Abstract

As deficiências no gene ATM são a causa subjacente para a ataxia telangiectasia, uma síndrome caracterizada por neurológico, motor e defeitos imunológicos, e uma predisposição para o cancro. Os microRNAs (miRNAs) são ferramentas úteis para profiling e previsão de respostas terapêuticas para regimes clínicos câncer. Nós investigamos as consequências da deficiência de ATM na expressão miRNA e expressão do gene associado em células humanas normais mamárias epiteliais (HME-CCs). Foram identificados 81 miRNAs significativamente diferencialmente expressos em ATM deficiente HME-CCs usando pequena seqüenciamento RNA. Muitos destes têm sido implicada na tumorigénese e proliferação e incluem miARNs regulada negativamente supressores de tumor, tais como HSA-miR-29c e HSA-miR-16, bem como sobre-expressos miARNs pró-oncogénicos, tais como HSA-miR- 93 e HSA-miR-221. mudanças microRNA foram integrados com perfis de expressão gênica todo o genoma para investigar possíveis alvos de miRNA. alvos de ARNm prevista do miARNs regulada de forma significativa após a depleção ATM incluídos muitos genes associados com a formação e progressão de cancro, tais como SOCS1 e o MAF do proto-oncogene. Enquanto um número de miRNAs têm sido relatados como alterados em células cancerosas, há pouca compreensão de como esses pequenos RNAs pode ser a condução de formação de câncer ou como eles podem ser usados ​​como biomarcadores para a suscetibilidade ao câncer. Este estudo fornece dados preliminares para a definição de perfis de miRNA que podem ser utilizados como biomarcadores de prognóstico ou preditivos de câncer de mama. Nossa análise integrada de expressão miRNA e mRNA nos permite obter uma melhor compreensão da sinalização envolvido na predisposição ao câncer de mama e sugere um mecanismo pelo fenótipo propensa ao câncer de mama observada em pacientes ATM deficientes

Citation:. Hesse JE, Liu L, Innes CL, Cui Y, Palii SS, Paules RS (2013) Genome-Wide RNA Sequenciação e Análise de Expressão gênica revela um microRNA Perfil de Câncer Susceptibilidade em células ATM-Deficiência Humana mamária epiteliais. PLoS ONE 8 (5): e64779. doi: 10.1371 /journal.pone.0064779

editor: Jin Q. Cheng, H. Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, Estados Unidos da América

Recebido: 12 de dezembro de 2012; Aceito: 17 de abril de 2013; Publicado em: 31 de maio de 2013

Este é um artigo de acesso aberto, livre de todos os direitos autorais e pode ser livremente reproduzido, distribuído, transmitido, modificado, construído em cima, ou de outra maneira usado por qualquer pessoa para qualquer finalidade lícita. O trabalho é feito disponível sob a dedicação de domínio público da Creative Commons CC0

Financiamento:. Esta pesquisa foi apoiada pelo Programa Intramural dos Institutos Nacionais de Saúde, Instituto Nacional de Ciências de Saúde Ambiental (Z01 ES021157). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

A ataxia telangiectasia mutado (ATM) proteína desempenha um papel crítico em uma vasta gama de respostas celulares, incluindo regulação do ciclo celular, apoptose e respostas de danos ao DNA. Indivíduos com deficiências completas em ATM sofrem de ataxia severa, distúrbios imunológicos, e têm elevado risco de desenvolver cancros linfoproliferativas [1]. Além de completar perda de funcionalidade ATM, estima-se que mais de 1% da população dos Estados Unidos carregam uma cópia mutante do ATM [2], [3] e estão sujeitos às consequências da haploinsuficiência. Embora portadores heterozigotos não sofrem de síndrome de ataxia telangiectasia, eles têm um risco aumentado de desenvolver doenças cardíacas, diabetes e câncer, câncer de mama, especificamente, em comparação com indivíduos com níveis de expressão ATM normais [2], [3]. Estudos mais recentes epidemiológicos mostraram que as mutações ATM, que causam ataxia telangiectasia no estado homozigótico, são também alelos de susceptibilidade de cancro da mama em portadores heterozigóticos [4], [5], [6], [7], [8], [9 ], [10]. Além disso, tem sido implicado que epigenética silenciamento de ATM através de metilação pode também desempenhar um papel na susceptibilidade a cancro da mama [11], [12]. Apesar dessa relação entre os níveis de ATM reduzidos e câncer de mama, deficiências na proteína ATM não são frequentemente observadas em populações de cancro da mama não-familiares [13]. Esta observação sugere a possibilidade de que as vias de sinalização ou padrões de expressão de genes que estejam sob o controlo do ATM pode ser um mecanismo plausível ligando estado expressão predisposição ATM para o cancro da mama. Aqui nós propor alterações ATM-dependentes na regulação epigenética, nomeadamente o Regulamento miRNA da expressão do gene, desempenham um papel na formação de cancro da mama.

