Abstract

Fundo

A incidência de câncer de pâncreas (PC) continua a aumentar no mundo , enquanto a maioria dos pacientes são diagnosticados com estágios avançados e sobreviver 12 meses. Este mau prognóstico é atribuível à dificuldade de detecção precoce. Aqui nós desenvolvido e avaliado um índice multivariada composta de aminoácidos livres no plasma (PFAAs) para detecção precoce de PC.

Métodos

Foi realizado um estudo transversal em multi-instituições no Japão. Jejum amostras de plasma de pacientes de PC (n = 360), pancreatite crônica (CP) pacientes (n = 28) e controle saudável (HC) sujeitos (n = 8372), sem cancros aparentes que foram submetidos a exames médicos completos foram recolhidos. As concentrações de 19 PFAAs foram medidos por espectrometria de massa de cromatografia de líquido. Geramos um índice composto pelos seis PFAAs seguintes: serina, asparagina, isoleucina, alanina, histidina e triptofano como variáveis ​​de discriminação em um conjunto de treinamento (120 PC e combinando 600 HC) e avaliação em um conjunto de validação (240 PC, 28 CP e 7772 HC).

resultados

Várias concentrações de aminoácidos no plasma foram significativamente alterada em PC. As concentrações de plasma de triptofano e de histidina em PC foram particularmente baixo, enquanto era particularmente serina maior do que a de HC. A área sob a curva (AUC) com base no receiver operating characteristic análise (ROC) do índice resultante para discriminar PC do HC foram 0,89 [95% de intervalo de confiança (IC), 0,86-0,93] no conjunto de treinamento. No conjunto de validação, com base na AUC ROC análise da curva do índice PFAA foram de 0,86 (IC 95%, 0,84-0,89) para todos os pacientes de PC versus indivíduos HC, (IC 95%, 0,75-0,86) 0,81 para os pacientes de PC de IIA estágio para IIB versus indivíduos HC, e 0,87 (IC 95%, 0,80-0,93) para todos os pacientes de PC em comparação com pacientes com PC.

conclusões

Estes resultados sugerem que o perfil PFAA de PC foi significativamente diferente da de HC. O índice PFAA é um biomarcador promissor para rastreamento e diagnóstico do PC

Citation:. Fukutake N, Ueno M, Hiraoka N, Shimada K, Shiraishi K, Saruki N, et al. (2015) Um índice multivariado Novel para detecção do cancro do pâncreas com base no perfil Plasma Acid Free Amino. PLoS ONE 10 (7): e0132223. doi: 10.1371 /journal.pone.0132223

editor: Francisco X. real, Centro Nacional de Investigações Oncológicas (CNIO), ESPANHA

Recebido: 06 de janeiro de 2015; Aceito: 12 de junho de 2015; Publicação: 02 de julho de 2015

Direitos de autor: © 2015 Fukutake et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Dados Disponibilidade: Os autores confirmam que, por razões aprovadas, algumas restrições de acesso aplicam-se aos dados subjacentes às conclusões. Os dados subjacentes às conclusões do nosso estudo não pode tornado público devido à natureza das aprovações éticas para o estudo. Os dados estão disponíveis a partir do Centro de Osaka de Medicina de câncer e doenças cardiovasculares Comitê de Ética (via e-mail para [email protected]~~V) para os investigadores que preencham os critérios para o acesso a dados confidenciais.

financiamento: Este estudo foi financiado pela Ajinomoto Co., Inc. o financiador forneceu apoio sob a forma de salários para os autores nO, AI, SK, e Hy, mas não tinha nenhum papel adicional no desenho do estudo, recolha e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito. Os papéis específicos destes autores são articuladas na seção “autor contribuições ‘

interesses concorrentes:. Os autores leram a política da revista e reportar os seguintes conflitos: NÃO, AI, SK, e HY são funcionários da Ajinomoto , Co., Inc. NF, MU, NH, K. Shimada, K.Shiraishi, NS, TI, MEU, e KK recebeu bolsas de pesquisa da Ajinomoto, Co., Inc. NÃO, SK, HY, K. Shiraishi, KK , NF, e MU têm pedidos de patentes WO /2014/084290 “método para avaliar CANCRO dO PÂNCREAS, DEVICE CANCRO dO PÂNCREAS AVALIAÇÃO, CANCRO dO PÂNCREAS AVALIAÇÃO MÉTODO, CANCRO dO PÂNCREAS avaliação do programa, SISTEMA dE CANCRO dO PÂNCREAS AVALIAÇÃO e INFORMAÇÃO COMUNICAÇÃO terminal da unidade.” Estes não fazem alterar a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

