Sumário

Há cada vez mais evidências de que embelin, um componente ativo da

embelia Ribes

, induz a apoptose em células cancerosas humanas, mas os mecanismos detalhados ainda não estão claros. Aqui, nós investigamos o efeito de embelin sobre o crescimento de células cancerosas humanas da próstata. Embelin crescimento celular fortemente inibida especialmente em linhas de células de cancro de próstata humanas, incluindo PC3, DU145, LNCaP-LN3 e células epiteliais de próstata normais, RWPE-1 em comparação com o cancro da mama (MDA-MB-231, MCF-7 e T47D), hepatoma (HepG2, Hep3B e HuH-7), ou coriocarcinoma (JEG-3). Observou-se que a apoptose induzida embelin das células PC3 de um modo dependente do tempo correlacionada com a diminuição da expressão de Bcl-2, Bcl-XL e Mcl-1, o aumento da translocação de Bax para dentro da mitocôndria e uma redução no potencial de membrana mitocondrial. Além disso, embelin induzida dependente de voltagem canal de ânions (VDAC) 1 expressão e oligomerização, o que pode promover citocromo

c

e liberação FIA. Porque embelin foi capaz de inibir a activação de Akt e da expressão de ciclooxigenase-2, foram determinados os efeitos sobre a sinalização de Wnt /β-catenina. Embelin activada de glicogénio sintase quinase -3β (GSK), impedindo a fosforilação e suprimiu a expressão β-catenina. A atenuação da actividade transcricional TCF β-catenina e a transcrição de genes mediada, tal como a ciclina D1, c-myc, e metaloproteinases da matriz (MMP) -7, foram mostrados nas células tratadas com embelin. As alterações nos níveis de β-catenina em resposta a embelin foram bloqueados pelo cloreto de lítio, um inibidor de GSK-3, que indica que pode diminuir a expressão embelin β-catenina através da activação de GSK-3β. Além disso, a exposição das células PC3 de embelin resultou numa diminuição significativa na migração celular e invasão. Em conclusão, estes resultados sugerem que a inibição da Akt sinalização e activação de GSK-3β contribui parcialmente para o efeito pró-apoptótica de embelin em células de câncer de próstata

Citation: Parque N, Baek HS, Chun YJ (2015. ) Embelin Induzida por apoptose das células do cancro da próstata humana é mediada através da modulação da Akt e β-catenina Sinalização. PLoS ONE 10 (8): e0134760. doi: 10.1371 /journal.pone.0134760

editor: Seok-Geun Lee, Kyung Hee University, República da Coreia

Recebido: 04 de março de 2015; Aceito: 13 de julho de 2015; Publicação: 07 de agosto de 2015

Direitos de autor: © 2015 Park et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por uma Fundação Nacional de Pesquisa da Coreia (NRF) de subvenção financiada pelo governo coreano (MSIP) (No. 2015R1A5A1008958). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Embelin (2, 5-di-hidroxi-3-undecil-1, 4- benzoquinona), isolado como o componente activo do fruto da

embelia Ribes

Bir (Myrsinaceae), tem sido utilizados para tratar a febre e mostraram ter anti-inflamatórios, anti-cancerígenos [1], anti-oxidante [2], anti-convulsivante [3], e anti-bacterianas actividades [4,5]. Embelin é conhecido por ser um potente inibidor de molécula pequena do inibidor ligado a X da proteína de apoptose (XIAP) que anula ligação de XIAP ao pro-caspase-9 [1]. Embelin actua como um potente inibidor da NF-