Os microRNAs (miRNAs) são uma grande classe de regulamentação de pequenos RNAs que têm sido descrito para modificar pós-transcricionalmente a expressão do gene. O alto nível de conservação em sequências de miRNA em toda a espécie enfatiza seu papel regulador importante. O modo principal de acção para a regulação da expressão do gene de miARN é obrigatório para a região 3 ‘UTR do ARN mensageiro (ARNm), que conduz a uma diminuição na quantidade de ARNm disponível na célula, quer através de degradação de ARN ou prevenção da tradução. MicroRNAs desempenham papéis críticos no desenvolvimento, diferenciação e progressão da doença, e são previstos para atingir mais de 60% do ARNm em seres humanos [14]. Mais recentemente, miARNs têm sido utilizados no diagnóstico, identificação e previsão da resposta terapêutica de cancros [15], [16], [17], [18], [19], [20]. MicroRNA perfis de diferentes tipos de cancro tem sido usada para identificar miARNs causadores de cancro, denominado oncomirs, bem como miARNs supressores de tumor [20], [21], [22]. Muitos grupos diferentes foram gerados perfis de miARN em células de cancro da mama a fim de desenvolver biomarcadores potenciais no diagnóstico e tratamento [23]. Vários miRNAs aparecem em muitos dos miRNA profiling experiências como sendo desregulamentado no cancro da mama. No entanto, a maior parte destes estudos foram realizados em células cancerosas e tumores. Aqui nós investigar o papel de ATM com os níveis de expressão e a composição de miARNs em células normais não cancerosas humanas mamarias epiteliais (HME-CC). Estamos interessados ​​em compreender como mudanças na expressão de miRNA devido à deficiência ATM pode contribuir para a predisposição ao câncer e provocar alterações nas vias fisiológicas normais. Utilizando Illumina Next-Generation Sequencing, foi realizada a sequenciação do genoma de pequenos RNAs de tipo selvagem normal (WT) e ATM deficiente HME-CCs. Além profunda sequenciamento dos pequenos RNAs, foi realizada a análise do genoma expressão do gene inteiro usando Agilent microarrays todo genoma. A combinação de ambos expressão gênica e perfis de miRNA nos permitiu identificar possíveis genes alvos para miRNAs significativamente regulamentados. Ao compreender a composição e expressão de miRNAs em células epiteliais mamárias ATM deficientes esperamos para obter insights sobre os mecanismos e fisiologia subjacente através do qual a formação de tumores do cancro da mama prossegue.

Materiais e Métodos

celular cultura

O HME-CC-LacZ (tipo selvagem) e HME-CC-ATM1 (ATM-deficientes) linhas de células epiteliais mamárias humanas foram obtidas como descrito [24]. As células foram cultivadas e mantidas em HuMEC Pronto mídia (Invitrogen 12.752.010) com 4 mcg /mL blasticidina (Invitrogen 46-1120).

celular Colheita e RNA Extração

tipo selvagem e humana ATM deficiente células epiteliais mamárias de crescimento logarítmico foram colhidas utilizando 0,25% de tripsina-EDTA (Invitrogen 25200072), que foi neutralizado utilizando TNS (Lonza CC-5002). O ARN total foi isolado utilizando o kit de isolamento de Ambion miRvana miARN usando o protocolo padrão para isolamento de ARN total. O RNA total isolado foi então dividido em alíquotas de modo que o mesmo ARN foi utilizado para a sequenciação de pequenos ARN e para análise de expressão génica.

