Abstract

Fundo

Temos demonstrado anteriormente que a expressão de CBX7 é drasticamente diminuída em vários carcinomas humanos e que a sua expressão diminui progressivamente com a aparência de um fenótipo altamente maligno. O objetivo do nosso estudo foi investigar o mecanismo pelo qual a perda de expressão CBX7 pode contribuir para o surgimento de um fenótipo mais maligno.

Métodos

Foram analisados ​​o perfil de uma expressão genética a linha de células de carcinoma da tiróide após a restauração da CBX7 e, em seguida, analisada a regulação da transcrição de genes identificados. Finalmente, avaliamos a expressão de CBX7 e genes regulados em um painel de tireóide e pulmão carcinomas.

Resultados

Nós descobrimos que CBX7 negativa ou positivamente regula a expressão de vários genes (como SPP1 , SPINK1, STEAP1, e FOS, FOSB, EGR1, respectivamente) associado à progressão do cancro, através da interacção com as suas regiões promotoras e modular a sua actividade de transcrição. análises RT-PCR quantitativo em tecidos de tireóide e carcinoma de pulmão humano revelou uma correlação negativa entre CBX7 e seus genes regulados por baixo, enquanto uma correlação positiva foi observada com genes up-regulamentados.

Conclusão

em conclusão, a perda de expressão CBX7 pode desempenhar um papel crítico em estágios avançados de carcinogênese através da desregulamentação a expressão de genes específicos efetoras

Citation:. Pallante P, Sepe R, Federico a, Forzati F, Bianco M, Fusco a (2014) CBX7 Modula a expressão de genes críticos para o cancro progressão. PLoS ONE 9 (5): e98295. doi: 10.1371 /journal.pone.0098295

editor: Tanya V. Kalin, Hospital Infantil de Cincinnati Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 03 de outubro de 2013; Aceito: 30 de abril de 2014; Publicado em: 27 de maio de 2014

Direitos de autor: © 2014 Pallante et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada por doações de: Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro-AIRC (IG 5346), Ministero dell’Università e della Ricerca Scientifica e Tecnologica-MIUR (PRIN 2008), “Progetto di Interesse strategico (Programa PNR-CNR Envelhecimento) Invecchiamento PNR-CNR 2012-2014 “e Progetto PON01-02782:” Nuove strategie nanotecnologiche per la messa a punto di farmaci e Presidi diagnostici diretti verso cellule cancerose circolanti “. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Os autores confirmam que Pierlorenzo Pallante e Alfredo Fusco são editores acadêmicos da PLoS ONE. Pierlorenzo Pallante e do estado Alfredo Fusco que isso não altera a sua adesão a PLOS ONE políticas e critérios editoriais.

Introdução

CBX7 é membro proteína Polycomb do Polycomb repressivo complexo 1 (PRC1), um complexo multiproteico que, em conjunto com o complexo repressor Polycomb 2 (PRC2), mantém importantes genes de desenvolvimento num estado transcricionalmente reprimida [1] – [3]. Temos demonstrado anteriormente que o gene CBX7 é drasticamente sub-regulada em carcinomas da tiróide e sua expressão diminui progressivamente com o grau maligno e estágio neoplásica [4]. Além disso, outros estudos demonstraram que a correlação da perda de CBX7 com um fenótipo altamente maligno e o consequente mau prognóstico é um caso geral em oncologia. De facto, a perda de expressão CBX7 foi recentemente mostrado para ser associado com o aumento do grau de malignidade no cólon [5], bexiga [6], pancreático [7], da mama [8], gástrico carcinoma do pulmão [9] e [10] , enquanto que a retenção de expressão CBX7 se correlaciona com um tempo de sobrevivência do cólon e doentes com cancro pancreático [5], [7]. O restabelecimento da expressão CBX7 na tiróide, linhas de células gástricas e do carcinoma do cólon inibe o crescimento celular com uma acumulação de a população de células na fase G1 do ciclo celular, o que sugere um papel negativo de CBX7 no controlo da transição G1 /S do ciclo celular.

tem sido recentemente demonstrado que CBX7 é capaz de regular positivamente a expressão do gene que codifica para a e-caderina [11] que é conhecida por desempenhar um papel crítico na manutenção da morfologia das células epiteliais normais, e cuja perda de expressão representa uma característica geral da transição epitelial-mesenquimal [12], [13]. De facto, tem sido mostrado que CBX7 é capaz de preservar a expressão de E-caderina através da interacção com a histona-desacetilase 2 e inibir a sua actividade sobre o promotor CDH1 [11]. Consistentemente, uma correlação directa entre os níveis de E-caderina e CBX7 tem sido relatada em carcinomas da tiróide e pancreáticas [7], [11]. Portanto, estes resultados sugerem que a perda da expressão do gene CBX7 pode desempenhar um papel crítico nas fases tardias da progressão do carcinoma humano.