κ

B [6,7] e mostra os efeitos citotóxicos sobre uma variedade de linhas celulares de cancro [8]. Embora embelin é conhecida por suprimir a proliferação celular e induzem a apoptose em muitas células de cancro humano, os mecanismos moleculares de estes efeitos permanecem pouco claros. A apoptose desempenha um papel importante no controlo da integridade celular e é estritamente regulamentado. Dois principais vias apoptóticas distintas têm sido desenvolvidos, as vias intrínseca e extrínseca. Os sinais de iniciação para a via intrínseca são gerados por estímulos de desenvolvimento ou dano celular que provoca a perda de potencial de membrana mitocondrial e à libertação de proteínas pró-apoptóticas [9, 10]. No entanto, os mecanismos pelos quais os iniciadores apoptogénicas atravessar a membrana mitocondrial externa (OMM) ainda não foram totalmente resolvidos. canal dependente da voltagem de aniões (VDAC) 1 localizada na OMM tem sido proposto como um importante componente da poro de transição de permeabilidade (PTP), o que leva à libertação de citocromo c e apoptose factor indutor (FIA) [11,12]. A oligomerização de VDAC1 para formar uma estrutura de poros grandes em resposta a vários sinais pró-apoptóticos podem ser necessários para a libertação de citocromo c [13]. Além disso, a interacção de VDAC1 com Bax, uma proteína pró-apoptótica da família Bcl-2 podem formar complexo de maior do que VDAC1 sozinho ou Bax sozinho e promove a abertura da PTP [14]. No entanto, as proteínas da família Bcl-2, anti-apoptóticos tais como Bcl-2, Bcl-xL, Mcl-1, ou impedir a abertura de PTP e estão associados com a resistência ao tratamento e progressão em muitos tipos de cancro, incluindo o cancro da próstata [15]. De acordo com estudos anteriores, Mcl-1 é um regulador fundamental da apoptose e diferenciação e é sobre-expresso na maioria das células de cancro da próstata [16]. Chen et al. relataram uma nova via, que consiste de Akt, ciclo-oxigenase-2 (COX-2), e Mcl-1, com uma resistência adquirida para a apoptose em células cancerosas [17]. Akt regula redes de sinalização celular que estão envolvidos em processos relacionados com a proliferação celular, a diferenciação e o metabolismo e activa uma via anti-apoptótica de COX-2 mediada que envolve Mcl-1 [18,19]. A fosforilação por Akt no resíduo Ser 9 de GSK-3β leva a sua inactivação [20, 21], resultando na estabilização do β-catenina, o que está correlacionado com o aumento da transcrição de genes alvo a jusante [22]. Além disso, a inibição da fosforilação por GSK-3β suprime claramente expressão β-catenina e resistência à apoptose. O presente estudo mostra que embelin induz apoptose dependente da mitocôndria e supressão da expressão β-catenina através da inibição Akt ea ativação GSK-3β em células cancerosas humanas da próstata.

Materiais e Métodos

celular cultura

próstata humano linhas celulares de cancro PC3, DU145 e LNCaP-LN3, linha de células epiteliais da próstata humana RWPE-1, fígado hepatocelular linha de células de carcinoma humano HepG2, Hep3B e HuH-7 ou linha de células de câncer de mama humano MDA células MB-231, MCF-7 e T47D foram obtidas da American Type Culture Collection (Manassas, VA) e foram cultivados em meio RPMI 1640 suplementado com 10% (v /v) de soro fetal de bovino inactivado pelo calor (FBS), 100 U /mL de penicilina, e 100 ug /ml de estreptomicina. A linha de células de coriocarcinoma humano JEG-3 foi adquirido a partir da linha celular coreana Banco e foi cultivada em meio DMEM com 10% (v /v) de FBS inactivado pelo calor, 100 U /mL de penicilina, e 100 ug /ml de estreptomicina. As células foram mantidas a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO

2.

Reagentes

Embelin foi adquirido de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Uma solução de 100 mM de embelin foi preparada em sulfóxido de dimetilo, armazenado em pequenas alíquotas a -20 ° C e depois diluiu-se conforme necessário no meio de cultura celular. Uma solução 8M de cloreto de lítio foi obtido a partir de Sigma-Aldrich e diluiu-se conforme necessário no meio de cultura celular. FBS e meio RPMI 1640 foram adquiridos a partir de HyClone (Logan, UT). O sistema de transfecção de néon, JC-1 kit de ensaio e anticorpo de COX-4 eram da Life Technologies (Carlsbad, CA). O kit de ensaio de proteína do ácido bicinconínico (BCA) e o kit ECL foram de Thermo Scientific (Rockford, IL). Os anticorpos contra fosfo-Akt (Ser 473), a GSK-3β, fosfo-GSK-3β, ou Bcl-2 foram de Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Os anticorpos contra-Akt total, VDAC1, Bcl-xL, Bax, β-catenina, ciclina D1, GAPDH ou de cabra anti-IgG de coelho-vermelho do Texas e Ultra Cruz meio de montagem foram de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). A ciclo-oxigenase-2 (COX-2), Mcl-1, citocromo

C

, anticorpos FIA, β-catenina, c-myc ou a histona H1 eram da Millipore Co. (Bedford, MA). Todos os outros produtos químicos eram da mais alta pureza ou de grau de biologia molecular e foram obtidos a partir de fontes comerciais.