o câncer de pâncreas (PC) é atualmente o oitavo principal causa de mortalidade relacionada com o cancro, com uma estimativa de 266.000 mortes no mundo em 2008 [1], e continua a ser uma das neoplasias mais difíceis de tratar. A terapia apenas potencialmente curativa é a ressecção cirúrgica; No entanto, aproximadamente 70% dos casos apresentam inicialmente com doença avançada (fase III-IV), que não pode ser curado por cirurgia. PC avançado tem um prognóstico muito pobre, que é atribuível à ausência de sintomas iniciais e métodos de rastreio úteis, com um período médio de sobrevida de 7,7 meses para a fase III e 2,5 meses para a doença em estágio IV [2]. Além disso, as taxas de sobrevida em 5 anos as informações recebidas somente 21,3% para a fase local, de 8,9% para a fase regional, e 1,8% para o estágio distante [3].

Vários antígenos associados a tumores foram avaliados como potencial prognóstico fatores para PC, incluindo antígeno carcinoembrionário (CEA) e antígeno de carboidrato (CA) 19-9. CA19-9 é o marcador de diagnóstico mais clinicamente útil, com sensibilidade de 79% -81% e especificidade de 82% -90% em pacientes sintomáticos, mas seu valor preditivo positivo baixo faz com que seja um mau marcador de triagem [4]. Além disso, a tomografia computadorizada (TC) e ultra-som endoscópico (EUS) são úteis para o diagnóstico de PC; No entanto, estas modalidades são dispendiosos e potencialmente perigosos. Portanto, é necessário estabelecer métodos de rastreio mais eficazes para PC, especialmente nos primeiros estágios da doença. Os aminoácidos são ou ingerido ou sintetizado endogenamente e desempenham papéis fisiológicos essenciais tanto como metabólitos básicos e reguladores metabólicos. Plasma aminoácidos livres (PFAAs) presentes alvos favoráveis ​​de biomarcadores porque os perfis PFAA são conhecidos por ser influenciada por variações metabólicas em sistemas de órgãos específicos induzidas por doenças específicas [5] [6] [7] [8] [9]. estudos metabolômica abrangentes anteriores freqüentemente focadas em mudanças nos perfis PFAA [10] [11] [12] [13]. A determinação das concentrações PFAA quanto possível marcador de doença é também uma estratégia mais vantajosa para uma análise precisa e de alto rendimento utilizando espectroscopia de massa de metabolômicas abrangentes. Mudanças nos perfis PFAAs são características de vários tipos de câncer; Assim, o desenvolvimento de um índice multivariado composto destes PFAAs poderia ser utilizado para discriminar melhor tipos de cancro individuais a partir de controlos saudáveis ​​[14] [15]. No presente estudo, investigamos os padrões de perfis PFAA, em seguida, desenvolvido e validado um índice multivariada para a detecção de PC.

Materiais e Métodos

Ética declaração

Este estudo foi realizado em conformidade com a Declaração de Helsínquia e o protocolo foi aprovado pelos comitês de ética do Centro de Osaka de Medicina de câncer e doenças cardiovasculares, Kanagawa Cancer Center, o Hospital National Cancer Center, Hospital Universitário de Tokai, Gunma Cancer Center, JCHO Osaka Hospital, Mitsui Memorial Hospital, Kameda Medical Center, eo Kanagawa Associação de Serviços de Saúde. Todos os indivíduos deram seu consentimento informado antes da participação no estudo. As informações clínicas foram anónimos antes da análise de dados.