O papel de supressor de tumor CBX7 foi muito recentemente confirmado pelo fenótipo de cbx7 camundongos knockout. Com efeito, estes murganhos desenvolvem adenomas e carcinomas do pulmão e do fígado, e em conformidade, fibroblastos de rato embrionários (MEFs) derivados a partir de ratinhos knockout cbx7 têm uma taxa de crescimento mais elevada e uma susceptibilidade reduzida à senescência do que as suas contrapartes de tipo selvagem [10]. Ciclina E a sobre-expressão, devido à falta de cbx7 que regula negativamente a sua expressão, provavelmente contribui para o fenótipo dos ratinhos knockout cbx7. Um mecanismo semelhante é provavelmente envolvidos na carcinogénese do pulmão humano desde Ciclina E a sobre-regulação, associada com a perda de expressão CBX7, foi observado na maioria dos carcinomas pulmonares analisados ​​humano [10].

O objectivo da presente estudo foi investigar outros mecanismos pelos quais a perda de expressão CBX7 pode contribuir para o aparecimento de um fenótipo altamente maligno. Em primeiro lugar, gerado clones celulares de carcinoma seis tiróide em que a expressão de CBX7 tem sido restauradas, em seguida, usando a técnica de hibridação de oligonucleótido microarray poderoso, analisou-se o perfil da linha de células de FRO nas quais a expressão de CBX7 foi restaurada a expressão do gene, em comparação à mesma linha de células que não expressam CBX7.

Nós descobrimos que CBX7 foi capaz de regular positivamente 120 genes e regular negativamente a 196 genes. Entre eles, foram identificados vários genes específicos efectoras, tais como SPP1 (que codificam a proteína osteopontina), cuja função é conhecida por ser essencial para a aquisição de um fenótipo completamente maligno. Chromatin experiências de imunoprecipitação mostraram que a proteína se liga directamente a CBX7 os promotores destes genes regulados e estudos funcionais confirmou que a expressão CBX7 foi capaz de modular os promotores dos genes regulados por CBX7. Finalmente, RT-PCR quantitativo análises mostraram uma correlação inversa entre CBX7 e seus genes regulados por baixo e uma correlação positiva com os seus queridos-regulada em amostras de tireóide e carcinoma de pulmão humano em diferentes graus de malignidade.

Em conjunto , os dados aqui relatados indicam que CBX7 negativamente ou positivamente controla a expressão de vários genes que codificam para proteínas que têm um papel fundamental na progressão do cancro humano.

Materiais e Métodos

Microarray Analysis

Human Gene GeneChip 1.0 ST Arrays (Affymetrix, Santa Clara, CA), que consiste em 764,885 conjuntos de sondas que cobrem mais de 28.869 genes, foi utilizado para avaliar genes diferencialmente expressos. O processo de hibridação total foi realizado seguindo as instruções Affymetrix. Os processos de amplificação e rotulagem foram verificados usando um Kit GeneChip eucariótica Poly-A Controlo de RNA (Affymetrix) com controles positivos exógenos. 15 ug de cada preparação de cRNA biotinilado foi fragmentada e colocada na mistura de hibridação que continha controlos de hibridação biotinilado (Controlos GeneChip Expressão de hibridação, Affymetrix). As amostras foram em seguida hibridadas sobre uma Human Gene GeneChip 1,0 ST matriz a 45 ° C durante 16 horas, a rotação constante (60 rpm) num forno de hibridação (Affymetrix). Microarray imagens digitalizadas foram obtidos com um scanner GeneChip (Affymetrix) usando as configurações padrão. As imagens foram analisadas com Software análise de expressão gênica Affymetrix (Affymetrix). Foram feitas comparações entre FRO-EV-1 e FRO-CBX7-1 amostras, considerando FRO-EV-1 como linha de base. Os valores de mudança de dobra, indicando a mudança relativa nos níveis de expressão entre FRO-EV-1 e FRO-CBX7-1, foram utilizados para identificar genes diferencialmente expressos.