Ilumina pequeno ARN-sequenciação

em triplicado amostras biológicas de ARN total foram apresentado ao NIH Intramural Sequencing Center. Bibliotecas de cDNA RNA pequeno foram criados utilizando o Illumina RNA pequeno Amostra Preparação Alternativa v1.5 protocolo com apenas pequenos desvios do protocolo do fabricante. Essas bibliotecas de cDNA foram então sequenciados na Illumina Genome Analyzer IIX com 35 pares de bases lê de acordo com as instruções do fabricante. Cada biblioteca foi executado em uma única pista na célula de fluxo com 36 ciclos usando versão Illumina 5 química. Após o alinhamento ao genoma, ler as contagens foram normalizados cálculo miRNAs por milhão de alinhamentos de miRNA. A lista dos miRNAs significativamente regulados foi criado usando uma análise de teste t (p≤0,05) e dobre mudança (≥1.5) de corte entre as células ATM com deficiência em comparação com células de tipo selvagem.

Agilent Whole Genome matriz

RNA total isolado foi submetido à facilidade NIEHS microarray núcleo para análise microarray. análise de expressão gênica foi realizada usando Agilent Whole Genome Humano 4 × 44 multiplex matrizes formato de oligo (Agilent Technologies, 014850) seguindo o protocolo de análise de expressão gênica baseada em microarrays Agilent 1-color. Começando com 500 ng de ARN total, Cy3 marcado ARNc foi produzido de acordo com o protocolo do fabricante. Para cada amostra, 1,65 ug de Cy3 marcado ARNc fragmentado e foram hibridados durante 17 horas num forno de hibridação rotativo. As lâminas foram lavadas e depois digitalizada com um scanner Agilent. Os dados foram obtidos usando o software Feature Extraction Agilent (v9.5), usando os padrões 1-color para todos os parâmetros. O recurso Agilent Extração Software realizada modelagem de erro com o ajuste de aditivo e ruído multiplicativo. Os dados obtidos foram processados ​​e analisados ​​utilizando (software Partek® Genomics Suíte, versão 6.6beta, Direitos de Autor © 2009, Partek Inc., St. Louis, MO, EUA) Partek Genomics Suite. Um t-teste foi realizado entre o tipo selvagem e amostras ATM com deficiência, gerando associado

p

-Valores. Combinado com uma mudança de dobragem de +/- 1,5,

p -valor de

≤0.05 foi utilizado para gerar uma lista de genes expressos diferencialmente.

Integração de MicroRNA e Dados Gene Expression

Usando TargetScan 5.2 [14], [25], [26], uma lista de alvos biologicamente previstos de nosso diferencialmente expressos foi determinada miRNAs. Essa lista de alvos foi então comparada à nossa lista de genes diferencialmente expressos para determinar possíveis miRNA -. Interações mRNA

Funções Análises em Ingenuity

miRNAs e mRNAs significativamente regulados foram analisados ​​com Ingenuity Pathway Analysis ( IPA) [25], [26]. Redes e análises funcionais foram gerados com base nos 40 miRNAs significativas e 202 genes alvos previstos significativas anotadas no IPA. Um teste exato de Fisher direito de cauda foi utilizado para calcular um valor p determinar a probabilidade de que cada função biológica e /ou doença atribuído a esse conjunto de dados é devido apenas ao acaso. Funções com um

p

-valor inferior a 0,01 foram considerados significativos.

Acesso a Dados

Os dados de microarrays e sequenciamento de RNA pequeno utilizada neste estudo foram arquivados na . gene Expression Omnibus (GEO) do banco de dados (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)

o número de acesso GEO para o seqüenciamento RNA pequeno é GSE36267 e pode ser revisto em http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?token=jxezrakumucekru acc=GSE36267.

o número de acesso GEO para o conjunto do genoma de dados de matriz expressão Agilent é GSE36082 anúncio pode ser revistas em https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?token=jvixzkwsaqiqwps acc=GSE36082.

