Abstract

cancros espontâneos caninos são doenças comuns em cães. Entre estes, alguns cancros malignos como o melanoma oral, osteosarcoma, hemangiossarcoma, e tumor de mastócitos são muitas vezes reconhecidos como problemas clínicos, porque, apesar de suas altas frequências, os tratamentos atuais para estes tipos de câncer não pode sempre alcançar resultados satisfatórios. A ausência de terapias sistémicas eficazes contra esses tipos de câncer leva os pesquisadores a investigar novas modalidades terapêuticas, incluindo a imunoterapia. morte programada 1 (PD-1) é um receptor co-estimulador com função imunossupressora. Quando se liga os seus ligandos, ligando PD-1 (PD-L1) ou PD-L2, PD-1 em células T negativamente regula a activação sinais do receptor da célula T, resultando na inibição da função efectora de linfócitos T citotóxicos. Expressão aberrante PD-L1 tem sido relatada em muitos cancros humanos e é considerado um mecanismo de escape imune para cancros. Em ensaios clínicos, os anticorpos anti-PD-L1 anti-DP-1 ou a regressão do tumor induzido por várias doenças malignas, incluindo melanoma avançado, carcinoma do pulmão de células não pequenas, e carcinoma de células renais. Neste estudo, para avaliar o potencial dos PD-1 /Pd-eixo L1 como um novo alvo terapêutico para a imunoterapia do cancro canino, foi realizada análise imunohistoquímica da expressão da DP-L1 em ​​vários cancros malignos de cães. Aqui, mostramos que o cão melanoma oral, osteosarcoma, hemangiossarcoma, tumor de mastócitos, adenocarcinoma mamário, e adenocarcinoma de próstata expressa PD-L1, enquanto alguns outros tipos de câncer não o fez. Além disso, PD-1 foi altamente expressa em linfócitos infiltrantes de tumor obtidos a partir de melanoma oral, mostrando que os linfócitos neste tipo de cancro pode ter sido funcionalmente esgotado. Estes resultados encorajam fortemente a aplicação clínica de 1 PD-inibidores /PD-L1, enquanto novos agentes terapêuticos contra esses tipos de câncer em cães

Citation:. Maekawa N, Konnai S, Okagawa T, Nishimori A, Ikebuchi R, Izumi Y, et al. (2016) Análise imuno-histoquímica de PD-L1 expressão em cânceres malignos caninos e PD-1 expressão em linfócitos no Canine melanoma oral. PLoS ONE 11 (6): e0157176. doi: 10.1371 /journal.pone.0157176

editor: Hiroshi Shiku, Mie University Graduate School of Medicine, JAPÃO

Recebido: 24 de dezembro de 2015; Aceito: 25 de maio de 2016; Publicação: 08 de junho de 2016

Direitos de autor: © 2016 Maekawa et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. Todos relevante os dados estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por um Grant-in-Aid para a Investigação Científica (Grant Número 16K15042) e Grant-in-aid para jsps Fellows (Grant Número 15J01989) do Japão Sociedade para a Promoção da Ciência (JSPS). Esta pesquisa é (parcialmente), apoiado pela Plataforma para Drug Discovery, Informática, e Vida Structural Science (Proposta No. 2157) da Agência Japonesa para a Investigação e Desenvolvimento da Medicina (AMED). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Cães costumam desenvolver cancros espontâneos, que podem causar a morte [1] ou reduzir a qualidade de vida dos pacientes. Entre as neoplasias malignas, linfoma, tumor de mastócitos (MCT), osteossarcoma (OS), sarcoma de tecido mole, e carcinoma mamário são relativamente frequentes [2,3] e, muitas vezes reconhecido como doenças fatais em ambientes clínicos. melanoma oral e hemangiossarcoma (HSA) são também comuns neoplasias em cães, e cães de pacientes com estes tipos de cancro normalmente têm mau prognóstico [4,5]. Os padrões de cuidado para cada tipo de câncer foram estabelecidas com sucesso e melhoraram o prognóstico; no entanto, os resultados do tratamento nem sempre são satisfatórios por causa das baixas taxas de resposta a moderada ou prolongamento limitado de tempos de sobrevivência.

