Abstract

Introdução

Nós previamente identificados diferencialmente expressos (DE) genes comuns no cancro da bexiga (BC). No presente estudo foram analisados ​​em profundidade, a expressão de vários grupos destes genes DE.

Materiais e Métodos

As amostras de 30 BCs humanos e seus tecidos normais adjacentes foram analisados ​​por cDNA do genoma microarrays, qRT-PCR e transferência de Western. A nossa atenção foi focada no controlo do ciclo celular e os genes de reparação de danos no ADN, os genes relacionados com apoptose, transdução de sinal, a angiogénese, bem como a proliferação celular, invasão e metástase. Quatro conjuntos de dados publicamente disponíveis GEO foram ainda analisados, e os dados dos genes de interesse (Gois) expressão foram comparados com os do presente estudo. O relacionamento entre o Governo da Índia também foi investigado. GO e KEGG análise caminho molecular foi realizada para identificar possíveis casos de enriquecimento de genes com temas biológicos específicos.

Resultados

análise de agrupamento não supervisionado de dados de ADN microarray revelou uma distinção clara em BC vs. amostras de controlo e tumores de alto grau baixo vs.. Os genes com a expressão de pelo menos duas vezes diferencial em BC vs controlos, assim como em não-invasiva do músculo vs. tumores invasivos musculares e em tumores de baixo grau vs. alta, foram identificados e classificados. Mereceu especial atenção às mudanças na osteopontina (OPN, SPP1) expressão, devido às suas múltiplas funções biológicas. Do mesmo modo, os genes que exibe expressão igual ou baixo em BC versus os controlos foram marcados. Significativas correlações de pares na expressão gênica foram marcados. GO análise revelou o carácter multi-faceta do Gois, uma vez que participam numa variedade de mecanismos, incluindo a proliferação celular, morte celular, o metabolismo, a forma da célula, e re-organização do citoesqueleto. análise KEGG revelou que a via mais significativa foi o de câncer de bexiga (p = 1,5 × 10

-31).

Conclusões

O presente trabalho contribui para o conhecimento atual sobre a assinatura molecular identificação do BC. Tais obras deve progredir a fim de ganhar mais conhecimento sobre mecanismos moleculares de doenças

Citation:. Zaravinos A, Lambrou GI, Volanis D, Delakas D, Spandidos DA (2011) Spotlight on genes diferencialmente expressos em urinário cancro de bexiga. PLoS ONE 6 (4): e18255. doi: 10.1371 /journal.pone.0018255

editor: I. King Jordan, Georgia Institute of Technology, Estados Unidos da América

Recebido: 13 de outubro de 2010; Aceite: 1 de março de 2011; Publicação: 05 de abril de 2011

Direitos de autor: © 2011 Zaravinos et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Os autores não têm apoio ou financiamento para relatar

Conflito de interesses:. os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

cancro da bexiga urinária (BC) é a mais comum. malignidades do tracto urinário, responsáveis ​​pela mortalidade e morbilidade significativa em todo o mundo. Na Europa, estima-se que 105.000 novos casos de câncer de bexiga são diagnosticados anualmente, enquanto que aproximadamente 30.000 pacientes morrem de cancro da bexiga a cada ano [1]. Sua incidência aumenta diretamente com a idade, sendo raro antes dos 50 anos, e é três a quatro vezes mais comum em homens do que em mulheres. Quase todos os cancros da bexiga são carcinomas, resultante de epitélio de transição. O comportamento do carcinoma de células transicionais (TCC) é altamente diversificada e definida por dois processos distintos, mas relacionados: recorrência e progressão tumoral. Na apresentação, 75-85% dos tumores são restritos à mucosa, ou invadir o

lâmina própria mucosas

. O restante presentes com invasão da camada muscular da parede da bexiga ou estender ao tecido perivesical, órgãos adjacentes ea parede pélvica. Mais de 60% dos tumores superficiais deverá repetir-se pelo menos uma vez e progresso para neoplasias menos diferenciadas ou invasivos com pior prognóstico em uma porcentagem significativa dos pacientes [2]. Os parâmetros prognósticos mais úteis são o grau do tumor, estágio, tamanho, taxa de recorrência prévia ea presença síncrona de CIS [3]. No entanto, uma melhor compreensão da história natural da TCC pode ser esperado sobre a elucidação dos mecanismos moleculares de TCC.