Assuntos

pacientes PC (n = 360) incluídos neste estudo foram recrutados do Centro de Osaka de Medicina de câncer e doenças cardiovasculares, o Cancer Center Kanagawa , o Hospital National Cancer Center, Hospital Universitário de Tokai, eo Centro de Câncer de Gunma entre 2007 e 2014. os pacientes com pancreatite crônica (CP; n = 28) foram recrutados a partir JCHO Osaka Hospital entre 2013 e 2014, enquanto o controle saudável (HC) sujeitos (n = 8372) que foram submetidos a exame completo de saúde foram recrutados de Kanagawa Associação de Serviços de saúde, Kameda Medical Center (Makuhari Clinic) e Mitsui Memorial Hospital entre 2008 e 2010. Mais de 95% dos PCs e CP casos consecutivos e HCs concordou em fornecer consentir durante o período do estudo. pacientes de PC com as seguintes características foram excluídos: (1) diagnosticada em simultâneo com câncer em outro órgão, (2) a hepatite C, e (3) sob tratamento com agentes anti-câncer. pacientes com PC com as seguintes características foram excluídos: (1) diagnosticado com câncer e (2) da hepatite C. Os critérios de inclusão dos sujeitos HC foram os seguintes: (1) sem história de qualquer tipo de câncer, e (2) sem história de hepatite C . estágio PC foi determinada de acordo com a sexta edição da Internacional Cancer Union Against (UICC) Tumor-nódulo-metástase (TNM) Classificação de tumores malignos [16]

preparação Dataset

Entre os 360 pacientes de PC, 120 pacientes de PC obtidos cedo, a fim de recolha de sangue foram usados ​​como um conjunto de dados de treinamento. Para preparar os temas HC no conjunto de dados de treinamento, 600 dos 8372 pacientes HC foram selecionados utilizando a correspondência de escore de propensão com base no sexo e distribuição etária. A 240 PC restante e todos os 28 pacientes com PC e 7772 indivíduos HC foram usados ​​como um conjunto de dados de validação.

índice de massa corporal (IMC)

A altura eo peso de todos os indivíduos foram medidos. O IMC foi calculado como peso em quilogramas dividido pela altura em metros quadrados. Os valores de IMC foram classificados da seguinte forma: baixo peso ( 18,50 kg /m

2), peso normal (18.50-24.99 kg /m

2), sobrepeso (25.00-29.99 kg /m2) e obesos ( 30.00 kg /m

2)

análise PFAA

Depois de jejum durante a noite, amostras de sangue (5 ml) foram coletadas de veias antecubitais em tubos contendo sal dissódico do ácido etilenodiaminotetracético como anticoagulante. e foram imediatamente ( 1 min) colocada em água gelada ou um recipiente de arrefecimento arrefecido com gelo (Forte crescer Medicai Co., Ltd., Tochigi, Japão). O plasma foi separado de todo o sangue por centrifugação de amostras a 3.000 rpm e 4 ° C durante 15 min e armazenadas a -80 ° C até à análise. Após descongelação, as amostras de plasma foram desproteinizadas utilizando acetonitrilo a uma concentração final de 80%, antes da medição das concentrações de amino ácido por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) de ionização -electrospray (ESI) Espectrometria de -massa (MS) por derivatização pré-coluna. Estes métodos analíticos foram descritos noutro local [17] [18] [19]. As concentrações dos seguintes 19 aminoácidos foram medidos e analisados: alanina (Ala), arginina (Arg), asparagina (Asn), citrulina (Cit), glutamina (Gln), glicina (Gly), histidina (His), isoleucina (Ile ), leucina (Leu), lisina (Lys), metionina (Met), ornitina (Orn), fenilalanina (Phe), prolina (Pro), serina (Ser), treonina (Thr), triptofano (Trp), tirosina (Tyr ) e valina (Val).

a análise estatística

média e desvio padrão (SD).

As concentrações de aminoácidos médios ± SDs foram calculadas para determinar perfis PFAA resumidos para ambos os pacientes e controles.

Mann-Whitney

U

-teste.

O Mann-Whitney

U

-test foi usado para avaliar diferenças significativas das concentrações PFAA entre pacientes e controles.

receptor-operator characteristic (ROC) análise.

análise

ROC foi realizada para determinar as capacidades de análise uni e multivariada para discriminar entre pacientes e controles. Os rótulos de pacientes foram fixados como rótulos de classe positivos. Por isso, uma área sob a curva ROC (AUC de ROC) valor de 0,5 indica que o nível dos aminoácidos foi menor nos pacientes do que nos controlos, enquanto que um valor de AUC de ROC de 0,5 indicou que era mais elevada. Os intervalos de confiança de 95% (IC 95%) da AUC do ROC para a discriminação de pacientes com base nas concentrações de aminoácidos e rácios também foi estimada utilizando os métodos descritos por Hanley e McNeil [20].