Imunoterapias têm potencial como novos opções de tratamento para o câncer. Entre aqueles, os inibidores de checkpoint imunes, tais como anti-morte programada de 1 (PD-1) e 1 anticorpos (PD-L1) anti-ligando-DP apresentaram efeitos promissores em várias doenças malignas em seres humanos [6,7]. A molécula checkpoint imune DP-1 é um receptor de CD28-família, o qual suprime as respostas imunes. DP-1 em células T regula negativamente a sinalização do receptor de células T e inibe a indução de citoquinas, tais como o interferão gama (IFN-γ), interleucina 2, e factor de necrose tumoral alfa, bem como a proliferação celular, permitindo que a manutenção da tolerância periférica ou o persistência de certos patógenos no hospedeiro [8]. Dois ligandos para DP-1 foram relatados: PD-ligando 1 (PD-L1) e PD-L2. expressão PD-L2 está restrito a certos tipos de células ou tecidos, tais como macrófagos e células dendríticas, enquanto a expressão de DP-L1 pode ser induzida em uma ampla variedade de tipos de células, incluindo células não-hematopoiéticas. PD-expressão de L1 não é encontrado na maioria dos tecidos normais; No entanto, a sua expressão é relatada em várias células tumorais [9,10] e, portanto, é considerada como um dos mecanismos de evasão imunológicas para o cancro. No carcinoma de células renais, cancro gástrico, e outros pacientes de cancro, a expressão PD-L1 é conhecida por estar associada com mau prognóstico [10-12], indicando que o PD-L1 pode ser um regulador importante do sistema imunitário quando se luta contra o cancro . drogas de anticorpos que têm como alvo esta via interferir com a ligação de PD-L1 para DP-1 e podem aumentar as respostas imunitárias específicas para células tumorais [13,14], subsequentemente, resultando na regressão do cancro [15]. Um certo número de ensaios clínicos revelaram que as respostas objectivas podem ser obtidos com anticorpos anti-PD-L1 em ​​pacientes com cancros malignos, incluindo melanoma avançado, carcinoma do pulmão de células não pequenas, e carcinoma das células renais [6 anti-DP-1 ou, 7], e acumulando evidências demonstra o potencial de inibidores de ponto de verificação do sistema imunológico no tratamento do câncer.

no entanto, existem poucos relatórios sobre o 1 PD-/PD-L1 eixo em cães, e sua associação com doenças continua a ser elucidado. Anteriormente, relataram que o PD-L1 é expresso no melanoma cão, MCT, e carcinoma de células renais e que o bloqueio de PD-L1 por um anticorpo anti-PD-L1 aumenta a produção de IFN-γ pelas células que se infiltram no tumor [16]. Estes resultados sugerem que os anticorpos anti-PD-L1 pode ter efeitos terapêuticos sobre cancros em cães. Neste estudo, para avaliar quais tipos de câncer poderiam ser alvo, expressão PD-L1 em ​​cancros malignos cão foi investigado. Aqui, mostramos que cão melanoma oral, SO, HSA, MCT, adenocarcinoma mamário, da próstata e adenocarcinoma expressar PD-L1, o que sugere que o eixo de DP-1 /PD-L1 pode ser usada como um mecanismo de evasão imune nestes cancros. Em apoio a esta hipótese, PD-1 foi regulada positivamente a expressão em linfócitos infiltrantes de tumor obtidos a partir de melanoma oral e tumores hepáticos. Pelo menos, os potenciais terapêuticos de bloqueadores /PD-L1 em ​​melanoma oral e de outros cancros PD-L1-positivos 1 PD-merece uma investigação mais aprofundada.

Materiais e Métodos

amostras caninas

o uso de animais ao longo deste estudo foi aprovado pelo Comitê de Cuidado e uso Institucional animal (o número de série de aprovação foi # 15-0149), Universidade de Hokkaido. Nenhum animal foi sacrificado para a finalidade do presente estudo. amostras clínicas de tecidos tumorais de cães foram retirado cirurgicamente no Hospital de Ensino Veterinário da Faculdade de Pós-Graduação de Medicina Veterinária, Universidade de Hokkaido e em hospitais veterinários na cidade de Sapporo, em 2014-2015. Mediante o uso para este estudo, o consentimento informado foi obtido de todos os proprietários de cães. Amostras de sangue periférico de cães clinicamente saudáveis ​​foram coletadas de beagles com a idade de 12-15 anos manteve no Centro Experimental Animal, Faculdade de Medicina Veterinária da Universidade Hokkaido.