Accompanying dados complementar é composto por 7 mesas que podem ser encontrados online.

Resultados

Sequenciamento e Análise de Dados

Illumina seqüenciamento profunda foi usado para gerar RNA pequeno lê a partir de 3 repetições biológicas cada de tipo selvagem e não-cancerosas HME-CCs ATM-deficientes. Filtrando com base em índices de qualidade e artefatos de sequenciamento permitiu seleção de única sequência robusta lê (Figura 1A). Utilizando o kit de ferramentas FastX [27], as sequências de adaptadores foram cortados a partir da extremidade 3 ‘da sequência de leitura e sequências sem sequência de adaptador ou com menos de 16 nucleótidos após remoção do adaptador foram excluídos de análises posteriores. Grampeado leituras foram alinhadas usando Bowtie [28] para a construção do genoma humano hg19. Nós permitimos há desajustes na região de semente de 15 bp da sequência lê e permitiu até 3 alinhamentos por sequência ler. Alinhamentos foram anotados com a pequena faixa genoma UCSC (WgRNA) sobre hg19. Ler as contagens foram normalizados pelo cálculo etiquetas por milhão de alinhamentos de miRNA (TPM). filtragem sequência, recorte adaptador, e alinhamento Bowtie foram realizadas utilizando uma combinação de programas de linha de comando e a céu aberto web plataforma Galaxy base [29], [30], [31]. estatísticas de resumo de todas as 6 amostras foram monitorados para garantir a similaridade no sequenciamento é executado, alinhamentos e anotações (Figura 1B).

Uma visão gasoduto de RNA Sequenciação). B) As estatísticas do resumo dos dados de RNA Sequenciação em diferentes estágios de análise de dados.

Composição de miRNA no tipo selvagem e ATM com deficiência de células

A próxima geração seqüenciamento profunda permite uma grande intervalo dinâmico na detecção de miARN (Tabela S1). Ao considerar todas as nossas amostras, foram identificados 390 miRNAs presentes em duas das três amostras em amostras tanto o tipo selvagem ou ATM-deficientes com pelo menos 1 TPM (Figura 1B). Para restringir nossa análise apenas aos miRNAs mais robustas, foram considerados apenas miRNAs com pelo menos 10 TPM na duas das três amostras em amostras tanto o tipo selvagem ou ATM-deficientes em uma análise mais aprofundada. 259 miRNAs foram consideradas presentes em todas as amostras e mudou-se para a próxima fase da análise (Tabela S2). etiquetas de seqüências por milhão de alinhamentos de miRNA (TPM) foram importados para Partek Genomics Suite para posterior análise (software Partek® Genomics Suíte, versão 6.6beta, Direitos de Autor © 2009 Partek Inc., St. Louis, MO, EUA). Um olhar precursora nos níveis dos 259 miRNAs expressão destaca o amplo alcance dinâmico de expressão detectada por sequenciamento de próxima geração profundo. Fomos capazes de detectar miARNs com apenas poucos transcritos, bem como com a expressão robusta miARNs, tais como HSA-miR-21, que tem uma média de expressão de WT 113949 TpM. Uma revisão de alto nível do perfil preliminar miRNA revela efeitos específicos do esgotamento de ATM na expressão. Observamos não apenas miRNAs que está expressão foi afetada pela perda de ATM, mas nós também foram capazes de identificar miRNAs que parecem ser afetados pela depleção ATM.