Nós, previamente identificados diferencialmente expressos (DE) genes comuns em BC urinário [4]. No presente estudo, o interesse centrou-se na análise de vários grupos de genes DE, tais como os genes envolvidos no controlo do ciclo celular, ADN reparação de danos, a apoptose, a transdução de sinal, factores de transcrição, a angiogénese, proliferação celular, invasão e metástase. Nós exploramos o perfil de expressão em BC contra o tecido saudável, no músculo-não-invasiva (fase T1) versus tumores músculo-invasiva (estádio T2-T4), e em tumores de baixo vs. alto grau por meio de análise de microarray. Nossos resultados foram ainda validados por imuno-histoquímica, qPCR e Western blot. Além disso, foi realizada a análise computacional GEO em dados de microarranjos extraídos de outros conjuntos de dados disponíveis publicamente, e comparou-os com os nossos resultados.

Nossos resultados focados em genes que desempenham um papel significativo nos processos celulares mais importantes e demonstrou um grande diferença de seus padrões de expressão entre amostras BC e controle. Genes com expressão diferencial, pelo menos, duas vezes em BC vs controlos, assim como em não-invasiva do músculo vs. tumores músculo-invasivo, e em tumores de baixo grau vs. alta, foram identificados e classificados.

Materiais e Métodos

desenho do estudo e clínico-patológicos de dados

tumor emparelhados e amostras de tecido normal de uma série consecutiva de 30 pacientes com diagnóstico recente de BCs submetidos a ressecção transuretral da bexiga tumor no Departamento de Urologia, ” Asklipieio “general Hospital, Atenas, foram adquiridos depois de a quantidade de tecido necessário para exame de rotina patologia tivesse sido removido (Tabela 1). Todos os espécimes de tumores foram classificados e classificado pelo mesmo patologista. Os pacientes com câncer foram categorizados de acordo em músculo-invasivo (T2, T3 ou T4) e os tumores não invasivos (Ta, T1 e CIS). Para fins de comparação com relatórios anteriores, o 1973 Organização Mundial de Saúde (OMS) sistema de classificação [de baixo grau (1-2 graus) e de alto grau (grau 3)] foi usado neste estudo, que ainda é o sistema mais vulgarmente usado apesar de ser substituída pela OMS Society 2004 /Internacional de Urologia Patologia (ISUP) classificações [5]. consentimento informado por escrito foi obtido de todos os pacientes incluídos neste estudo. O protocolo do estudo foi aprovado pelo Comitê da Universidade de Creta Ética. critérios de elegibilidade utilizados foram eletivamente ressecado BCs primários e a disponibilidade de DNA a partir de tecido normal e tumor para análise biomolecular. Os critérios de exclusão foram história de neoplasias anteriores e quimioterapia ou radioterapia antes da cirurgia

As amostras de tecido foram obtidos no momento da cirurgia do tumor e os seguintes três locais selecionados grosseiramente normais (biópsias copo frio):. posterior parede, trigone, e a área adjacente ao tumor. Partes das amostras normais ressecados foram enviados para análise histopatológica. Tecidos tumorais e normais foram congeladas imediatamente em azoto líquido, transportado e armazenado a -80 ° C até à extracção de ADN.

Pacientes com BCS-não-invasivos musculares foram acompanhados com exames periódicos cistoscópicas e tratamento intravesical como indicado. Pacientes com BCs invasivas foram oferecidos cistectomia radical com ou sem quimioterapia sistêmica. Após um seguimento médio de 24 ± 3 meses, 8 (26,6%) pacientes apresentavam tumores recorrentes. Em Ta /T1 tumores a frequência de recorrência foi de 29,4% (5/17), em comparação com 23% (3/13) de tumores T2-T3. Em pacientes com BCS-não-invasiva do músculo, a taxa de progressão foi de 11,1% e 22,2% para o grau 2 e grau 3 tumores, respectivamente. Todas as recorrências foram comprovados por biópsia.