A citometria de fluxo

Para avaliar a especificidade de ligação de um anticorpo recentemente criado anti-PD-L1 monoclonal (mAb) [17], de citometria de fluxo de análise foram realizadas como descrito anteriormente [16], com algumas modificações. Em resumo, linhas caninas de células de melanoma, CMEC e CMM-1, que são PD-L1-negativa sob condições normais [16], foram transfectadas com o vector pEGFP-N2 ou o vector pEGFP-N2-CPD-L1 [16] usando Lipofectamine 2000 (Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. Um dia após a transfecção, as células foram recolhidas e coradas com um anticorpo de controlo de isotipo coincidente (IgM de rato) anti-PD-L1 mAb 6G7-E1 ou (BD Biosciences, San Jose, CA, EUA) a uma concentração final de 10 ug /ml. Após lavagem, as células foram incubadas com um anticorpo anti-Ig de rato conjugado anticorpo-aloficocianina (Beckman Coulter, Fullerton, CA, EUA). A fluorescência foi analisada por um FACSVerse citómetro de fluxo (BD Biosciences) e o software de FCS Express 4 (De Novo Software, Glendale, CA, EUA). Para as células transf ectadas, (EGFP) -positivas células proteína fluorescente verde foram melhoradas fechado e utilizado para análise.

Para avaliar se um PD-expressão é regulada positivamente no contexto de cancros canino, análise citométrica de fluxo foi realizada com cruz PD-1 Reativo anticorpo anti-humano [18]. As células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) e TILs de tecidos de tumor do cão recentemente excisadas foram obtidos como descrito anteriormente [16]. Todas as suspensões de células isoladas foram preparadas pelo método mecânico. As células foram coradas com concentrações óptimas de FITC-conjugado anti-CD4 /anti-CD8 cocktail de anticorpo conjugado com PE (ABD Serotec, Oxford, Reino Unido) e de DP-1 de anticorpo anti-humano biotinilado (R D Systems, Minneapolis, MN, EUA) durante 30 min à temperatura ambiente (TA). Após lavagem, as células foram incubadas com estreptavidina-APC eFluor 780 (eBioscience, San Diego, CA, EUA) durante 30 min à TA. A fluorescência das células foram analisadas por FACS verso e FACS Express 4 software. IgG normal de cabra biotinilado (R D systems) foi utilizado como um anticorpo de controlo de isotipo igualado. Para a análise, os linfócitos população foi fechado pelo FSC e SSC e dentro deles PD-1 expressão em CD4

+ células ou CD8

+ células foi avaliada.

Espécimes

Os espécimes foram selecionados aleatoriamente a partir fixados em formalina e embebidos em parafina tecidos de tumores malignos cão (110 amostras no total), que haviam sido enviados para diagnóstico histológico e mantidos em um laboratório de patologia comercial (North Lab, Hokkaido, Japão). Todas as amostras de melanoma (

N

= 40) usado neste estudo originado a partir da cavidade oral. As amostras MCT (

n

= 5) foram todos classificados em Patnaik grau III [19]. Para a amostra de adenocarcinoma mamário (

n

= 5) análise, há amostras de carcinoma mamário inflamatória foram incluídos. Além das amostras acima mencionadas, SO (

N

= 10), HSA (

N

= 10), adenocarcinoma da próstata (

N

= 5), pele carcinoma de células escamosas (

n

= 5), linfoma difuso de grandes células B (

n

= 5), adenocarcinoma nasal (

n

= 5), sarcoma de tecido mole (

n

= 5), sarcoma histiocitária (

n

= 5), carcinoma de células transicionais (

n

= 5), e carcinoma da glândula sac anal com doença metastática (

n

= 5) espécimes foram estudados por imuno-histoquímica.