A viabilidade celular ensaio

As células (1 x 10

4 células /cavidade) foram adicionados a um microplacas de fundo redondo de 96 poços e foram incubados durante o tempo designado, a 37 ° C. Após o tratamento durante o tempo designado, as células foram tratadas com 10 mL de EZ-CyTox (Serviço Lab Daeil, Coreia) foi adicionado a cada poço. Após 2 h de incubação a 37 ° C, a absorvância foi medida a 450 nm utilizando um leitor de microplacas Pro GENios (TECAN, Suíça).

Anexina V /PI ensaio de apoptose

As células foram sedimentadas a 1.200 rpm e lavadas uma vez com 1 ml de fosfato gelada solução salina tamponada (PBS). O sedimento resultante foi ressuspenso em 1 ml de tampão de ligação 1 ×. A mistura resultante foi mantida em gelo durante 60 min, após o que as células foram permeabilizadas com /ml de anexina V-FITC e iodeto de propídio a 50 ug /mL em 1 × tampão de ligação 50 ug. As amostras foram mantidas a 37 ° C durante 60 min e imediatamente analisadas utilizando um citómetro de fluxo FACScan BD (Becton Dickinson, San José, CA).

Medição do potencial de membrana mitocondrial (Δ

ψ

m)

células cultivadas em lamelas de poli-d-lisina-revestidas foram tratadas durante 24 h com embelin em meio de crescimento, rapidamente lavada com PBS, e depois marcado com 2 uM JC-1 durante 30 min a 37 ° C em 5% de CO

2 incubadora. Depois de se lavar várias vezes com PBS, as lamelas foram montadas em lâminas de vidro utilizando meio de montagem Cruz Ultra. sinais de fluorescência foram analisados ​​com um LSM 510 META Confocal Laser Scanning Microscope (Zeiss, Jena, Alemanha).

transfecção transitória

Para a transfecção transitória, as células foram transfectadas com Pece myr-Akt ou COX humana -2 construções de promotor de luciferase e vectores de pRL-Renilla (Promega), utilizando o sistema de transfecção de néon, tal como recomendado pelo fabricante. Resumidamente, um dia antes da transfecção, cerca de 5 × 10

5 células por placa de 60 mm foram semeadas em meio RPMI 1640 contendo 10% de FBS. As células foram lavadas em PBS e, em seguida, ressuspenderam-se em meio isento de soro de Opti-MEM. A transfecção foi realizada com 2 ug de ADN de plasmídeo por 5 h a 37 ° C. Após a transfecção, as células foram mantidas em meio RPMI contendo 10% de FBS durante 48 h.

subcelular fraccionamento

Após o tratamento, as células foram colhidas e lavadas com PBS gelado. fracionamento subcelular foi realizada utilizando o kit de isolamento de mitocôndrias de células cultivadas e kit NE-PER nuclear e citoplasmática Extração da Thermo Scientific. Western blot foi efectuada utilizando anticorpos contra as seguintes proteínas marcadoras de controlo:. GAPDH para a fracção citosólica, COX-4 para a fracção mitocondrial ou histona-H1for a fracção nuclear