Imunohistoquímica

Secções, de 3 mm de espessura, de formalina fixo, tecido embebido em parafina foram cortados e colocados em lâminas revestidas com 3-aminopropyltriethoxysilone. As lâminas foram secas a 56 ° C durante 1 h antes da coloração imuno-histoquímica. As secções de tecido foram desparafinados em xileno antes de re-hidratação em álcoois graduados, e a actividade da peroxidase endógena foi bloqueada por tratamento com 3% H

2O

2, à temperatura ambiente durante 15 min. Antigen desmascaramento foi realizada por 30 min de incubação a 80 ° C em citrato trissódico 10 mM (pH 6,1). Imunocoloração e de revelação foram realizados em automatizar Dako. As lâminas foram incubadas à temperatura ambiente com anticorpos de cabra policlonais primárias contra o anti-ErbB2 (1:800; Dako), ciclina D1 (1:100; SP4; Epitomics), anticorpo monoclonal contra o anti-p53 (1:250; E26; Epitomics) e o anticorpo monoclonal contra o anti-Ki-67 (1:100; SP6; Epitomics). Os epitopos do anticorpo primário foram localizados pela técnica de imunoperoxidase utilizando o complexo de peroxidase e kit de substrato secundário anticorpo avidina-biotina (kit de 5001, Dako), de acordo com o protocolo do fabricante. As secções foram então tratadas com Chromagen 30-30 diaminobenzidene tetracloridrato para identificar locais de imunoprecipitação por microscopia de luz. Finalmente, as secções foram lavadas, contrastadas com hematoxilina e montadas sob lamelas. Nenhuma coloração específica foi observada quando o anticorpo primário foi omitido do protocolo (controlo negativo). Especificidade da imunocoloração foi adicionalmente controlado por coloração simultânea de amostras de câncer de mama com ErbB2 conhecida, ciclina D1, p53 e padrões de expressão Ki67. Um patologista experiente marcou a intensidade da coloração em quatro níveis (negativos, fracas, moderadas e fortes), considerando tanto a intensidade da cor e número de células coradas. Em resumo, a pontuação proporção representada a percentagem estimada de células tumorais positivas coradas (0 = 0%; 1 = 1%; 2 = 1 a 10%, 3 = 10-33%, 4 = 33-66%; 5≥ 67%), ea pontuação intensidade representada nas profundezas da coloração de células tumorais (1 = fracamente positivo; 2 = moderadamente positivos;. 3 = fortemente positiva)

purificação de RNA e preparação de cDNA

isolámos ARN total a partir de amostras de biopsia do tumor em bruto utilizando um homogeneizador de energia e o reagente TRIzol ® (Invitrogen, Carlsbad, CA), como previamente descrito [6], [7]. Utilizou-se dois ug de ARN total, como material de partida para a preparação de ADNc. Realizou-se a síntese de primeira e segunda cadeia de cDNA usando o First-Strand Synthesis System StrataScript, como descrito anteriormente [8].

Microarray análise

oligos chips de microarray (genes) foram ~57K obtido a partir de GE Healthcare (IL) e AppliedMicroarrays (MA) (CodeLink 57K Human Whole Genome). A hibridação foi realizada com o kit de amplificação e Rotulagem CodeLink ARN, utilizando o corante fluorescente Cy5. As lâminas foram digitalizadas com um scanner de microarray (ScanArray 4000XL). Imagens foram gerados com software de aquisição ScanArray microarray (GSI Lumonics, EUA). ARNc a partir de três montagens experimentais foram utilizados em experiências individuais com picos internos como controlos. As montagens experimentais consistiu em 10 amostras BC urinárias de diferentes histologia (T1 /2 de grau 3, T1 de grau 1/2, T3-grau 3) e 5 amostras de controlo. As imagens digitalizadas foram posteriormente tratados com o Analysis Expression v5.0 Software CodeLink de Amersham Biosciences. A montagem experimental foi analisada com base no design de referência, como descrito anteriormente [9], [10], [11]. Todas as amostras de tumor foram comparados com o valor médio das amostras de controlo. Correcção de fundo foi realizada subtraindo-se o fundo global de médio a partir do fundo locais mediana da intensidade do sinal. Um limiar de 2 foi definido como ponto de corte, o que significa que a intensidade local durante, pelo menos, um canal deve ser duas vezes tanto como a do fundo. dados de microarray foram normalizados dividindo as intensidades local pela mediana global. dados normalizados foram extraídos, pré-processadas e classificadas com o Microsoft Excel. dados da matriz estão disponíveis no Gene Expression Omnibus (National Center for Biotechnology Information) com números de adesão GSM678186 através GSM678385 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE27448). Além disso, cada gene foi testado quanto à sua importância na expressão diferencial usando um teste-z. Os genes foram considerados significativamente expresso diferencialmente se obtido um valor de p 0,05. A taxa de detecção falsa foi calculada como descrito anteriormente [12], [13], [14]. Genes foram ainda classificadas usando dois sentidos (genes-contra amostras)-ligação média de agrupamento hierárquico com distância Euclidiana usando o software Genesis 1.7.2 (Technische Universitaet-Graz, Áustria) [15].

em tempo real PCR validação

produtos transcritos foram submetidos a real-time PCR com SYBR Green I ‘num aparelho controlador térmico programável Mx3000P (Stratagene, La Jolla, CA). Os pares de iniciadores foram concebidos para abranger, pelo menos, um intrão, a fim de evitar a amplificação do DNA genómico contaminante, juntamente com cDNA. A sua sequência e os correspondentes tamanhos de produtos de PCR estão listadas na Tabela S1. os genes GAPDH e ACTB foram utilizados como controlos internos [16].