imunohistoquímica

coloração imuno-histoquímica foi examinado pelo procedimento complexo avidina-biotina peroxidase (ABC). Secções (4 uM) foram desparafinados em xileno e hidratados através de álcoois graduados. Para remover da peroxidase endógena, as secções foram mergulhadas em uma solução de peróxido de hidrogénio a 3% à temperatura ambiente durante 10 min. Depois disso, as secções foram incubadas com anti-PD-L1-E1 anticorpo 6G7 (10 ug /mL). Após lavagem com solução salina tamponada com fosfato, as secções foram incubadas numa solução de anticorpo secundário (marcado com biotina de cabra anti-IgM de rato) (Jackson Laboratories ImmnunoResearch, West Grove, PA, EUA) à temperatura ambiente durante 30 min. Após a incubação, as secções foram feitos reagir usando a ABC no Kit de Vectastain Elite ABC (Vector Laboratories, Burlingame, CA, EUA) à temperatura ambiente durante 30 min. A visualização foi realizada utilizando uma solução de 3,3′-diaminobenzidina a 0,05%. mancha hematoxilina de Mayer foi utilizado como um corante de contraste. Para o controlo negativo, as secções foram submetidas aos mesmos procedimentos sem o anticorpo primário ou com o anticorpo de controlo do isotipo IgM de rato (Acris anticorpos, Herford, Alemanha). A amostra foi considerada positiva para a DP-L1 se houve evidência histológica de coloração de células. Nenhuma coloração óbvio foi observada nas secções de controlo negativo (S1 FIG). Para preparar os espécimes SO, descalcificação foi realizada utilizando um protocolo normalizado com solução de Plank-Rychlo. Azul de Berlim coloração foi realizada para identificar os depósitos de hemossiderina de coloração positiva nas amostras de HSA, quando necessário.

A análise estatística

Na análise de citometria de fluxo de expressão de DP-1, de Mann-Whitney U. foi conduzido e

p Art 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Resultados

anti-PD-L1-E1 anticorpo 6G7 se liga especificamente a

Os anticorpos anti-PD-L1 cão PD-L1

que pode se ligar ao cão PD-L1 foram estabelecidas anteriormente [16,17]. Entre aqueles, 6G7-E1 mostrou suficiente ligação como determinado por imuno-histoquímica de secções fixadas em formol e tumorais do cão encaixado em parafina. Para testar a especificidade de 6G7-E1 na detecção de cão PD-L1, primeiro tentaram análise de transferência de Western de proteína de fusão de Fc de IgG canina PD-L1-coelho [16] como um controlo positivo. No entanto, não se observou nenhuma ligação quando 6G7-E1 foi usado como o anticorpo primário, enquanto que um anticorpo de IgG anti-Fc de coelho detectada a banda específica (dados não mostrados). Uma vez que este resultado sugere que a 6G7-E1 reconhece uma conformação específica do cão PD-L1, citometria de fluxo e as linhas celulares de melanoma canino e CMEC CMM-1 foi realizado. Nenhuma ligação foi observado com o não-transfectadas ou falsamente (EGFP apenas) -transfected células de melanoma canino, enquanto 6G7-E1 foi ligado às células transfectadas com canino PD-L1-EGFP (Figura 1), indicando ligação específica de 6G7-E1 ao cão PD-L1.

linhas de células de melanoma canino, e CMEC CMM-1, foram transfectadas com o vector pEGFP-N2 (simulado) ou pEGFP-N2-CPD-L1, e a ligação do anticorpo foi analisada por um citometria de fluxo. A área sombreada, linha preta, e a linha vermelha representa os resultados para as células sem tratamento, as células transfectadas por simulação, e as células CPD-L1-EGFP-transfectadas, respectivamente. (A) A ligação do anticorpo de controlo do isotipo para CMEC; (B) ligação de 6G7-E1 para CMEC; (C) a ligação do anticorpo de controlo de isotipo para o CMM-1; e (D) de ligação de 6G7-E1 para CMM-1 estão apresentados os histogramas. Nenhuma ligação do 6G7-E1 foi observada nas células pseudo-transfectadas ou não transfectadas, ao passo que a ligação específica foi observada em células CPD-L1-EGFP-transfectadas.