regressão logística análise.

multivariada análise de regressão logística foi realizada para estimar o modelo discriminar PC paciente de indivíduos controle.

seleção modelo do índice PFAA.

o índice PFAA foi definida como uma modelo multivariado utilizando concentrações PFAA como variáveis. A análise de regressão logística com a seleção das variáveis ​​foi realizada para distinguir pacientes PC dos sujeitos HC. O número máximo de variáveis ​​explicativas foi restrita a menos de sete para evitar a possibilidade de multicolinearidade. Para selecção do modelo, a AUC do ROC foi obtido após a licença de um fora de validação cruzada (LOOCV). Em suma, um conjunto combinado composto por um paciente PC e indivíduos de controlo correspondentes foi omitido do conjunto de dados de treinamento, eo modelo de regressão logística foi calculado utilizando as amostras restantes para estimar coeficientes para cada aminoácido. Os valores da função para a esquerda-out conjunto combinado foram calculados com base neste modelo. Este processo foi repetido até que cada amostra no conjunto de dados do estudo tinha sido deixado de fora uma vez.

Software

Todas as análises estatísticas e multivariadas foram realizadas utilizando MATLAB (MathWorks, Natick, MA, EUA) e Prism (GraphPad software, Inc., San Diego, CA, EUA) software estatístico.

resultados

Características dos pacientes e controles

Figura 1 mostra uma visão geral desta estude. amostras de plasma em jejum foram coletadas a partir dos sujeitos (pacientes de PC, n = 360; pacientes com PC, n = 28; assuntos HC, n = 8372). A Tabela 1 resume as características dos PC e sujeitos HC incluídos neste estudo. pacientes de PC com o estágio da doença 0-IIB, como um subgrupo estágio ressecável, foram responsáveis ​​por 35,8% do conjunto de treinamento e 35,0% do conjunto de validação.

perfis PFAA dos pacientes com PC

o primeiro mediram as concentrações de aminoácidos 19 de plasma na formação definida por HPLC-ESI-MS e encontraram aumentos significativos nas concentrações Ser e reduções significativas nas concentrações de 14 aminoácidos (Thr, Asn, Pro, Ala, Cit, Vai, Met, Leu, Tyr, Phe, His, Trp, Lys e Arg) em pacientes em comparação com indivíduos de PC HC (

P

0,05) (Tabela 2, Fig S1). Os perfis PFAA foram submetidos a AUC da análise ROC porque os níveis de significância são dependentes do tamanho da amostra (Figura 2, Tabela S1). As concentrações plasmáticas de Ser foram especialmente superior, enquanto Trp e Seus concentrações foram particularmente menor nos pacientes de PC em comparação com indivíduos HC. Os perfis PFAA de pacientes de PC com o estágio da doença 0-IIB, como um subgrupo estágio ressecável, foram quase semelhantes aos de todos os outros pacientes de PC.

Curva

Os resultados da característica receptor-operador (ROC) análise dos perfis PFAA no conjunto de treinamento (120 PC e combinando 600 HC). Eixos mostrar a AUC do ROC para cada aminoácido a discriminar os doentes de controlo saudáveis. linhas arrojadas pretos indicam o ponto onde a AUC da ROC = 0,5.

índice multivariada PFAA

Para a detecção eficaz dos pacientes de PC, foram calculados índices PFAA ideais por análise de regressão logística múltipla. Os valores AUC de ROC obtidos após LOOCV no top 50 modelos eram praticamente o mesmo (0,88-0,89). Nós avaliamos um modelo representativo composto por Ser, Asn, lie, Ala, His, e Trp como o melhor modelo (Tabela 3). Em seguida, a regressão logística análises adicionais acrescentando IMC e /ou história de tabagismo em variáveis ​​explicativas foram realizados para estimar o efeito do potencial de confusão. Nenhuma elevação óbvia de significância foi observada em cada um dos aminoácidos quando estes elementos foram adicionados ao modelo, sugerindo que as alterações do nível de plasma desses aminoácidos causadas por PC foram independentes para IMC ou hábitos tabágicos de indivíduos (Tabela 3).