estão disponíveis no banco de dados ArrayExpress dados de microarranjos (www .ebi.ac.uk /arrayexpress) sob o número de E-MTAB-2420.

amostras de tecidos humanos

Os tecidos de câncer de tireóide humanos, tecidos normais adjacentes ou lóbulos contralaterais normais, obtidos a partir cirúrgica espécimes, foram coletadas no Serviço d’anátomo-Patologia, Centre Hospitalier Lyon Sud, Pierre Bénite, França, de acordo com as orientações do comitê de ética desta instituição, e foram imediatamente congelados em nitrogênio líquido a realizar posteriormente a extração de RNA.

“TissueScan em tempo real do cancro da doença pulmonar Panel III” de ADNc foi comprado de Origene (Origene Technologies Inc., Rockville, MD). Este painel cDNA câncer de pulmão (HLRT103) contém 8 espécimes pulmonares normais e 40 amostras de câncer de pulmão de histotipo diferente, cujas características patológica clínica estão disponíveis gratuitamente no seguinte endereço: https://www.origene.com/qPCR/Tissue-qPCR- Arrays.aspx.

extração de RNA, PCR quantitativa em tempo real (qRT-PCR), e análise de microarray

o ARN total foi extraído a partir de linhas celulares e tecidos utilizando o kit RNAeasy Mini (Qiagen, Valência, CA). A integridade do ARN foi avaliada por electroforese em gel desnaturante de agarose. Para gerar ADNc, QuantiTect Transcrição Reversa Kit (Qiagen) foi usada para inverter-transcrever 1 ug de ARN total de cada amostra. Utilizou-se uma mistura optimizada de oligo-dT e iniciadores aleatórios.

Real-Time PCR quantitativa foi levada a cabo com o CFX 96 termociclador (Bio-Rad, Hercules, CA) em placas de 96 poços utilizando um volume final de 20 ul. Para a PCR utilizou-se 10 ul de 2 × SYBR Green (Applied Biosystems, Foster City, CA), 200 nM de cada iniciador, e o cDNA gerado a partir de 20 ng de ARN total. Os iniciadores utilizados são relatados no conjunto de dados S1. Protocolo térmica foi como se segue: 2 min 95 ° C; depois 45 ciclos de 20 s 95 ° C e 1 min a 60 ° C. Cada reacção foi efectuada em duplicado, e o método -ΔΔCT 2

foi utilizado para calcular os níveis de expressão relativos [14]. G6PD foi usado como gene de referência.

culturas e transfecções celulares

células de carcinoma da tiróide FRO [15] disponíveis em nosso laboratório e HEK 293 (American Type Culture Collection, LGC Standards Srl, Sesto San Giovanni, Itália) foram cultivadas em DMEM (Life Technologies, Grand Island, NY) suplementado com 10% de soro fetal de vitela (Life Technologies), 1% de glutamina, 1% de penicilina /estreptomicina (Life Technologies) em 5% de CO

2 atmosfera. FRO e células HEK 293 foram transfectadas utilizando o reagente Lipofectamine (Invitrogen, Carlsbad, CA) e néon Electroporation System (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. Para gerar CBX7 estável expressando células, as células transfectadas foram seleccionadas em meio contendo geneticina um (Life Technologies), vários clones foram escolhidos e expandidos para mais análises. células PC tiróide CL3 normais de rato [16] foram cultivadas em meio F12 modificado, suplementado com 5% de soro de vitela (Life Technologies) e seis factores de crescimento (hormona tirotrópica, hidrocortisona, insulina, transferrina, somatostatina e glicil-histidil-lisina; Sigma, St . Louis, MO). células PC CL3 foram transfectadas com ARNsi de controlo e ARNsi contra cbx7 de rato como descrito anteriormente [11]. Fibroblastos de rato embrionários (MEFs) a partir de ratinhos knockout cbx7 foram estabelecidas, cultivadas e transfectadas (passagem P3 e P4) tal como descrito noutro local [10].