cancros malignos Canine expressar PD-L1

a análise imunohistoquímica foi realizada para detectar a expressão de PD-L1 em ​​várias neoplasias malignas. No total, 110 indivíduos foram testados, entre os quais 36 melanoma oral, 7 SO, 6 HSA, 3 grau III MCT, 4 Adenocarcinoma Mamário, e 3 espécimes de adenocarcinoma de próstata foram PD-L1 positivo (Figuras 2 e 3, e Tabela 1). Ambos foram observadas coloração citoplasmática e a coloração da superfície celular. As taxas de expressão de DP-L1 foram de 90% (36/40) para melanoma oral, 70% (10/07) para OS, 60% (10/06) para HSA, 60% (05/03) para o MCT de grau III , 80% (05/04) para o adenocarcinoma mamário, e 60% (05/03) para o adenocarcinoma da próstata (Tabela 1). Os outros 7 tipos de tumores, ou seja, o carcinoma de células escamosas, linfoma difuso de grandes células B, adenocarcinoma nasal, sarcoma dos tecidos moles, sarcoma histiocítico, carcinoma de células de transição, e carcinoma das glândulas saco anal não expressam PD-L1, embora o tamanho da amostra testada foi substancialmente limitada (5 casos para cada tipo de tumor).

formalina-fixo e tecidos tumorais embebidos em parafina foram examinadas imunohistoquímica. Os cortes foram corados com anti-PD-L1 mAb 6G7-E1. colorações positivas representativas de (A, B) osteossarcoma melanoma oral, (C, D), e (E, F) são mostrados hemangiossarcoma. Ampliação original: (A, C, E) 200 ×; (B, D, F) 400 ×.

formalina-fixo e tecidos tumorais embebidos em parafina foram examinadas imunohistoquímica. Os cortes foram corados com anti-PD-L1 mAb 6G7-E1. colorações positivas representativas de (A, B) mastocitoma, (C, D) de adenocarcinoma mamário, e (E, F) de adenocarcinoma da próstata são mostrados. Ampliação original: (A, D, E) 200 ×; (B) 400 ×; (C) 100 ×.

PD-1 é altamente expresso em linfócitos infiltrantes de tumor (TIL) em canino melanoma oral

A fim de avaliar o nível de expressão DP-1 em linfócitos associados a tumores, TIL foram obtidos a partir de tecidos de cancro cirurgicamente excisadas, e análise de citometria de fluxo foi realizada. Em comparação com linfócitos de sangue periférico a partir de cães saudáveis, PD-1 foi altamente expressa tanto em CD8

+ e CD4

+ TIL de melanoma oral (Fig 4,

P

0,05). A taxa positiva de PD-1 expressão em CD8

+ ou CD4

+ TIL foi 70,9-96,6% ou 80,2-96,8%, respectivamente (Tabela 2). No caso de tumores hepáticos, células de controlo mais óptimas estavam disponíveis; foram utilizados linfócitos infiltrantes de tecido normal (NILS) dos mesmos indivíduos. Tanto no adenoma hepatocelular e no adenocarcinoma hepatocelular, TILs teve maior expressão de DP-1 do que o NIL (Fig S2), indicando que a regulação positiva da expressão de DP-1 pode ser um fenótipo comum para TILs.

TILs foram recolhidas a partir de cirurgicamente excisadas tecidos de melanoma orais e o nível de PD-1 expressão foi avaliada por citometria de fluxo. O painel esquerdo, PD-1 expressão em CD8

+ linfócitos. painel direito, PD-1 expressão em CD4

+ linfócitos. células mononucleares do sangue periférico (PBMC) obtidas de cães saudáveis ​​foram utilizados como controle (controle saudável, HC).

p Art 0,05 foi considerado estatisticamente significativo (Mann-Whitney U).