Em termos de discriminar pacientes de PC de indivíduos controle, curvas ROC para o PC contra HC ou CP subgrupos entre o conjunto de treinamento e validação definido foram calculados (Fig 3A e 3B, respectivamente). No conjunto de treinamento, as AUC dos índices PFAA para detecção de pacientes de PC vs assuntos HC foi de 0,89 (IC 95%, 0,86-0,93) entre todos os pacientes de PC e 0,89 (IC 95%, 0,83-0,95) entre os pacientes com PC estágio 0-IIB doença. As sensibilidades dos índices PFAA a 95% e especificidade de 80% foram 60,0% e 82,5%, respectivamente, para todos os pacientes de PC, e 53,5% e 83,7% para os doentes com PC estágio da doença 0-IIB, respectivamente (Tabela 4). No conjunto de validação, a AUC do índice PFAA foi de 0,86 (IC 95%, 0,84-0,89) para todos os pacientes de PC e 0,81 (IC 95%, 0,75-0,86) para pacientes de PC com estágios IIA e IIB da doença (Fig 3B) . As sensibilidades dos índices PFAA a uma especificidade de 95% e 80% foram 57,5% e 76,7% para todos os pacientes de PC, e de 48,8% e 64,3% para os doentes com PC IIA IIB fase e a doença (Tabela 4). A AUC do índice PFAA para a detecção de PC vs CP foi de 0,87 (IC 95%, 0,80-0,93) para todos os pacientes de PC e as taxas de falso-positivos em 95% e especificidade de 80% foram de 7,1% e 25,0%, respectivamente ( tabela 4). S2 Fig mostra gráficos de caixas de índice PFAA no HC, PC e CP no conjunto de validação.

Nós confirmamos que a variância inflar fator (VIF), o máximo do elemento diagonal de a matriz inversa da matriz de coeficientes de correlação, de todos os 50 modelos para não escolher os modelos inadequados mostrando multicolinearidade. Todos os modelos passou no teste, isto é, vifs foram menos de 10. Acima de tudo, VIF do modelo representativo foi 1,70, sugerindo que não ocorreu multicolinearidade.

Para além disso, análises de subgrupo foi realizada para a fase do tumor, tamanho e localização no pâncreas. A AUC do índice PFAA de acordo com o estágio do tumor foi o seguinte: (IC 95%, 0,72-0,86) 0,79 para IIA palco, (IC 95%, 0,77-0,92) 0,85 para a fase IIB, 0,88 (95% CI, 0.83- CI 0,94) para a fase III, e 0,91 (95%, 0,88-0,94) para o estágio IV (Fig 4A). A AUC do índice PFAA de acordo com o tamanho do tumor foi como se segue: (IC de 95%, 0,66-0,86) 0,76 para TS1, (IC de 95%, 0,83-0,90) 0,87 para TS2, (IC de 95%, 0,86-0,95) 0,91 para TS3, e 0,97 (95% CI, 0,95-1,00) para TS4 (Fig 4B). A AUC do índice PFAA de acordo com a localização do tumor foi como se segue: 0,86 (IC de 95%, 0,82-0,90) para a cabeça do pâncreas, (IC de 95%, 0,83-0,93) 0,88 para o corpo do pâncreas, e 0,90 (95% CI , 0,83-0,96) para a cauda do pâncreas (Figura 4C). Além disso, avaliou-se as correlações entre os valores de índice PFAA e outros biomarcadores (isto é, CA19-9, CEA e elastase-1), porque o uso combinatória de múltiplos marcadores tumorais independente é eficaz para detectar a PC. Não foram encontradas correlações significativas entre os índices PFAA e níveis de CA19-9 (r = 0,075,

p

= 0,247), CEA (r = -0,005,

p

= 0,957), ou elastase-1 (r = 0,009,

p

= 0,351) em PC (Fig 5, S2 Tabela).

(a) ROC curvas do índice PFAA em estádios IIA (vermelho), estágio IIB (rosa), fase III (laranja), e estágio IV (verde-amarelo), respectivamente. (B) curvas ROC em TS1 (vermelho), TS2 (rosa), TS3 (laranja), e TS4 (verde-amarelo), respectivamente. TS1 ≤ 2,0 cm, 2,0 cm de TS2 ≤ 4,0 cm, 4,0 cm TS3 ≤ 6,0 cm e TS4 6.0 cm. curvas (C) ROC na cabeça do pâncreas (vermelhos), corpo (rosa), e da cauda (laranja), respectivamente.

