DNA envolvidos reparação de DSB através do bloqueio da via PI3K-AKT. Desde nimotuzumab é um aprovado mAb anti-EGFR para uso terapêutico no tratamento do câncer, explorando os mecanismos anticancerígenos precisas de nimotuzumab vai ajudar a aumentar a eficácia deste agente na prática clínica.