Discussão

O melanoma é um tipo relativamente comum de tumor, que responde por 7% de todas as neoplasias malignas e é a malignidade oral mais frequente em cães [20]. melanoma maligno canina pode ocorrer na pele de cabelo, cavidade oral, leito ungueal, almofada da pata, olho, ou junção mucocutânea [20]. Entre essas formas, melanoma oral é considerado um câncer altamente maligno porque provoca frequentemente invasão local grave e doença metastática. Infelizmente, melanoma oral é geralmente resistentes à quimioterapia, tornando-o difícil de tratar lesões metastáticas, que, eventualmente, matar cães doentes [21]. A ausência de terapia sistémica eficaz incentiva o desenvolvimento de novas modalidades terapêuticas, incluindo imunoterapias. Nos seres humanos, os inibidores de checkpoint imunes, tais como anticorpos anti-PD-L1 anti-DP-1 e têm sido utilizados para o tratamento de melanoma avançado, mostrando eficácias promissores, com as taxas de resposta objectiva de 28% e 18%, respectivamente [6, 7]. Neste estudo, a análise imuno-histoquímica demonstrou que tanto como 90% (36/40) de cão melanoma oral, PD-L1, o que sugere que a DP-1 /eixo PD-L1 é um dos principais mecanismos de evasão imune para este tipo de cancro . Este resultado é bem consistente com o nosso relatório anterior, que mostrou que 100% (08/08) de melanoma oral, PD-L1, ao passo que mais de melanoma excisada do olho ou da pele não expressam PD-L1 [16]. Além disso, de acordo com estes resultados, PD-1 foi altamente expresso em ambos CD8

+ e CD4

+ TIL obtido a partir de melanoma oral. Estes TILs parecia funcionalmente esgotado devido motivos imunossupressores, que suprimem as funções efectoras de células T em ratinhos e humanos, é altamente conservada em cão PD-1 [16]. Considerando que o cão de ações melanoma maligno algumas semelhanças com melanoma humano, inibidores da PD-1 eixo /PD-L1 também pode proporcionar efeitos terapêuticos contra o cão melanoma oral, e os cães poderia ser um bom modelo animal para investigar aspectos terapêuticos da PD-1 /PD-L1 inibidores contra melanoma em estudos clínicos.

oS é o câncer ósseo mais comum em cães, conhecidos por suas características altamente metastáticas. Com sozinho amputação, MST para cães com sistema operacional é apenas 19 semanas e cerca de 90% dos cães desenvolvem lesões metastáticas [22,23]. Portanto, a cirurgia agressiva em combinação com quimioterapia sistémica tem sido um tratamento padrão para OS canino, e novas terapias sistêmicas precisam ser investigadas. Nos seres humanos, os anticorpos anti-PD-L1 Espera-se que têm efeitos terapêuticos sobre OS porque cerca de 75% (12/16) de SO metastático mostrou expressão de DP-L1. Em um modelo de rato, um anticorpo anti-PD-L1 melhorada a função de linfócitos T citotóxicos e aumentou a sobrevivência de murganhos portadores de tumores [24]. Uma vez que 70% (7/10) do sistema operacional primário em cães foram encontrados para expressar PD-L1, anticorpos de bloqueio também pode ter uma eficácia terapêutica contra SO canino. No entanto, pode ser importante notar que, em contraste com as suas lesões metastáticas, nenhum sistema operacional primário humano expresso PD-L1 [24], enquanto que primária cão OS expressa PD-L1 a uma taxa elevada. A diferença na expressão de DP-L1 deve ser tomado em consideração cuidadosa ao extrapolar resultados obtidos em estudos humanos para OS OS canino ou vice-versa.

Os cães têm um risco relativamente elevado para o desenvolvimento de HSA [25], que é um maligno cancro proveniente de células endoteliais vasculares. Considerando que o cão HSA é altamente metastático, quimioterapia adjuvante continua a ser importante, embora possa fornecer apenas um benefício modesto em tempos de sobrevivência [26]. Porque angiosarcoma é uma doença rara em seres humanos, os relatórios sobre a expressão PD-L1 no angiosarcoma têm sido limitados [27,28], e sua implicação terapêutica não tem sido bem estudada. Porque a expressão PD-L1 foi encontrada em 60% (10/06) das amostras de HSA cão, vale a pena investigar o potencial terapêutico dos inibidores /Pd-L1 como novas imunoterapias sistémicas para cão HSA 1-PD. PD-expressão de L1 na HSA pode partilhar as suas características de originando células endoteliais vasculares, porque as células endoteliais vasculares expressam PD-L1, em resposta a diversas citocinas, tais como IFN [29,30]. Pode ser razoável sugerir que HSA utiliza o DP-1 /eixo PD-L1 como um mecanismo de evasão imune porque PD-L1 em ​​células endoteliais vasculares foi reportado para regular negativamente CD8

+ respostas de células T, tais como IFN- γ produção e actividade citolítica [30].