A linha pontilhada mostra o ponto de corte de cada biomarcador ou índice PFAA. Para a análise dos dados, foram definidos os limites superiores normais de CA19-9, CEA, e elastase-1 como 37 U /mL, 5 ng /dL, e 300 ng /dL, respectivamente. Não foram encontradas correlações significativas entre cada biomarcador eo índice PFAA.

Discussão

A desregulação do conteúdo PFAA no PC tem sido investigada em vários estudos recentes usando metabolômica ou análise de aminoácidos [21 ] [22] [23]. No entanto, os perfis PFAA específicas em PC, especialmente em estágios ressecáveis, permanecem não confirmadas por causa do número relativamente pequeno de pacientes de PC e controles utilizados nestes estudos. Portanto, medimos jejum concentrações PFAA em um estudo em grande escala de 360 ​​pacientes de PC e 8372 indivíduos controle para identificar perfis PFAA específicos em pacientes de PC em comparação com um conjunto de treinamento pareados por gênero e idade (PC120, HC600) (Figura 2) . Além disso, um perfil PFAA semelhante foi observado em pacientes com doença em estágio 0-IIB, que respondeu por 35,8% do PC pacientes incluídos neste estudo. (Figura 2). Como mostrado na Tabela 2, as concentrações de plasma de vários ácidos aminados foram significativamente alteradas nos pacientes de PC, que estavam de acordo com os perfis PFAA de cinco tipos de cancro relatados por Miyagi et al. [14], apesar de plasma Sua e as concentrações de triptofano particularmente foram reduzidos, enquanto que as concentrações Ser foram notavelmente aumentada (Fig 2). Além disso, desenvolveu-se um índice de PFAA utilizando um conjunto de treino composto por seis aminoácidos que estavam claramente característica do perfil de aminoácidos no PC. Nós demonstramos que este índice pode ser utilizado para diferenciar de forma eficiente, não só mas também progressiva PC PC operável, a partir de estádios IIA e IIB da doença num conjunto de validação independente (Tabela 4). Além disso, também mostrou que o índice PFAA dificilmente detecta pancreatite crónica (Tabela 4).