Um microlitro de ADNc a partir de amostras normais ou de CTP, respectivamente, foi amplificado numa reacção de PCR com 2x SYBR® Brilhante Verde QPCR Master Mix (contendo 2,5 mM MgCl

2), 300 nM de cada iniciador e 30 uM de corante de referência passiva ROX num volume final de 20 ul. Após desnaturação inicial a 95 ° C durante 10 min, as amostras foram submetidas a 40 ciclos de amplificação que compreendem desnaturação a 95 ° C durante 30 seg, emparelhamento a 60 ° C durante 30 seg, e alongamento a 72 ° C durante 30 seg. etapas de amplificação e de alongamento foram seguidas por uma análise de curvas de fusão em que a temperatura foi aumentada de 55 ° C a 95 ° C a uma velocidade linear de 0,2 ° C /seg. A coleta de dados foi realizada durante tanto recozimento e extensão, com duas medições em cada etapa e em todos os momentos durante a análise da curva de fusão. Para verificar os resultados da análise da curva de fusão, os produtos de qPCR foram analisados ​​por electroforese em gel de agarose a 2%, corados com brometo de etídio e fotografados num transiluminador de luz UV (Figura S1). Em cada reacção qPCR foram incluídos dois controlos negativos, sem um molde de ADNc e um tratamento sem transcrição reversa. Todas as amostras foram tratadas em duplicado. níveis gene de transcrição foram calculados utilizando o método ΔΔCt, como descrito anteriormente [17], [18].

extração de proteína total e análise de Western blot

Após a adição de 250 ul GST- gelada tampão de peixes de lise (10% de glicerol, Tris 50 mM (pH 7,4), NaCl 100 mM, 1% (v /v) de Nonidet P-40, MgCl 2 mM de um cocktail inibidor de protease

2, e (Roche Diagnostics GmbH, Alemanha), as amostras de tecidos homogeneizados foram centrifugados a 14.000 xg durante 15 min a 4 ° C, para remover o material insolúvel, e o sobrenadante foi recolhido e armazenado a -80 ° C. a concentração de proteína de cada amostra foi determinado pelo método de Bradford utilizando um reagente de ensaio de proteína de corante (Bio-Rad, Hercules, CA). as amostras foram dissolvidas em tampão de amostra LDS (Invitrogen) e aqueceu-se a 70 ° C durante 7 minutos. quantidades iguais de amostras (20-30 ug) foram sujeitas a electroforese em NuPAGE de 4-12% de gel de Bis-Tris (Invitrogen) e transferidas para uma membrana de nitrocelulose 0.45- ^ M (Bio-Rad Laboratories, Inc.). a membrana foi imersa em 5% de leite desnatado ou de BSA, 0,1% de Tween 20 e dissolvido em solução salina para bloquear a ligação não específica com Tris. As membranas foram incubadas durante a noite a 4 ° C com os anticorpos primários seguintes: rato policlonal anti-HRAS (diluído 1:1,000; Abnova, CA), anticorpo monoclonal de ratinho anti-CDKN2A (diluído 1:500; Abnova, CA), anticorpo monoclonal de ratinho anti -p53 (diluído 1:500; clone DO-7; BD Transduction Laboratories), anticorpo monoclonal anti-VEGFA (diluído 1:500; Santa Cruz Biotechnology, CA), anticorpo policlonal de coelho anti-TGF-p1 (diluído 1:1000; Novus Biologicals, CO) e anticorpo monoclonal de ratinho anti-OPN (diluído 1:500; Santa Cruz Biotechnology, CA). As membranas foram então lavadas e incubadas durante 90 min. à temperatura ambiente com um anticorpo secundário de cabra, que incluiu a peroxidase de rábano conjugado com anti-coelho ou anti-IgG de ratinho (diluído 1:1,500; Santa Cruz Biotechnology). As transferências de Western foram normalizadas utilizando um anticorpo monoclonal anti-

anticorpo β-actina (diluído 1:5,000; Sigma Chemicals, St. Louis, MO). Os sinais específicos foram visualizados por reagente ECL (GE Healthcare Bio-Sciences, Piscataway, NJ), após exposição ao filme ECL. A densidade relativa das bandas de polipeptídeos detectados no filme ECL foi determinada utilizando a ferramenta ponto denso do software AlphaEaseFC.