MCT é o câncer cutâneo mais comum em cães, sendo responsável por até 21% de todas as neoplasias de pele canina [31]. Embora o comportamento clínico do MCT pode variar, de graduação histológica [19] é amplamente utilizada e ser considerada como um factor de prognóstico fiável para cães MCT. De acordo com Bostock

et al

., Para o alto grau ou MCT indiferenciado, MST é de apenas 13 semanas [32] ea taxa metastático é tão alta quanto 56 a 96%. Neste estudo, de grau elevado (Patnaik grau III) MCT foi analisada para a expressão de DP-L1, e 60% (05/03) das amostras foram coradas positivamente. Este resultado também é bem consistente com o nosso relatório anterior, em que 66,7% (06/04) de grau III os MCTs mostraram expressão de DP-L1 [16]. Apesar de algumas drogas de quimioterapia citotóxica e inibidores da quinase KIT tirosina, tais como imatinib e toceranib têm sido utilizados para tratar MCT sistemicamente, inibidores de checkpoint imunes alvo a DP-1 /eixo PD-L1 também ter o potencial de ser incluído no tratamento de MCT, pois o surgimento de resistência aos medicamentos é muitas vezes observado durante a quimioterapia, incluindo a com inibidores kit. Embora a expressão de DP-L1 no grau I ou II MCT continua a ser investigado, expressão PD-L1 pode estar relacionada com o comportamento biológico de MCT, pois conduz

+ supressão de células T CD8 e facilita a metástase em modelos de cancro do rato [33 ]. Novos estudos são necessários para avaliar se a expressão PD-L1 poderia ser usado como um marcador de prognóstico para esse tipo de câncer complicado e heterogêneo.

tumores da glândula mamária são as neoplasias mais comuns em cadelas sexualmente intactos, sendo responsável por 70% das todos os casos de câncer nesta subpopulação [34]. Dentre os tumores mamários malignos, adenocarcinoma mamário representa um histopatologia comum e cães com adenocarcinoma mamário tratado por cirurgia sozinha, por vezes, sofre de uma recorrência e /ou metástases. A quimioterapia tem alguns benefícios para neoplasias mamárias; no entanto, em muitos casos, não é curativa e alternativo ou adicional terapias sistêmicas precisam ser exploradas. Nos seres humanos, a expressão de DP-L1 em ​​células tumorais foi observado em 34% (15/44) dos pacientes com cancro da mama, e a sua expressão foi significativamente correlacionado com alguns factores de prognóstico importantes, tais como a expressão de receptores de hormonas [35]. Em cães, 80% (05/04) das amostras de adenocarcinoma mamário expressa PD-L1, embora a sua associação com o prognóstico permanece obscura. Uma outra investigação da relação entre o estado de expressão de DP-L1 e o prognóstico no caso de tumores mamários caninos deve ser conduzido, e que vale a pena para, pelo menos, avaliar o potencial terapêutico de inibidores /PD-L1 como romance 1 PD- terapias sistémicas contra esse tipo de câncer.

adenocarcinoma de próstata é uma doença relativamente rara em cães machos. Embora a incidência é baixa, adenocarcinoma de próstata muitas vezes surge como um problema clínico porque progressão e metástase local são as sequelas comum. No momento do diagnóstico, metástases regionais e distantes podem ser encontradas na maior parte dos casos, e MSTs para cães sem tratamento são considerados como sendo menos do que um mês [36]. Até à data, não há consenso para o padrão de cuidado tenha sido alcançado, e tratamentos convencionais, tais como cirurgia, radioterapia, quimioterapia e são paliativos na maioria dos cães. Nos seres humanos, 50% (8/16) do cancro da próstata resistente à castração foram relatados (CRPC) dos casos de expressar PD-L1 [37]; No entanto, nenhum dos pacientes que receberam CRPC um anticorpo anti-DP-1 tinha uma resposta objectiva em um ensaio clínico [6]. Sem resposta nos pacientes CRPC é possivelmente devido à ausência de expressão PD-L1 nos tecidos tumorais, embora apenas algumas amostras dos pacientes inscritos foram examinados e considerados PD-L1-negativos [6,38]. Neste estudo, PD-L1 foi expressa em 60% (05/03) das amostras de adenocarcinoma da próstata cão, mas as suas implicações terapêuticas permanecem obscuros. Outros estudos da associação de expressão PD-L1 com o resultado do tratamento deve ser conduzido, e os cães poderia ser um modelo animal poderoso para o câncer de próstata humana, porque ações adenocarcinoma de próstata cão algumas características com câncer de próstata humana em termos de sua ocorrência espontânea, propensão metastática e expressão PD-L1.