análise Western blot

As células foram solubilizadas com tampão de lise arrefecido com gelo (pH 7,4) contendo 25 mM de HEPES, 1% de Triton X-100, NaCl 50 mM, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, PMSF 1 mM e 1 jag /mL de leupeptina. As proteínas extraídas (30 ug) foram separados por electroforese em gel de dodecilsulfato de sódio-sulfato de poliacrilamida (SDS-PAGE) em géis de poliacrilamida a 10%, e foram transferidas electroforeticamente para membranas de PVDF. As membranas foram bloqueadas em 5% (w /v) de leite desnatado seco em solução salina tamponada com Tris durante 2 h a 4 ° C e, em seguida, foram incubadas durante a noite com anticorpos primários a uma diluição de 1: 1000 em 5% (w /v) de Tris solução salina tamponada contendo 0,1% de Tween-20. Após a incubação com o anticorpo secundário durante 2 h, as proteínas foram visualizadas por ECL e a intensidade da banda foi analisada usando um densitómetro ChemiDoc XRS e quantificada por software Quantity One (Bio-Rad, Richmond, CA). As concentrações de proteínas foram estimadas utilizando o método de BCA de acordo com as recomendações do fornecedor, utilizando albumina de soro bovino como padrão.

Imunofluorescência

Células cultivadas em D-lisina-revestidas de poli lamelas foram tratadas durante 24 h com embelin em meio de crescimento, rapidamente lavada com PBS, e depois tratou-se com meio de crescimento incluindo sondas de 100 nM Mitotracker (Invitrogen). Após 1 h, as células foram fixadas com 3,7% (w /v) de paraf ormaldeído em PBS, pH 7,4, durante 30 min à temperatura ambiente. Após lavagem com PBS, as células foram bloqueadas durante 15 min em PBS contendo soro de cabra a 5% e 0,2% de Triton X-100, em seguida, incubadas com anticorpo primário (1: 1000) durante 1 h, lavadas extensivamente e coradas durante 1 h com de cabra anti-IgG de coelho-vermelho do Texas (1: 500). Depois de mais lavagens, as lamelas foram montadas em lâminas de vidro usando meio de montagem Cruz Ultra. sinais de fluorescência foram analisados ​​usando um LSM 510 META Confocal Laser Scanning Microscope (Carl Zeiss, Alemanha).

Após o tratamento com embelin, sulfo-EGS em DMSO foi adicionado Cross-linking de VDAC

a uma concentração final de 250 uM. Após 25 minutos de incubação a 30 ° C, o agente de ligação cruzada foi parada pela adição de 1 M de Tris-HCl (pH 7,5) até uma concentração final de 20 mM. As amostras foram, em seguida, solubilizado em 1% de NP-40 e sonicados durante 7 s cinco vezes com um pulso de 30%, utilizando um sonicador Vibra-Cell (Sonics and Materials, Newtown, CT).

fragmentação do ADN de ensaio

os fragmentos de DNA foram extraídos com o Exgene celular SV sistema de purificação de ADN genómico (GeneAll, Coreia) de acordo com o protocolo do fabricante. Os fragmentos de ADN foram separados usando electroforese em gel num gel de agarose a 1%. ADN carregado foi visualizado por ChemiDoc XRS (Bio Rad).

repórter da luciferase dupla ensaio

As células (1 x 10

6 células /poço) foram co-transf ectadas com 2 ug de COX-humano 2 construções de promotor de luciferase e vectores de pRL-Renilla (Promega) ou 2 ug de vectores de luciferase TOPFlash com os sítios de ligação de TCF de tipo selvagem e FOPFlash vector de luciferase com o mutante TCF locais de ligação de acordo com o protocolo do fabricante, utilizando o sistema de transfecção de néon. Após 48 h, as células foram tratadas com 30? M embelin durante os tempos indicados, e lisadas com tampão de lise passiva, e as actividades da luciferase foram medidas consecutivamente usando o ensaio de luciferase Dual System (Promega) com um leitor de microplacas FilterMax F3 (Molecular Devices, CA) .

cicatrização de feridas ensaio

células (1 × 10

6 células /poço) foram semeadas em placas de 6 poços de cultura de células. As células foram deixadas a crescer até à confluência em meio RPMI1640 contendo 10% de FBS. As células foram lavadas com PBS e incubadas com 25 ug /mL de mitomicina C, durante 30 min. scratch A1-mm de largura foi feita através da camada de células utilizando uma ponta de pipeta estéril. As placas foram fotografadas após o tempo indicado.

ensaio de invasão

invasão celular foi medida utilizando o kit de ensaio de invasão de células (Chemicon, Temecula, CA) de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, as células foram semeadas numa câmara de invasão inserção contendo um tamanho de poro da membrana de policarbonato de 8 um revestido com uma fina camada de colagénio polimerizado. Invadir as células na parte inferior da membrana foram coradas inserção e fotografado.