GEO Dataset análise computacional

A análise computacional foi realizada para investigar as diferenças de do OPN, VEGFA, TGF-p1, FGF2, EGFR, EGF, p14

ARF, p16

INK4A, p53, KRAS, HRAS, ARN, Araf, BRAF, RAF1, RKIP, MMP2, MMP9, TIMP1, TIMP2 e CyclinD1 níveis de transcritos entre os diferentes tipos de câncer de bexiga, o seu homólogo metastático e do tecido normal relativa. Quatro Omnibus (GEO) conjuntos de dados disponíveis publicamente Gene Expression foram analisadas por este motivo, com os números de acesso série GEO GSE89, GSE7476, GSE3167 GSE12630 e [19], [20], [21]. padrões de expressão dos genes foram extraídos a partir de conjuntos de dados normalizados e foram expressos como valores médios de log

2 intensidade (Tabela S2).

Gene ontologia (GO) e Enciclopédia de Quioto de genes e genomas (KEGG ) análise

ontologia Gene (GO) e Enciclopédia Kyoto de genes e genomas KEGG) análise de caminho molecular (foram realizadas para identificar possíveis casos de enriquecimento de genes com temas biológicas específicas (https://www.genome.jp/kegg /pathway.html).

a análise estatística

dados de microarranjos foram normalizados pela mediana mundial das intensidades spot. Cada gene foi testado quanto à sua importância na expressão diferencial usando um teste-z. GOI níveis de expressão foram avaliados pela primeira vez pelo teste de uma amostra de Kolmogorov-Smirnov Bondade de ajustamento, de modo a determinar se seguiu um padrão normal de distribuição. O não-paramétrico de Spearman foi usado para examinar as correlações de pares entre os níveis de mRNA e sua associação com variáveis ​​contínuas (idade, tabagismo, tumor estágio /grau). O teste de Mann-Whitney foi usado para examinar o status dos genes com os vários parâmetros clínico após estratificação expressão. O método de Kaplan-Meier foi utilizado para estimar a sobrevivência global como uma função do tempo. diferenças de sobrevida foram avaliadas pela Log-rank (Mantel Cox) e testes Gehan-Breslow-Wilcoxon. Os valores numéricos são expressos como a média ± desvio padrão (SD), e medianas. Dados extraídos dos bancos de dados GEO foram comparados estatisticamente pelo teste de Mann-Whitney. A significância estatística foi estabelecida ao nível de 95% (p 0,05). Todas as análises estatísticas foram realizadas com SPSS 11.5 (SPSS, Chicago, IL).

Resultados

imunofenotipagem

amostras de tumor foram coradas com anticorpos para ErbB2, ciclina D1, p53 e Ki-67 (Figura 1). Se presente, a coloração anti-ErbB2 em amostras de tumor é uma coloração da membrana, difusa no urotélio. Todas as amostras BC (100%) apresentaram imunocoloração moderada /forte (++, +++), ao passo que nenhuma amostra BC não mostrou imunomarcação /fraco (0, +) para ErbB2. Limiares para altos índices de rotulagem foram estabelecidos para Ki-67 em ≥10% núcleos de tumor positivo e para p53 em 10 e 20%. T1 de grau 1/2 tumores mostrou fraca coloração para anticorpos anti-Ki-67 (7,5% e 40%, respectivamente), ao passo que /2-T1 grau 3 tumores exibiram a imunocoloração forte (+++, 70%). Da mesma forma, T1 de grau 1/2 tumores mostrou fraca coloração para anticorpos anti-p53 (10% e 35%, respectivamente), ao passo que /2-T1 grau 3 tumores exibiram a imunocoloração forte (53-70%). Em relação ciclina D1, todos os tumores mostraram coloração intensa de anti ciclina D1, enquanto que as de um grau superior exibiu comparativamente menor imunocoloração. Para 1/2 tumores T1-grade, de coloração para anticorpos anti-ciclina D1 foi de 80%; enquanto que para T1 /2 de grau 3 tumores imunocoloração foi de 50%.