PFAA perfis dos pacientes com PC foram relatados em vários estudos anteriores, entre os quais, vários perfis de aminoácidos foram semelhantes, embora houvesse algumas discrepâncias óbvias [21] [22] [23] Por exemplo, encontramos um aumento significativo nas concentrações Ser plasma em PC, enquanto que esta tendência não foi observada em outros estudos. Além disso, há discrepâncias em Asn, Gln, Met, lie, Phe, Leu, Pro e níveis. Em contraste, esses estudos anteriores comumente relataram uma diminuição significativa nas concentrações de THR, enquanto que as mudanças em Arg, o CIT, e as concentrações de triptofano não foram determinadas em um estudo, e reduções significativas na estes aminoácidos em PC foram observados em nosso estudo, bem como dois outras. Consideramos várias razões para estas discrepâncias. Em primeiro lugar, esses estudos anteriores incluíram um número relativamente pequeno de indivíduos em comparação com o presente estudo, que incluiu o maior número de indivíduos até à data. Neste estudo, o índice PFAA foi robusto eo AUC quase diminuiu mesmo com o conjunto de validação porque foi desenvolvido com base em um conjunto de treinamento com um tamanho adequado da amostra. Em segundo lugar, as diferenças entre nossos resultados e os de outros estudos pode ter ocorrido devido a variações nas condições de preparação de amostras e métodos de análise. Em terceiro lugar, perfis PFAA exibem flutuações diurnas [24] [25] [26] e mudam de acordo com os ritmos circadianos [27] [28], porque eles são em grande parte dependente de refeições recentes, mesmo entre indivíduos saudáveis ​​[24] [25] [26] [29]. Além disso, deixando amostras de sangue recolhidos à temperatura ambiente é conhecida para alterar as concentrações de aminoácidos no plasma [30]. Para superar este fator de confusão, todas as instalações que participam neste estudo utilizou o mesmo protocolo, em que o sangue foi tirada na manhã antes do pequeno-almoço após o jejum durante a noite e as amostras coletadas foram rapidamente resfriado para evitar alterações nas concentrações de aminoácidos por causa de reacções enzimáticas. Portanto, as amostras adquiridas eram de alta qualidade e os dados extraídos reflete com precisão em perfis de aminoácidos vivo durante o jejum. Além disso, a determinação das concentrações de aminoácidos utilizando HPLC-ESI-MS neste estudo foi calculado como um valor semiquantificadas usando metabolômicas como em estudos anteriores, mas sim como directamente quantificada concentrações absolutas através da criação de uma curva de calibração a partir da área do pico de referência padrão de cada amino ácido [19]. Estas medidas foram altamente exato e preciso para garantir a validação, reprodutibilidade e erro diária limitada [19]. Assim, os resultados deste estudo podem demonstrar mais claramente características do perfil em comparação com aquelas demonstrada por estudos anteriores. A utilização de análise multivariada de marcadores para PC também foi relatada [23, 31]. Por exemplo, Kobayashi et ai. [23] construiu um modelo de regressão logística múltipla usando um conjunto com as concentrações de quatro metabolitos selecionados como variáveis ​​a partir de dados de forma abrangente semiquantificadas de concentrações do metabolito por GC-MS formação 43-caso. Enquanto isso, um dos quatro metabolitos seleccionados, o xilitol é uma substância derivada de alimentos que está presente em concentrações muito baixas em indivíduos saudáveis ​​[32] [33]. No entanto, não ficou claro se estas concentrações são fisiologicamente mantida em certos níveis in vivo. Além disso, Leichtle et ai. [31] construído um painel metabólito combinado para discriminar PC da CP e HC usando ácido aspártico (Asp) e CA19-9 como variáveis. No entanto, a concentração de plasma Asp tende a ser relativamente baixo e uma variabilidade analítica de 25%, como relatado noutro local [34]. No presente estudo, o índice PFAA foi construída com apenas aminoácidos com moderada a altas concentrações plasmáticas para garantir a precisão da medição. Portanto, acreditamos que o índice PFAA oferece uma alta capacidade discriminatória, sem serem influenciadas por erros de medição. Como a análise de aminoácidos é utilizado clinicamente, o índice PFAA é susceptível de ser rapidamente verificados e nós suspeitamos que a sua utilização irá ser disseminado no futuro próximo. Enquanto isso, elementos genéticos, raciais e geográficas também podem ser fatores que impactam estas diferenças, que devem ser esclarecidos em pesquisas futuras.

Há vários mecanismos possíveis que podem influenciar perfis PFAA em pacientes com câncer. Primeiro, estudos anteriores demonstraram alterações metabólicas marcadas no cancro local, incluindo os perfis de aminoácidos variadas e expressão diferente de transportador de aminoácidos em células cancerosas em comparação com as células saudáveis ​​[10] [35]. Por exemplo, a L-neutro transportador de aminoácidos 1 (LAT1) é fortemente expresso em células PC [36]. No que diz respeito a Ser, de novo Ser biossíntese é regulada positivamente em células cancerosas e Ser actua como activador alostérico da isoenzima de piruvato-quinase M2 [37]. Esta característica pode estar relacionado a fatores que também aumentam as concentrações Ser plasma. Um segundo mecanismo possível é a indução de alterações metabólicas remotos de órgãos causados ​​por factores emitidos a partir de células cancerosas. Por exemplo, Luo et al. [38] relataram que a HMGB-1 secretada por células cancerosas causou a degradação de proteínas dos tecidos musculares remoto em aminoácidos, algumas das quais vazar para o sangue, alterando, assim, o perfil PFAA. Um terceiro mecanismo possível é o envolvimento do sistema imunitário. Por exemplo, as concentrações plasmáticas de Trp foram correlacionadas com as mudanças metabólicas comuns, tanto no nosso estudo e de um estudo anterior que investigaram os níveis de Trp em cinco tipos diferentes de cancro [14]. Expressão da indoleamina 2,3-dioxigenase (IDO), que está envolvida na via metabólica quinurenina, é induzida em diferentes tipos de cancro (células de cancro ou células imunes) e conhecida por desempenhar um papel importante na imunossupressão [39]. IDO também é conhecido por ser sobre-expresso em células PC [40]. Assim, vários pontos relativos aos mecanismos por trás mudanças nos perfis PFAA em PC permanecem obscuros; Assim, é necessária mais investigação para esclarecer essas questões.