extracção de proteína e análise por Western blot

e extracção Proteína procedimento de western blot foram efectuadas como anteriormente relatado [11]. Após procedimentos de electroforese e transferência, as membranas de nitrocelulose foram incubados durante a noite com o anticorpo primário em uma sala fria (4 ° C). As membranas foram então incubadas com o anticorpo secundário (conjugado de peroxidase de rábano-, 1:3000) durante 60 minutos (à temperatura ambiente) e a reacção foi detectada com um sistema de detecção de western blot (GE Healthcare, Little Chalfont, Reino Unido). Os anticorpos utilizados foram anti-HA (Roche Applied Science, Mannheim, Alemanha), anti-CBX7 (SC-70232, Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA), anti-CBX7 (ab21873, Abcam, Cambridge, Reino Unido) , anti-His-sonda (sc-804, Santa Cruz Biotechnology), anti-EGR1 (sc-189, Santa Cruz Biotechnology, Inc.), anti-c-Fos (SC-52, Santa Cruz Biotechnology, Inc.), anti-Fos B (SC-48, Santa Cruz Biotechnology, Inc.), γ anti-tubulina (SC-17787, Santa Cruz Biotechnology, Inc.) e anti-β-Actina (Clone AC-15, A5441, Sigma-Aldrich Co ., St. Louis, MO).

ensaio

a actividade de luciferase

ensaio de transactivação de luciferase foi realizado como descrito noutro local [11]. Uma região que abrange 1000 pb a montante do local de início da tanscriptional (TSS) dos genes regulados por CBX7 (sequências de iniciadores são disponíveis no conjunto de dados S1) foi amplificado por PCR e inserido a montante da grelha de leitura aberta do gene da luciferase contido no pGL3 vector (Promega, Fitchburg, WI). Todas as construções repórter gerados foram verificados para as mutações por sequenciação directa. CMV-β-galactosidase vector de expressão foi usado para normalizar a actividade de transfecção de acordo com a actividade -galactosidase. Os lisados ​​de proteína foram obtidos 36 horas após a transfecção de células HEK 293 e a actividade de luciferase foi medida em cada ponto por meio de um luminómetro Lumat LB9507 (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Alemanha) e o kit de duplo sistema de luz (Life Technologies). Todos os ensaios foram realizados em duplicado e os resultados são a média de três experiências independentes.

ensaio de imunoprecipitação da cromatina (ChIP)

Chromatin amostras obtidas a partir de células e tecidos foram processadas para imunoprecipitação da cromatina como relatado noutro local [ ,,,0],10], [11]. As amostras foram sujeitas a imunoprecipi tacão com anticorpos anti-CBX7 (ab21873, Abcam). IgG não relacionados foram utilizados como controle negativo da imunoprecipitação. Para qPCR 3 ul de 150 ul de DNA PI foi usado e os valores de entrada de ADN foram usadas para normalizar os valores a partir de amostras de aparas de quantitativos. entrada em percentagem foi calculada de acordo com a fórmula 2

ΔCt × 3, onde ΔCt é a diferença entre Ct

entrada e Ct

IP [10]. Todos os dados quantitativos foram obtidos a partir de três experiências independentes, e para cada experiência qPCR foi realizado em triplicado. As sequências dos iniciadores utilizados estão indicados no conjunto de dados S1. O promotor do gene GAPDH do rato humano e foi usado como controle negativo da interação CBX7 cromatina [4].

Ética

O comitê de ética da Faculdade de Medicina ea placa médica do estado do Centro hospitalier Lyon Sud, Pierre Bénite, França, concordaram com estes investigações e consentimento informado por escrito foi obtido de todos os pacientes incluídos no estudo.

análise estatística

a avaliação estatística foi realizada usando Graph Pad Prism. O teste t de Student foi utilizado para a comparação entre dois grupos de experimentos. Os resultados são expressos como média ± DP e as diferenças foram consideradas significativas se p 0,05. Distribuição de qRT-PCR valores Fold mudança relativa a cada gene em carcinomas papilares e carcinomas pulmonares foram obtidos e representados usando a caixa e bigodes (min a max) eo método percentil. Para análise de correlação, valores Alterar Fold foram utilizados para construir diagramas de dispersão, para obter uma linha de tendência e para calcular o valor r Pearson.