Os tumores foram coradas com anti-cerbB2, anti-Ki67, anti-p53 e anti-ciclina D1. H . E, representativos lâminas hematoxilina-eosina

expressão Microarray e agrupamento em um 22-gene Set Online

Nós previamente identificados 831 genes que foram diferencialmente expressos em todas as amostras 10 BC, simultaneamente. Destes, 33 genes foram supra-regulados e 85 genes foram regulados negativamente em todas as amostras de cancro da bexiga em comparação com os 5 tecidos normais, ao mesmo tempo (dados não mostrados). No presente estudo, foi realizada nos dois sentidos-ligação média de agrupamento hierárquico com distância Euclidiana para um conjunto de 22 genes que incluiu os seguintes genes: VEGFA, Araf, BRAF, OPN (SPP1), MMP2, KRAS, ARN, TGF-p1, AKT1 , HRAS, TIMP1, EGF, RKIP (PBP), FGF2, EGFR, RAF1, CDKN2D, TP53, CDKN2A (p14

ARF /p16

INK4A), MMP9 e MKI67, em 10 amostras BC vs 5 controles. Uma vista detalhada do dendrograma conglomerado da amostra é apresentada na Figura 2A. Analisamos o log

2 transformada padrão do GI expressão vezes e dividiu os tumores em 3 grupos principais com base na expressão diferencial desses 22 genes: O primeiro princípio ramo contido T1-grau 3, T2-grau 3, T1- grau 2 e T3 de grau 3 tumores. O segundo ramo consistiu de T1-T2 e de grau 2 de grau 3 tumores. O terceiro ramo consistiu em tumores com carcinoma in situ, T2-grau 3 (CIS). O conjunto de 22 genes foi dividida em dois grupos principais. O primeiro grupo era composto de genes que foram sobre-expressos (VEGFA, Araf, BRAF, OPN, MMP2, KRAS, ARN, TGF-p1, AKT1, HRAS e TIMP1) eo segundo grupo continha genes que eram tão ou sub-expressos (EGF , RKIP /PBP, FGF2, EGFR, RAF1, CDKN2D, TP53, CDKN2A, MMP9 e MKI67) em TCC vs. tecido normal. Os níveis de expressão relativos da Gois em cada grupo de tumor foram expressos como uma razão entre os níveis de expressão normalizados a partir do grupo do tumor para os níveis médios dos tecidos normais, que foi ajustado a 1,0 (Figura 2B e na Tabela S2).

cada linha representa o diagrama de um gene e cada coluna uma amostra de tumor. A saturação de cor representa as diferenças na expressão genética através das amostras de tumores; vermelho indica a expressão mais elevada do que a mediana (preto), e verde indica menor expressão do que a mediana. A intensidade da cor indica o grau de regulação de genes (A). Fold expressão do Gois com respeito a histologia do tumor, tal como detectado por análise de microarray (B).

A expressão vezes (média ± DP) do Gois em cada um dos três grupos de tumor em comparação com o tecido normal, como adquirida pela nossa análise microarray, está representado na (Figura S2)

Verificação de mRNA e expressão de proteína em relação às características clinicopatológicas

a expressão de mRNA dos genes:. VEGFA, Araf, BRAF, OPN (SPP1), MMP2, KRAS, ARN, TGF-p1, AKT1, HRAS, EGF, RKIP (PBP), FGF2, EGFR, RAF1, TP53, CDKN2A (p14

ARF /p16

INK4A) , MMP9 foi determinada por qPCR, tanto cancro da bexiga e do tecido normal (Tabela S3). gráficos de dispersão foram construídos para melhor visualização dos genes que foram up-regulamentados ( 2 vezes), regulada para baixo ( 2 vezes) ou (limiar de diferença de 2 vezes) igualmente expressou entre BC e controles. parcelas vulcão um gráfico do log

2 da mudança vezes na expressão de cada gene entre amostras BC comparada seu valor de p do teste t, foram também construídas (Figura 3).