mudanças nos perfis de expressão de miRNAs após a depleção de ATM

Para avaliar a magnitude e o significado da alteração na expressão de miARN após o esgotamento da ATM, foi realizado um teste-t em 259 miARNs consideradas presente tanto no tipo selvagem e deficientes em ATM amostras. Associados

p

valores foram calculados e combinados com uma mudança vezes para gerar uma lista de significativamente regulados diferencialmente (

p

≤0.05; dobre mudanças ≥ 1,5) miRNAs. Este identificou 81 miARNs como significativamente diferencialmente expressos entre os dois genótipos HME-CC (Figura 2 Tabela S3), o que mais do que 30% da miARN considerados presentes na nossa análise são significativamente regulados diferencialmente após o esgotamento da ATM. Encontramos vários miRNAs bem caracterizados que foram estatisticamente inalterada após o esgotamento de ATM, incluindo a família deixe-7 e hsa-miR-21. Entre os 81 miARNs significativamente regulados, existem 55 miARNs com níveis mais elevados de expressão e 26 com os níveis mais baixos de expressão, em comparação com o tipo selvagem HME-CCS. Curiosamente, estes miARNs regulados incluem vários que têm sido implicados na formação do cancro ou metástase. Utilizando a ferramenta TAM para miRNAs anotação de [32] e a base de dados humana doença miRNA [33], foram identificados 4 reprimidos supressores de tumor miRNA e 7 sobre-expressos oncomirs [21], [22], [34] nas células ATM com deficiência (para exemplos, ver Figura 3). Esta observação de desregulamentação dos miRNAs importantes na formação do cancro ou supressão sugere ATM-dependentes miRNA mudanças de expressão pode alterar vias biológicas e funcionalidades que promovem a formação de câncer. Baseado em câncer de miRNA profiling projetos, vários miRNAs ATM-dependentes mereceu uma análise mais aprofundada (Figura 3). Por exemplo, a perda de resultados ATM numa expressão diminuída das miARNs supressores tumorais, miR- 96, que é conhecido por alvo KRAS [35], e a família de miR-29, que inclui o miR-29b-1, miR-29b- 2, e miR-29c. Uma diminuição na expressão de todos os três membros da família de miR-29 tem sido implicada em muitos tipos de cancro [36] e tem uma correlação com o prognóstico [37]. Além disso, a perda de ATM resulta em um aumento na expressão de miR-10b, que é altamente expresso em cancros da mama metastático [38], [39] e miR-221, o que pode induzir a proliferação e sobrevivência de células [40]. A fim de compreender melhor os efeitos biológicos das mudanças de expressão de miRNA, realizamos a análise do genoma expressão do gene inteiro.

expressão miRNA Diferencial entre o tipo selvagem e ATM deficiente HME-CCs obtidos a partir de três repetições independentes de cada um. O

y

-axis exibe o ATM com deficiência a Taxa WT expressão, o

x

-axis exibe a expressão média de cada miRNA; ambos os eixos estão em escala logarítmica. diferencialmente expressos miRNAs de

p

-valor ≤0.05 e pelo menos 1,5 vezes a mudança são azuis. miARNs significativas representativos são rotulados. Cada amostra tinha uma biblioteca sequenciamento gerada separadamente e foi executado em uma pista de sequenciação individual.

A) Lista de 4 supressores de tumor conhecidos e 8 oncomirs com mudanças de expressão significativas após o esgotamento dos ATM. B) Os níveis de expressão, marcas por milhão (TPM), de quatro exemplos de miRNAs desregulados. barras cinzentas escuras representam a expressão do tipo selvagem e acender barras cinzentas representam expressão em células ATM com deficiência. As barras de erro são erro padrão a partir da expressão de 3 repetições independentes de cada genótipo.

expressão de genes previsto para ser miRNA alvos

Usando todo o microarray genoma humano Agilent, nós reunidos gene dados de expressão a partir das mesmas amostras HME CC-WT e ATM-deficiente. Com uma combinação de