Resultados

perfil de células de carcinoma da tiróide expressão Gene seguinte re- expressão de CBX7

para investigar o mecanismo através do qual a perda de expressão CBX7 pode contribuir para a aquisição de um fenótipo maligno, analisou-se o perfil de expressão do gene de uma linha de células de carcinoma da tiróide (FRO) em que a expressão de CBX7 foi restaurado (FRO-CBX7, Figura 1A). RNAs extraídos de FRO EV-1-(um clone estavelmente transfectadas com o vector vazio) e FRO-CBX7-1 clone, foram hibridadas com um array de Affymetrix oligonucleótido contendo vários milhares de transcrições. O perfil das células FRO-CBX7-1 expressão foi então comparada com a do FRO-VE-1. Vários transcritos resultou alterado no seu nível de expressão entre FRO-CBX7-1 e FRO-VE-1 (Tabela 1 e 2, Tabela S1 e S2). 53 transcritos (17 regulada para cima e 36 para baixo-regulado) tinha um valor de mudança de dobragem absoluta mais de 2,0 (Tabela 1 e 2), enquanto que 263 transcritos (103 sobre-regulado e 160 regulada para baixo) mostram um valor absoluto mudança dobra compreendida 1,5-2,0 (Tabela S1 e S2). Como um controlo de microarrays análise, observou-se que CBX7 foi altamente expressa no FRO-CBX7-1 (Tabela 1).

Um CBX7) expressão foi avaliada por análise de qRT-PCR em FRO (em peso), e vários FRO-VE (vector vazio) e FRO-CBX7 clones celulares. Os valores são expressos como a expressão relativa com respeito à amostra de FRO que foi definida como igual a 1. B, C) Os genes regulados por CBX7 seleccionados foram analisados ​​por análise de qRT-PCR em FRO (em peso), e vários FRO-EV e FRO- clones de células CBX7. FOS, FOSB e expressão gênica EGR1 foi mais abundante em clones de células FRO-CBX7 do que nas células FRO-EV, inversamente, SPP1, SPINK1 e expressão STEAP1 foi menos pronunciado em células FRO-CBX7 comparação com o FRO-EV e FRO (wt ) células. Os valores são expressos como a expressão relativa com respeito à amostra de FRO que foi definida como igual a 1. D) A expressão de Fos, FOSB e EGR1 foi avaliada em um clone de FRO-CBX7 célula (FRO-CBX7-1), um FRO-EV (FRO-EV-1) e células do tipo selvagem FRO. p-actina foi avaliada como controlo de carga. As setas indicam as bandas correspondente à FOS e EGR1.

Entre os genes regulados por CBX7 em células de carcinoma da tiróide humanos nos concentramos nossa atenção sobre FOS, FOSB e EGR1 (Tabela 1) que foram regulados de forma positiva, e SPP1, SPINK1 e STEAP1 (Tabela 2) que foram, por outro lado, regulada negativamente por CBX7, uma vez que estes genes são conhecidos por desempenhar um papel relevante na aquisição de um fenótipo totalmente maligno. Na verdade, FOS, FOSB e EGR1 são proteínas que têm sido relatados a ser regulada em vários carcinomas humanos que sugerem um papel crítico destas proteínas na progressão do cancro [17] – [19]. Por outro lado, SPP1, SPINK1 e STEAP1 são proteínas que são sobre-regulada em diversos carcinomas humanos e a sua sobre-expressão também está associada à progressão do cancro [20] – [22]. Avaliou-se a expressão destes transcritos por qRT-PCR em vários clones expressando as indicações-CBX7 (Figura 1B e C) em comparação com os clones FRO-EV e com as células FRO (WT). Para todas elas, a análise de qRT-PCR confirmou a expressão diferencial associado com a expressão da proteína CBX7 (Figura 1B e C). Além disso, as experiências de Western blot confirmou um aumento da expressão de proteínas Fos, FosB e EGR1 em um clone de células que expressam estavelmente FRO CBX7 (FRO-CBX7-1) em comparação com as indicações-VE (FRO-VE-1) e células FRO em peso ( Figura 1D).