O preto linha indica dobre mudanças de 1. as linhas cor de rosa indicam o limite da expressão do gene fold-change (diferença de 2 vezes). qPCR revelou para cima e genes em cancro da bexiga urinária regulada para baixo. O RNA total do tecido e cancro da bexiga urinária normal adjacente foram caracterizados em triplicado técnicos, e os níveis de expressão relativa de cada gene nos dois tipos de tecido foram representadas graficamente contra o outro no gráfico de dispersão. VEGFA, OPN, p14

INK4A, p6

CDKN2A, ARN e TGF-p1 foram up-regulada, enquanto que FGF2 e EGF foram regulados negativamente por pelo menos duas vezes (fora das linhas roxas). Os genes KRAS, MMP2, AKT1, p53, EGFR, MMP9 e HRAS exibiu expressão igual entre o câncer de bexiga e tecido normal (A). O vulcão Plot representa graficamente o log

2 da mudança vezes na expressão de cada gene entre as amostras BC versus seu valor-p do teste t. A linha preta indica dobre mudanças de 1. As linhas cor de rosa indicam o limite da expressão do gene fold-change (diferença de 2 vezes). A linha azul indica o limite para o valor-p do teste t (0,01) (B).

Os genes OPN, VEGFA, TGF-p1, p16

INK4A, p53, RKIP e ARN, se significativamente sobre-expressos em BC versus tecido normal (p 0,001; teste-t) (Figura S3A). Os valores de expressão de mRNA média entre BC e do tecido normal para cada gene estão representados na Tabela 2.

Os níveis do p14 genes de expressão de mRNA

ARF, AKT1, HRAS, Araf, BRAF, RAF1 , MMP9, EGFR e KRAS, não diferiram significativamente entre BC e tecido de controlo (p 0,01; teste t). Os valores de expressão de ARNm significativo entre BC e tecido normal para cada gene, foram os seguintes: p14

ARF, 0,0325 ± 0,0488 0,0100 ± 0,0118 vs (P = 0,1087); AKT1, 0,0321 ± 0,0230 vs. 0,0262 ± 0,0174 (p = 0,3632); HRAS, 0,0015 ± 0,0021 vs. 0,0015 ± 0,0021 (p = 0,9752); Araf, 0,9931 ± 0,0047 vs. 0,9942 ± 0,0040 (p = 0,5201); BRAF, 0,8933 ± 0,0657 vs. 0,9053 ± 0,0486 (p = 0,8999); RAF1, 0,9348 ± 0,0527 vs. 0,9419 ± 0,0293 (p = 0,6681); MMP9, 0,0014 ± 0,0015 vs. 0,0023 ± 0,0054 (p = 0,1265); EGFR, 0,0078 ± 0,0073 vs. 0,0049 ± 0,0048 (p = 0,0948); . KRAS, 0,0876 ± 0,0997 vs. 0,0773 ± 0,0900 (p = 0,4035; Mann-Whitney U) (Figura S3B)

EGF, FGF2 e MMP2 exibiu significativa sub-expressão em BC tecido normal vs.: EGF , 0,00004 ± 0,000047 vs. 0,000151 ± 0,000235 (p = 0,0017); FGF2, 0,0003 ± 0,0004 vs. 0,0023 ± 0,0019 (p 0,0001); MMP2, 0,0752 ± 0,0858 0,1341 ± 0,0834 vs (p = 0,0007, teste de Mann-Whitney U) (Figura S3C)

A expressão de ARNm dos genes que exibiram excesso, igual ou sub-expressão de acordo com a. nossa análise qPCR também foi investigado em relação à fase /grau dos tumores. Todas as diferenças estatisticamente significativas na expressão de cada gene entre os grupos de tumor T2 /T3-grau 3, T1-grau 3 e T1-grau 2, estão representados na Figura 4.

Grupos de pares foram comparados estatisticamente usando o Mann teste U -Whitney. Barras representam os valores da mediana (A). Dispersão que descreve os níveis de mRNA dos genes que foram expressos igualmente entre os cancros da bexiga urinária de diversos estágios /grau, e tecido normal. Grupos de pares foram comparados estatisticamente usando o teste de Mann-Whitney. Barras representam os valores da mediana (B). Scatterplot representando os níveis de mRNA dos genes que estavam sub-expressos em vários cancros da bexiga urinária de estágio diferente /série, contra o tecido normal. pares de grupos foram comparados estatisticamente usando o teste de Mann-Whitney. Barras representam os valores da mediana (C).

A expressão de OPN (SPP1), TGF-p1, VEGFA, CDKN2A (p14

ARF /p16

INK4A), HRAS e TP53, foi também verificada ao nível da proteína, por meio de análise densitométrica dos Western blots (Figura 5). Os níveis de proteína normalizada em BC versus tecido normal foram as seguintes: OPN, 0,645 ± 0,287 vs 0,261 ± 0,020 (p = 0,0286); TGF-p1, 0,837 ± 0,114 vs. 0,300 ± 0,195 (p = 0,0286); VEGFA, 0,678 ± 0,183 vs 0,295 ± 0,133 (p = 0,05); CDKN2A, 0,687 ± 0,157 vs. 0,429 ± 0,088 (p = 0,0286); HRAS, 0,663 ± 0,258 vs. 0,420 ± 0,121 (p = 0,1143); p53, 0,760 ± 0,167 vs. 0,448 ± 0,295 (p = 0,2000; Mann-Whitney U)..