p

-valor (≤0.05) e dobre mudança (≥1.5) cut-offs, foram identificados 1086 sondas significativamente alterados representando 988 genes ou áreas genéticas (Tabela S4). A fim de identificar genes possivelmente alvejados por alterações na expressão de miARN, utilizou-se 5,2 TargetScan para prever alvos de ARNm de 259 miARNs significativamente regulados. Limitamos os alvos de mRNA previsíveis, com base na primeira genes regulados significativamente em nossa análise de expressão gênica e segunda em alvos quer experimentalmente comprovada ou altamente previsto por TargetScan. Além disso, com base no conhecimento de que miARNs predominantemente regular a expressão do gene através de uma inibição da expressão, que só reteve combinações miARN-ARNm que estão inversamente correlacionados, reconhecer que podem ser excluindo interacções reguladoras funcionalmente importantes de mRNAs. Começando com nossos 81 miRNAs significativamente regulados, foram identificados 40 que teve altamente previsto alvos de mRNA com mudanças significativas na expressão gênica associada. Foram identificados 202 alvos de mRNA significativamente regulados que foram inversamente correlacionados com os miRNAs previsto para orientá-las (Tabela S5). Muitos dos miARNs são previstos para segmentar vários mRNAs significativamente regulados e muitos dos mRNAs são potencialmente miARN alvo de mais do que um MTA-dependente. Estes fenómenos podem sugerir redundância funcional na regulação miRNA de genes alvo.

Usando Gene Set Análise de Enriquecimento (GSEA) [41], determinou-se as famílias de genes representados pelos genes previsto para ser alvo de miRNAs em um ATM forma dependente (Figura 4A). Esta abordagem dá uma visão geral funcional dos genes em nossa lista usando o assinaturas moleculares de banco de dados [41]. famílias de genes partilham características comuns, tais como atividade bioquímica e homologia. Interessantemente, muitos dos genes alvo preditos das miARNs significativamente regulados são os factores de transcrição (mostrados na Tabela S6), o que sugere que muitos dos miARNs ATM-dependentes podem controlar uma grande resposta fenotípica com base na regulação da expressão do factor de transcrição. O envolvimento de regulação miARN de factores de transcrição foi predito e modelado em vários tipos diferentes de cancro [42], [43], [44]. Nossos resultados mostram mudanças na miRNAs, bem como a alteração da expressão do fator de transcrição que está ocorrendo após a perda de ATM. Além disso, os nossos resultados sugerem que esta alteração de factores de transcrição pode estar ocorrendo antes de as células se tornam malignas (Tabela S6). Por exemplo, o aumento da expressão de fatores de transcrição oncogênicos como MAF e CEBPA indicam miRNAs podem regular grandes redes de genes envolvidos na formação do câncer. Além disso, 6 oncogenes e um supressor de tumor conhecido, SOCS1, é previsível que sejam alvos de miARN. Isto é consistente com relatórios anteriores que sugerem miARN pode desempenhar um papel crítico na formação e progressão de cancro. Compreender os efeitos iniciais de miRNAs na regulação dos fatores de transcrição e formação de câncer pode levar a insights sobre tratamentos prognósticos e preventivas.

A) famílias de genes que representam os 202 genes significativamente regulados determinados utilizando GSEA para dar uma visão geral funcional de os tipos de genes afectados por alterações na expressão de miARN. B) Análise de Funções Topo da miRNAs correlacionados ATM-dependentes e possíveis alvos de mRNA por IPA. grupos funcionais significativas apenas seleccionados são descritos. A linha pontilhada indica um

p

-valor de 0,01.

Pathway /Análise funcional de metas previstas

A fim de obter esclarecimentos adicionais sobre as funções biológicas e redes sendo afetados pelas mudanças ATM-dependentes na expressão de miRNA, utilizamos Ingenuity Pathway Analysis (IPA) [45]. análise funcional e análise de geração de rede através do IPA nos permite examinar todos os possíveis papéis de miRNAs significativamente alteradas e seus genes alvos previstos pela mineração do IPA Knowledge Base para identificar a conectividade e as relações entre nossos genes e miRNAs de interesse. Cinco redes foram significativamente afectados após o esgotamento da ATM, incluindo funções celulares de morfologia, do ciclo celular, crescimento celular e proliferação. Pelo menos 76 grandes grupos funções foram significativamente (P 0,01) afetada após o esgotamento de ATM, com várias câncer e tumor funções específicas que está sendo muito afetada (Figura 4B). A função biológica mais significativamente afetado foi o cancro (

p Art 1 × 1010), com outras funções significativamente afectadas, incluindo a morfologia do tumor, danos e reparação do ADN e morte celular. (Tabela S7 mostra genes representativos nos vários destes grupos funcionais.) A desregulação destas funções biológicas em células não-cancerosas sugere a perda de ATM, com mudanças associadas nos níveis de expressão de miARN, pode predispor ou conduzir os estágios iniciais de formação do cancro.