Os outros tipos de câncer testadas neste estudo não mostrou qualquer expressão PD-L1. A ausência de expressão de DP-L1 nestes tumores pode ser devido a diferenças na origem das células de tumor, localização do tumor, e /ou imunológica de cada condição do cancro. Porque o tamanho da amostra testada neste estudo foi muito pequeno, uma análise mais aprofundada deve ser realizada antes de fazer uma conclusão sobre o estatuto expressão de PD-L1 nesses cancros. Recentemente, os mecanismos de regulação da expressão de PD-L1 em ​​humanos têm sido amplamente estudados. Um dos mecanismo para a indução de expressão de DP-L1 em ​​células tumorais é em resposta ao IFN-γ [9], que é provavelmente produzido por células do sistema imunológico no microambiente do tumor durante as respostas imunes antitumorais. Porque a expressão PD-L1 em ​​linhas celulares de cancro canino foi induzida ou aumentada por tratamento com IFN-γ canina [16], este mecanismo é também susceptível de ser envolvido na regulação da DP-L1 em ​​cães. Outro mecanismo está associada com a sinalização oncogénica; a perda da função de fosfatase e tensina homólogo (PTEN) tem sido relatado para regular a expressão de DP-L1 em ​​glioma e células de cancro da mama triplo-negativos [39,40]. Em cães, uma mutação e /ou perda de PTEN também foram relatados em pacientes com melanoma, OS, HSA, e neoplasias mamárias malignas [41-44]. Isso pode contribuir, pelo menos em parte, à expressão aberrante PD-L1 no esses tipos de câncer em cães.

Para o melhor de nosso conhecimento, este é o primeiro relatório de expressão PD-L1 em ​​vários cancros malignos caninos . Análise da expressão de DP-L1 tem implicações importantes na aplicação clínica de 1 PD-inibidores /PD-L1 em ​​cães porque, em ensaios clínicos em humanos, com um anticorpo anti-DP-1, a expressão de DP-L1 foi relatado para ser associado com a o resultado do tratamento. Os pacientes com tumores PD-L1-positivos tinham uma taxa de resposta objectiva de 36%, enquanto que nenhum dos pacientes com tumores PD-L1-negativas tinha uma resposta objectiva [6]. Nossos dados fornecem informações básicas sobre o envolvimento do eixo /PD-L1 em ​​imunologia câncer canino e fortemente incentivar o desenvolvimento de novas imunoterapias 1 PD-alvo a PD-1 /PD-L1 via em cães. Como os anticorpos anti-PD-L1 foram mostrados para ter potencial terapêutico para o câncer canino [16], as aplicações clínicas de anticorpos anti-PD-L1 merecem uma investigação mais aprofundada.

Informações de Apoio

S1 Fig. imunohistoquímica representante com o anticorpo controlo de isotipo.

espécime melanoma oral foi corado com anticorpo IgM de rato de controlo de isotipo. Não se observou qualquer coloração. ampliação original, a 200 ×

doi:. 10.1371 /journal.pone.0157176.s001

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S2 Fig. DP-1 em TILs expressão obtidos a partir de tumores hepáticos.

TILs obtido a partir de (A), adenoma hepatocelular e (B) adenocarcinoma hepatocelular foram analisadas para expressão PD-1 por citometria de fluxo (linha vermelha). linfócitos infiltrantes de tecido normal (NILS) obtidos a partir de tecido saudável do fígado adjacente dos mesmos indivíduos (linha azul) foram utilizados como controle. linha preta, de controlo de isotipo para TIL. área sombreada, controlo de isotipo para Nils

doi:. 10.1371 /journal.pone.0157176.s002

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