β-actina (43 kDa) foi utilizado como controle de carga

correlação entre a expressão de mRNA /proteína de Góis e as taxas de sobrevivência dos doentes com cancro da bexiga

Um total de 30 casos de cancro da bexiga urinária foram investigadas para taxas de sobrevida global. Pacientes com tumores de estádio 1 apresentaram melhor sobrevida global em comparação com aqueles do estágio 2 ou 3 [p = 0,0008, χ

2 = 14,32, a Log-rank (Mantel Cox); p = 0,0041, χ

2 = 8.260, Gehan-Breslow-Wilcoxon teste]. Além disso, os pacientes com tumores de grau 2 apresentou melhor sobrevida global vs. os de grau 3 tumores [p = 0,0475, χ

2 = 6,094, a Log-rank (Mantel Cox) de teste].

A mediana valor para a expressão do mRNA MMP2 nas amostras de câncer de bexiga foi 0,038. Os casos foram divididos em dois grupos com a expressão acima e abaixo deste valor mediano. Da mesma forma, dividimos os casos em grupos com base nos valores médios para MMP9 (0,0007), OPN (0,031), VEGFA (0,141), TGF-p1 (0,0001), FGF2 (0,0002), p14

ARF (0,011), p16

INK4A (0,013), p53 (0,013), AKT1 (0,025), EGFR (0,005), EGF (0,00002), HRAS (0,0011), KRAS (0,051), as ARN (0,024), Araf (0,994), BRAF (0,916 ), RAF1 (0,956), RKIP (0,764) expressão de mRNA (Tabela 2)

Os casos cujos tumores apresentaram baixos níveis de VEGFA ( . valor mediano, 0,141) e EGFR ( valor médio, 0,0051 ) exibiram expressão de ARNm de taxas de sobrevivência globais pior do que os casos que expressam aumentado VEGFA ( valor médio, 0,141) e EGFR ( valor médio, 0,0051), respectivamente níveis de ARNm [para VEGFA, p = 0,04; para EGFR, p = 0,02; Teste log-rank (Mantel Cox)]. Pacientes com alta TGF-p1, FGF2, p14

ARF, os níveis AKT1, RKIP, KRAS e de mRNA p53 também mostrou um melhor padrão de sobrevida global, no entanto, a correlação não foi estatisticamente significativa. As curvas de Kaplan-Meier para todos os gois estão representados na Figura 6.

Os casos cujos tumores exibiram baixos níveis de VEGFA ( valor médio, 0,141) e EGFR ( valor médio, 0,0051) de expressão de ARNm, as taxas de sobrevivência global mais expostas, do que os casos que expressam aumentado VEGFA ( valor médio, 0,141) e EGFR ( valor médio, 0,0051) os níveis de ARNm [para VEGFA, p = 0,04; para EGFR, p = 0,02; Teste log-rank (Mantel Cox)]. As diferenças de sobrevida foram avaliados através de teste log-rank (Mantel Cox). A significância estatística foi estabelecida ao nível de 95% (p 0,05)

Comparação de GEO conjuntos de dados

Nós ainda comparado nossos resultados qPCR a 4 BC conjuntos de dados microarray GEO publicamente disponíveis:. GSE89 por Dyrskjot et ai. (2003) [19]; GSE7476 por Mengual et al. (2009) [21]; GSE3167 por Dyrskjot et ai. (2004) [20] e por GSE12630 Monzon et ai. (2009) [22]. Tudo isso significa log

2 rácios transformadas de amostras vs. controles BC estão representados na Tabela S2.

Dataset GSE12630 continha dados apenas de carcinoma de células transicionais da bexiga e carcinoma urothelial metastático. Uma vez que nenhum dados do tecido normal estavam disponíveis para este conjunto de dados, foram extraídas de dados normais de tecido de conjunto de dados GSE89 e calculado log da média

2 rácios transformadas do BC contra estes dados extraídos, que foi usado como controles (Tabela S2) .

a análise de correlação

Nós exploramos a correlação dos níveis de mRNA do Gois no BC, bem como no tecido normal, realizando o posto teste de Spearman (Tabela S4).