Discussão

Através do seqüenciamento profunda de todo o genoma, ganhamos informações sobre praticamente todos os pequenos RNAs presentes em ambos os tipo selvagem e células humanas normais ATM deficientes mamárias epiteliais, não apenas aqueles que são altamente expresso. Foram identificados 259 miRNAs robustamente expressas presentes em ambos os tipo selvagem e células humanas normais ATM deficientes mamárias epiteliais. Enquanto ATM tem sido implicada na biogénese de miARN após danos no ADN [46], uma investigação completa do efeito da depleção de ATM em HME-CCS revela que a depleção da própria ATM tem tanto o esperado a sub-regulação de miARN, bem como um número significativo de miRNAs up-regulamentados. Apenas um terço dos miARNs significativamente regulados diminuíram expressão após o esgotamento da ATM. Com base na presença de miARNs regulado para cima após a depleção ATM, especula-se que o papel de ATM em realizar a expressão de miARN não está limitado a miARN biogénese e poderiam estar a ocorrer através de vários mecanismos. Além disso, a perda de ATM tem sido associado com um aumento do nível do stress oxidativo [47], [48]. Especulamos o nível mais elevado de estresse oxidativo desencadeada pela perda constitutiva de ATM pode ter um efeito sobre os níveis de expressão de diversos miARNs. O esgotamento, ou perda, de ATM pode ser a condução de mudanças na expressão de miRNA através do aumento do estresse oxidativo. Vários miARNs visto ter expressão alterada após a depleção de ATM também têm sido mostrados para ser regulada pelo stress oxidativo elevado, tais como HSA-miR-200 ° C [49]. Estudos adicionais são necessários para determinar se os catadores espécies reativas de oxigênio pode mitigar as mudanças miRNA ou alterações fenotípicas observadas com o esgotamento ou perda de ATM.

Quando comparamos a expressão miRNA entre o tipo selvagem e HME- ATM deficiente CCs descobrimos que os miRNAs dis-reguladas após o esgotamento de ATM mostram uma correlação invulgarmente elevado com miRNAs envolvidos no câncer. Dos 81 miRNAs significativamente regulados, o esgotamento dos ATM dirigiu a repressão de 4 supressores tumorais conhecidos miRNA eo sobre-expressão de 7 oncomirs conhecidos. Esta observação inicial sugere um meio pelo qual a perda de ATM pode predispor as células de cancro ou aumentar a susceptibilidade de cancro.

Para investigar adicionalmente o papel dos miARNs nas células ATM-deficientes, combinamos a miARN significativamente regulada e dados de expressão gênica de prever e avaliar as possíveis combinações alvo miRNA-RNAm. Cerca de metade dos miRNAs significativamente regulados havia previsto alvos que também foram diferencialmente reguladas, como visto em nossa análise de expressão gênica. Quando investigamos ainda mais esses miRNA e possíveis alvos destacamos evidência adicional de um perfil de câncer susceptibilidade em células epiteliais mamárias humanas ATM-deficientes. Isso inclui o aumento da regulamentação dos oncogenes MAF e CEPBA, bem como a regulação diminuição do supressor de tumor SOCS1.