a análise dos genes regulados por CBX7 em células de rato tireóide e MEF expressando ou não o gene cbx7

a seguir, verificou se os genes diferencialmente expressos em células FRO-CBX7 mostrou uma a expressão diferencial em MEFs também isoladas a partir de ratinhos knockout cbx7 [10]. Como mostrado na Figura 2, a análise de qRT-PCR confirmou a modulação dos genes regulados por CBX7 seleccionado também neste sistema celular, de facto, os genes regulados positivamente por cbx7 foram encontrados regulada para baixo em cbx7

– /- MEFs (Figura 2A), enquanto que os genes regulados negativamente por cbx7, foram encontrados sobre-regulada no cbx7

– /- MEFs, em comparação com cbx7

+ /+ MEFs (Figura 2B). experiências de Western blot mostrou que a expressão de proteínas FOS e EGR1 diminui em cbx7

– /-. MEFs, se comparado com cbx7

+ /+ MEFs (Figura 2D)

A análise quantitativa por RT-PCR foi realizada para analisar os níveis de genes CBX7 regulamentados expressão em cbx7

+ /+ e cbx7

– /- MEFs. Os valores são expressos como a expressão relativa com respeito ao cbx7

+ /+, que foi definida como igual a 1. A) Fos, FosB EGR1 e foram expressos em menos cbx7

– /- em comparação com o MEFs cbx7

+ /+ MEFs. B) sobre os genes contrárias, SPP1 SPINK1 e steap1 foram mais expressos em MEFs cbx7

– /- em comparação com os MEFs cbx7

+ /+. C) Cbx7

– /- MEFs foram transitoriamente transfectadas com um vector que expressa cbx7 rato de mamífero (myc-His-tag) ARNm (cbx7

– /- R). Restauração da expressão cbx7 é capaz de reverter o fenótipo da cbx7

– /- MEFs (A, B). Os valores são expressos como a expressão relativa com respeito ao cbx7

+ /+, que foi definida como igual a 1. D) A expressão de proteínas FOS e EGR1 foi avaliada por western blot em MEFs obtidos a partir cbx7

– /- ratinhos em comparação com cbx7

+ /+ MEFs. β-actina expressão foi avaliada para normalizar carga de proteína

A restauração da expressão do gene cbx7 em cbx7

-. /- MEFs (Figura 2C) levou a um aumento da expressão de fos, FosB e EGR1 (Figura 2A) e uma diminuição da expressão de SPINK1, SPP1 e steap1 (Figura 2B) confirmando a regulação destes genes por expressão CBX7.

Para verificar ainda mais o papel da CBX7 na modulação destes genes, nós avaliada a sua expressão na linha de células de rato tiróide normal do PC Cl3 em que a síntese de cbx7 foi suprimida pela interferência de ARN. O silenciamento do gene cbx7 verificada em várias horas após o tratamento com ARNsi (Figura 3A), resultou na redução do CBX7 genes regulados positivamente (Figura 3B) e em um aumento da expressão do CBX7 genes regulados negativamente (Figura 3C), em comparação com as células não tratadas ou aqueles tratados com o controlo não-silenciamento siRNA (scrambled).

a) as células PC CL3 foram transfectadas transientemente com o pequeno ARN interferente (siRNA) contra o ARNm cbx7 rato. Após a transfecção, podemos observar um knockdown eficiente dos níveis de mRNA cbx7, como avaliado por análise de qRT-PCR. B, expressão C) genes regulados por CBX7 foi avaliada pela qRT-PCR em ratos células PC CL3 após transfecção com cbx7 rato siRNA. A expressão foi avaliada 48 horas após a transfecção. Os valores são expressos como a expressão relativa com respeito às células PC transfectadas com CL3 um controlo não silenciamento de ARNsi (scrambled), que foram definidos igual a 1.

CBX7 liga-se a promotores de genes regulados e modula a sua atividade

Para avaliar se CBX7 estava diretamente envolvido na expressão diferencial destes genes

in vivo

, foi realizado um ensaio de cromatina imunoprecipitação (CHIP). Então, FRO-EV-1 e as indicações-CBX7-1 células foram reticulado e imunoprecipitadas com anti-CBX7 ou IgG. A imunoprecipitação de cromatina foram subsequentemente analisadas por qPCR utilizando iniciadores que abrangem a região de promotor destes genes (conjunto de dados S1). Os resultados mostrados na Figura 4A demonstra que CBX7 foi capaz de se ligar a estes promotores. Na verdade, os anticorpos anti-região CBX7 precipitado a partir do promotor destes genes em células FRO-CBX7-1, em comparação com as indicações-VE-1 células (Figura 4A). Além disso, nenhum enriquecimento foi observado em amostras imunoprecipitadas com IgG de coelho normal e quando foram utilizados os iniciadores para o promotor de GAPDH humano de controlo, indicando que a ligação é específica para estes promotores (Figura 4A). O mesmo resultado foi obtido usando cromatina obtido a partir de células HEK 293 transf ectadas transitoriamente com o vector de expressão CBX7 (Figura S1).