Gelatina zimografia

O meio condicionado foram analisados ​​por gelatinases por zimografia de gelatina. Para as gelatinases, as amostras foram separadas em condições não redutoras em géis de 10% de SDS-poliacrilamida incorporando 0,1% de gelatina. Após SDS-PAGE, o gel foi incubado com tampão de renaturação durante 15 minutos, três vezes. Em seguida, os géis foram substituídos em tampão de desenvolvimento a 37 ° C durante a noite. Os géis foram lavados e fotografado após coloração com 0,5% de solução de azul de Coomassie durante 30 minutos.

A análise estatística

A análise estatística foi realizada utilizando análise unidireccional da variância, seguida de comparação múltipla de pares de Dunnett t-teste com o software GraphPad Prism (GraphPad software Inc., CA), quando apropriado. As diferenças foram consideradas estatisticamente significativas a *

p Art 0,05.

Resultados

Embelin inibe a proliferação de células cancerosas humanas da próstata

Várias linhas de células cancerosas humanas, incluindo células cancerosas da próstata (PC3, DU145 e LNCaP-LN3), humanos células de próstata epitelial (RWPE-1), células de cancro da mama (MDA-MB-231, MCF-7 e T47D), células de hepatoma (HepG2, Hep3B e huh-7), e células de coriocarcinoma (JEG-3) foram tratados com várias concentrações de embelin para determinar os efeitos de embelin sobre a proliferação celular (Fig 1). Embelin inibiu significativamente o crescimento de células cancerosas humanas da próstata em comparação com os seus efeitos sobre outras células cancerosas. A viabilidade celular foi reduzida em embelin em linhas de células cancerosas humanas da próstata e células epiteliais da próstata, incluindo PC3, DU145, LNCaP-LN3 e RWPE-1 com IC

50 valores de 23,6 mm, 11,0 mm, 32,0 mm, e mais de 200? M, respectivamente quando as células foram cultivadas durante 24 h (Figura 1E). linhas celulares de cancro da próstata foram claramente inibida por embelin, mas de células de próstata normal não foi afectado por embelin em baixa concentração durante 24 h. Para estudos posteriores, 30 uM de concentração embelin foi seleccionado para o tratamento de células PC3.

As células foram tratadas com embelin a várias concentrações para os tempos indicados. A viabilidade celular foi medida por CCK. formação de formazano foi quantificada por espectrofotometria a 450 nm. Calculou-se a percentagem de células sobreviventes em cada grupo relativamente ao controlo. (A) de células PC3. (B) de células DU145. célula (C) de LNCaP-LN3. (D) RWPE-1 de células. (E) CI

50 valores de embelin em várias linhas celulares de cancro humano. O

50 valores IC foram analisados ​​usando o software GraphPad Prism. Os valores representam a média ± S.D. de três determinações independentes. *, Significativamente diferentes das células de controlo não tratados (

p Art 0,05).

A indução de apoptose por embelin

Para elucidar se embelin induz a apoptose em PC3 células, análise citométrica de fluxo foi realizada com anexina V e iodeto de propídio (PI) -stained células. O tratamento com 30 uM embelin por até 48 horas provocou um forte aumento da taxa de apoptose. As células tratadas com 30 pM embelin durante 12 h e 24 h mostrou um aumento de 15,6 vezes e 17,2 vezes na apoptose em comparação com células não tratadas (Fig 2A). Após 48 h de incubação, um aumento significativo na necrose foi observada nas células tratadas com embelin. O tratamento com embelin também induziu fragmentação do DNA cromossómico de um modo dependente do tempo (Fig 2B). Uma vez que a transição de permeabilidade mitocondrial pode conduzir a apoptose, foi determinado o efeito de embelin no potencial de membrana mitocondrial (Δ

ψ

m). A Fig 2C mostraram que embelin diminuiu fortemente Δ

ψ

m, indicado como a relação de fluorescência vermelho /verde de uma forma dependente do tempo. Estes resultados sugerem que embelin é capaz de induzir a apoptose, alterando a permeabilidade da membrana mitocondrial.