Compreender os perfis de miRNA do genoma de células epiteliais mamárias não-cancerosas normais e ATM com deficiência pode nos ajudar obter uma melhor compreensão dos papéis da ATM e miRNAs na tumorigênese do câncer de mama e a transição do não-cancerosas ao tecido mamário maligno.

de particular interesse é a possibilidade de utilizar os níveis de expressão de miRNA para prever a suscetibilidade ao câncer ou formação antes de poder ser detectada por métodos de diagnóstico convencionais. As células do nosso estudo são células epiteliais mamárias humanas normais que não são derivados a partir de células cancerosas. Portanto, o aumento da expressão de oncomirs e a repressão de alguns miARNs supressores de tumores em células ATM deficientes sugerem que pode ser possível desenvolver biomarcadores para a predisposição para o cancro da mama. Utilizando perfis de biomarcadores miRNA consistentes com predisposição ao câncer de mama permitiria a identificação precoce de pacientes que estão em risco e talvez levar a anterior monitoramento, detecção e tratamento.

Conclusão

Em conclusão, 81 miRNAs com expressão ATM-dependentes têm sido identificados. Estes miARNs, juntamente com os seus alvos de ARNm putativos, sugerem que elas podem desempenhar um papel nas fases iniciais de transição do normal para células epiteliais mamarias cancerosas. Este estudo fornece dados preliminares que sugerem que a combinação de microRNA e expressão do mRNA pode ser de valor para o desenvolvimento de um biomarcador para predizer a predisposição ao câncer de mama. Ao identificar as células e pacientes com um maior potencial para a formação de câncer de mama, as recomendações podem ser feitas envolvendo monitoramento e intervenção precoce.

Informações de Apoio

Tabela S1.

Sequence contar para todos os 939 miRNAs anotados. Etiquetas por milhão count (TPM) sequência para todos os 939 microRNAs anotados na pista hg19 WgRNA do navegador UCSC Genome

doi: 10.1371. /Journal.pone.0064779.s001

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Tabela S2.

Sequence contam para 259 miRNAs presentes. contagem de sequência para os 259 miRNAs considerados presentes (acima de 10 TPM) em qualquer 2 de 3 de tipo selvagem replica ou 2 de 3 repetições ATM deficiente

doi:. 10.1371 /journal.pone.0064779.s002

( PDF)

Tabela S3.

81 miRNAs dependente da ATM. 81 microARNs determinada para ter uma mudança significativa na expressão em células ATM deficientes em comparação com os controlos do tipo selvagem. T-test

p

≤0.05; Dobre Alterar +/- 1,5 ou maior

doi:. 10.1371 /journal.pone.0064779.s003

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Tabela S4.

1086 mRNAs dependente da ATM. 1086 sondas de ARNm determinada para ter mudanças significativas de expressão em células deficientes em ATM, em comparação com células de controlo do tipo selvagem. T-test

p

≤0.05; Dobre Alterar +/- 1,5 ou maior

doi:. 10.1371 /journal.pone.0064779.s004

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Tabela S5.

40 miRNA e 202 metas mRNA. Lista de 40 miRNAs significativamente regulados com correlação negativa previsto alvos de mRNA eo mRNA 202 previu alvos com mudanças significativas na expressão gênica. A direcção da mudança (aumento ou diminuição) das células ATM deficientes em comparação com as células WT é indicado para ambos os miARNs (coluna 2) e o gene de alvos (mRNA) (coluna 4)

doi:. 10.1371 /Journal .pone.0064779.s005

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Tabela S6.

factores de transcrição alvo potencial. Fatores de transcrição identificados como possíveis alvos de miRNAs significativamente regulados usando o banco de dados assinaturas moleculares de GSEA

doi:. 10.1371 /journal.pone.0064779.s006

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Tabela S7.

genes representativos das categorias funcionais específicas. Exemplos de genes alvo implicada em Câncer, regulação do ciclo celular e DNA replicação, recombinação e reparo com base em Ingenuity Pathway Analysis

doi:. 10.1371 /journal.pone.0064779.s007

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Agradecimentos

os autores gostariam de reconhecer o NIEHS Microarray core e do NIH Intramural Sequencing núcleo por seu trabalho sobre este manuscrito. Além disso, os autores gostariam de agradecimento Drs. Paul Wade e Douglas Bell por suas sugestões úteis e avaliação crítica do manuscrito.