A) As células-FRO EV-1 e FRO-CBX7-1 foram submetidos a um ensaio de chip, utilizando anticorpos contra CBX7. Como controlos negativos, utilizaram-se anticorpos IgG não ligados. O ADN amplificado foi associado por qPCR utilizando iniciadores específicos para o promotor do gene correspondente e, como um controlo de especificidade Chip, iniciadores que reconhecem o promotor do gene GAPDH humano. B) MEFs obtidos a partir cbx7

+ /+ e cbx7

– /- foram analisados ​​para a ligação da proteína cbx7 para os promotores dos seus genes regulados. Como controlos negativos, os anticorpos IgG não ligados foram utilizados e, como um controlo de especificidade de chip, foram utilizados iniciadores que reconhecem o promotor do gene GAPDH do rato. Os dados são apresentados como entrada por cento e foram calculados utilizando a seguinte fórmula: 2

ΔCt × 3, onde ΔCt é a diferença entre Ct

entrada e Ct

IP

. para confirmar a ligação da proteína endógena cBX7 aos promotores destes genes, nós também aproveitou MEFs e tecidos obtidos a partir do rato cbx7 nocaute [10]. experimentos ChIP foram realizados em tecidos MEFs, rim e baço obtidas de cbx7

+ /+ e cbx7

– /- ratos. Os anticorpos anti-CBX7 foram capazes de reconhecer cbx7 endógena e para precipitar cromatina de cbx7

+ /+ mas não de cbx7

– /- MEFs (Figura 4B) e tecidos (Figura S2) confirmando a ligação de cbx7 endógena de estas regiões promotoras. Estas experiências de chip, por conseguinte, indicado que CBX7 interage fisicamente com as regiões promotoras desses genes

in vivo

, portanto, modulando directamente a sua expressão.

Subsequentemente, para avaliar o efeito da expressão na CBX7 transcrição desses genes regulados, células HEK 293 foram transientemente co-transfectadas com a codificação CBX7 vector de expressão e com um vector repórter contendo o gene luciferase sob o controlo de uma região de promotor de 1000 pb localizada a montante do TSS de cada um destes genes. Como mostrado na Figura 5, CBX7 aumentou a actividade de transcrição de FOS, FOSB e promotores EGR1 (Figura 5A), enquanto que a actividade de transcrição reprimida de SPP1, SPINK1 e promotores STEAP1 (Figura 5B). Além disso, os efeitos de CBX7 sobre estes promotores foi dependente da dose. Portanto, luciferase chip e experiências de ensaio indicam que CBX7 é capaz de regular directamente a transcrição dos genes regulados por CBX7 seleccionados por ligação aos seus promotores.

células HEK 293 foram transientemente co-transfectadas com quantidades crescentes de expressão CBX7 vector e uma quantidade constante de vector contendo o gene da luciferase sob o controlo dos promotores de genes CBX7-regulados. Quantidades crescentes de CBX7 aplicada a expressão do gene repórter sob o controlo dos FOS, regiões promotoras FosB e EGR1 (A), ao passo que reprimiu a actividade do gene repórter sob o controlo do SPP1, promotores SPINK1 e STEAP1 (B). a actividade relativa da expressão da luciferase do pirilampo foi padronizada para uma transfecção controlo, utilizando β-galactosidase. As barras de escala representam a média ± SD (n = 3).