Recentemente, Mayers et al. [41] relatou que os níveis de aminoácidos de cadeia ramificada (BCAA) de soro são elevados 2-5 anos antes do início da carcinogênese em PC, sugerindo que a elevação BCAA é um fator de risco independente para PC. No entanto, os níveis de BCAA voltar aos níveis normais dentro dos 2 anos antes da confirmação do câncer. Além disso, os resultados de um estudo de rato indicaram que o período de elevação de BCAA era em forma de sino e apenas temporária. Em nosso estudo, foram apresentados os perfis PFAA de pacientes diagnosticados definitivamente após a detecção do câncer através de diagnóstico por imagem. Entre os casos com doença em estágio ressecável (até à fase IIB), não houve mudanças significativas nas concentrações de BCAA em comparação com indivíduos de controlo. Em casos de câncer avançado, Leu e as concentrações de Val foram diminuídos. Nossos dados do estudo características de fases de PC que são facilmente confirmada por métodos de imagem disponíveis atualmente identificados; Assim, é possível que estas características diferiram entre as principais fases de microcarcinoma ou antes do início da carcinogénese. Porque não examinar as concentrações PFAA antes carcinogênese neste estudo, estudos futuros são necessários para identificar com precisão a dinâmica de BCAA de antes PC início à carcinogênese. No entanto, os estudos acima referidos descobriu que alterações metabólicas alterar perfis de aminoácidos sistémicos, juntamente com alterações nas concentrações de BCAA plasma na fase pré-cancerosa ou estágios muito iniciais de PC [41]. Portanto, as mudanças observadas nos perfis PFAA dos pacientes com lesões PC, que pode ser diagnosticada através de imagem e considerados para a ressecção em nosso estudo, também pode ter sido causado por alterações metabólicas sistêmicas.

Atualmente, CA19-9 é o marcador mais utilizado para prever o resultado do tratamento PC e prognóstico pós-tratamento [42]. No entanto, CA19-9 não é sintetizado por pacientes classificados como grupo sanguíneo Lewis Le

a-b-, que responde por 10% dos casos; Portanto, este marcador pode não ser elevada, em alguns pacientes, mesmo aqueles com PC fase avançada [43]. CEA é amplamente usado como um marcador de prognóstico no cancro gastrointestinal; no entanto, a sua sensibilidade e especificidade para PC são pobres [44]. A enzima elastase pancreática-1, que é pensado para aumentar a pancreatite causado por estenose do ducto pancreático, tem sido demonstrada como um marcador de diagnóstico precoce eficaz [45]. No presente estudo, não foram encontradas correlações entre o índice PFAA e CA19-9, CEA, ou elastase-1 níveis (Fig 5). Assim, quando usado concomitantemente, o índice PFAA com CA19-9, CEA, ou elastase-1 podem complementar-se mutuamente, a fim de detectar com mais precisão PC. No entanto, CA19-9 e elastase-1 não foram medidos nos sujeitos HC neste estudo. Assim, para confirmar a comparação da capacidade discriminatória precisa e efeito sinérgico com estes marcadores, são necessários mais estudos. A capacidade discriminatória do índice PFAA mostrou-se elevada mesmo para pequenos tumores pancreáticos de TS-1 de acordo com a análise de subgrupos (ROC_AUC = 0,76) (Figura 4B). Também descobrimos que o índice PFAA não era dependente da localização do tumor pancreático (figura 4C). Embora a ultra-sonografia abdominal geral é usado para diagnosticar PC na fase inicial, é difícil de pequenos tumores de imagem ou lesões na cauda do pâncreas ou processo uncinado utilizando esta modalidade. Os nossos resultados sugerem que o índice proposto PFAA desenvolvido neste estudo oferece a mesma sensibilidade sem dependendo da localização do tumor. Portanto, o uso combinatória de ultra-sonografia abdominal eo índice PFAA pode ser um bom marcador para aumentar a taxa de detecção de lesões da cauda do pâncreas e do processo uncinado. Neste estudo, o conjunto de treinamento e conjunto de validação foram divididos em ordem cronológica. Como resultado, não há casos precoces de fase I ou menos foram incluídos no conjunto de validação que ocorreu cronologicamente mais tarde no tempo. O fato de que a capacidade discriminatória do índice PFAA para os casos em estágio inicial da fase I ou menos permanece desconhecido é uma limitação do estudo. No entanto, este estudo foi transversal;