A expressão dos genes regulados por CBX7 se correlaciona com a expressão CBX7 também em carcinomas humanos

Desde resultados anteriores mostraram que expressão CBX7 foi reduzida na tireóide, cólon e pulmão carcinomas [4], [5], [10], com níveis de expressão quase completamente indetectáveis ​​em cancros mais avançados da tiróide, a hipótese de que a perda do gene CBX7 poderiam estar envolvidos em estágios avançados de carcinogénese da tiróide pela consequente modulação destes genes. Assim, analisamos CBX7 e os genes regulados por CBX7 seleccionados na tiróide e do pulmão carcinomas humanos por qRT-PCR. Tanto quanto os carcinomas papilares estão em causa, FOS, FOSB e genes EGR1 foram regulados negativamente, como CBX7, enquanto SPP1, SPINK1 e STEAP1 foram regulados positivamente (Figura 6A). Igualmente, a análise destes genes em carcinomas pulmonares expressão mostrou o mesmo comportamento (Figura 6B). A análise de correlação em PTC e carcinomas pulmonares (Pearson r) mostrou a correlação entre CBX7 e seus genes regulados (PTC: FOS, p = 0,0438; carcinomas pulmonares: FOS, p 0,0001; FOSB, p 0,0001; EGR1, p 0,0021 , Figura S3 e S4).

Foi analisada a expressão de CBX7, FOS, FOSB, EGR1, SPP1, SPINK1 e STEAP1 por qRT-PCR em carcinomas papilares (PTC) (a) e as amostras de carcinoma de pulmão humano (B). A expressão de Fos, EGR1 FOSB e é sub-regulada, tal como ocorre para CBX7, nos tecidos neoplásicos no que diz respeito aos homólogos normais. Por outro lado, a expressão de SPP1, SPINK1 e STEAP1 foi regulado para cima nas amostras neoplásicas em relação aos tecidos normais, mostrando uma tendência oposta, se comparada com a de CBX7. a expressão do gene Os resultados são expressos como alteração de dobragem (para PTC) ou expressão relativa (para os carcinomas do pulmão) com respeito a um conjunto de amostras normais que foram definida igual a 1. A gama de variabilidade de CBX7 e CBX7-regulada na tiróide normal e pulmão tecidos foi inferior a 10%.

Portanto, estes dados sugerem fortemente que a perda de expressão do gene CBX7 pode contribuir para o aparecimento de um fenótipo maligno, modulando um conjunto de genes críticos para o passo de progressão carcinogênese.

Discussão

foi previamente observado que a expressão CBX7 reduzida está associada com vários carcinomas humanos, ea perda completa de sua expressão se correlaciona com os estágios mais avançados de doenças malignas [5] – [10]. Portanto, é razoável supor que a perda de expressão de CBX7 pode desempenhar um papel fundamental na progressão do cancro. Consistentemente, CBX7 é capaz de neutralizar a diminuição da expressão de o gene de caderina-E, cuja perda de expressão representa um dos aspectos da transição epitelial-mesenquimal [11], que joga um papel crítico na manutenção da morfologia das células epiteliais normais [12], [13] .

a fim de melhor compreender o papel da perda de expressão do gene CBX7 na progressão do cancro nosso trabalho teve como objetivo identificar os genes regulados por CBX7. Em seguida, usando um cDNA microarray Affymetrix, analisamos o perfil de expressão gênica de células de carcinoma da tiróide em que a expressão CBX7 foi restaurado, e identificaram vários genes para cima e para baixo-regulado. Entre os genes regulados por CBX7 nos concentramos nossa atenção sobre FOS, FOSB e EGR1.

FOS e FOSB são membros da AP-1 (proteína ativadora 1) complexo e são capazes de interagir com os membros da família junho [23]. FOS tem sido implicado principalmente na transdução de sinal, proliferação e diferenciação de células [24]. Muitos estudos relataram que o FOS modulado vários genes importantes para a tumorigénese, fazendo com que a sub-regulação de genes supressores de tumores [25] e levando a um crescimento invasivo de células cancerosas [26]. No entanto, alguns estudos mais recentes sugerem que o FOS também podem ter actividade supressora de tumor e pode ter uma função na apoptose [17], [27].

Além de FOS, FOSB tem também sido mostrado ter um função na progressão de vários tipos de tumor a ser regulada em carcinomas mamários pouco diferenciados [18]. Por outro lado, FOSL-1 e FOSL-2, cuja sobreexpressão leva a motilidade de células tumorais e invasão aumentada no cancro da mama, cancro colo-rectal e mesotelioma [28], não eram regulados por CBX7 (dados não mostrados).