(A) células foram incubadas durante os períodos de tempo indicados com embelin (30 uM), e foram coradas com anexina V-FITC e PI . A apoptose foi medida por citometria de fluxo. As populações de células foram discriminadas em cada quadrante células viáveis ​​no canto inferior esquerdo (anexina V negativo /PI negativo), os primeiros células em apoptose no canto superior esquerdo (anexina V positiva /PI negativo), células final apoptóticos no canto superior direito (anexina V células positivas /PI positivo) e necróticas no quadrante inferior direito (anexina V negativo /PI positivo). (B) Indução da fragmentação de ADN em células PC3 por embelin. As células foram incubadas durante os períodos de tempo indicados com embelin. O ADN cromossómico foi isolado e fragmentação do ADN foi determinada. M, marcador de DNA; P, o paclitaxel (1 uM). (C) depois que as células PC3 foram incubadas com embelin durante períodos de tempo, as células foram marcadas com 2 M de JC-1 durante 30 min e Δ

ψ

m foi determinada por microscopia confocal. A proporção de JC-1 agregada (vermelho) para monômero intensidade (verde) foi calculado com o software Imagem J. Os valores representam a média ± S.D. de três determinações independentes. *, Significativamente diferente da das células de controlo não tratados (

P

0,05).

Para determinar se embelin afecta os níveis de proteínas relacionadas com a apoptose, nas mitocôndrias, nós medimos a quantidade de Bax (pró-apoptótica), Bcl-2, Bcl-xL e Mcl-1 (anti-apoptótica). Como mostrado na Fig 3A e 3B, observou-se que embelin (30 uM) induziu fortemente a translocação da Bax do citossol para a mitocôndria. Os níveis de proteínas da família Bcl-2, anti-apoptóticos tais como Bcl-2, Bcl-XL e Mcl-1 de expressão foram significativamente diminuído por embelin. Ao fim de 24 horas após o tratamento embelin, os níveis de proteína Bcl-2, Bcl-XL e Mcl-1 foram de 15%, 58%, e 28% do nível de controlo, respectivamente. Liberação de citocromo

c

da mitocôndria para o citosol também foi reforçada na presença de embelin (Fig 3C). Ao fim de 24 horas após o tratamento embelin, o citocromo

C

nível foi diminuída para 45% em mitocôndrias, mas no citosol citocromo

C

nível foi aumentado para 1,8 vezes do nível de controlo. análise microscópica confocal mostraram também que embelin aumenta Bax translocação para a mitocôndria e citocromo

C

a libertação para o citosol (Figura 3B e 3D). Nós também descobrimos que embelin induz a translocação do factor de indução de apoptose (AIF) a partir da mitocôndria, através do citosol, e finalmente para o núcleo (Fig 3E). análise microscópica confocal indicaram que o tratamento com embelin aumenta FIA translocação para o núcleo (Fig 3F). Para determinar se embelin induz oligomerização de VDAC para promover mudanças no Δ

ψ

m, e liberação de citocromo

c

e FIA, as células foram tratadas com sulfo-EGS para gerar cruzada que liga entre VDAC, e oligomerização de VDAC foi determinada por Western blotting utilizando um anticorpo anti-VDAC1. Quando as células foram tratadas com embelin (30 uM) durante até 24 h, embelin claramente induzida a expressão e a dimerização de VDAC1 de uma forma dependente do tempo (figura 3G). Estes resultados sugerem que VDAC1 pode ser um mediador de apoptose induzida por embelin e que oligomerização VDAC induzida por embelin poderia determinar a sua capacidade de propagação para o efluxo de proteínas mitocondriais, tais como o citocromo

C

e FIA.

(A), (C), (e) Translocação da proteína pro-apoptótica (Bax), citocromo

C

, FIA, e o nível de proteínas anti-apoptóticas (Bcl-2, Bcl-xL , Mcl-1) foram analisados ​​por transferência de western. As células foram tratadas com embelin para os períodos de tempo indicados. Após a incubação, as células foram colhidas e o citosólica e fracções mitocondriais foram isoladas. proteínas extraídas foram separadas por SDS-PAGE (10%) e análise Western blot foi conduzida. nível GAPDH foi determinada como controles de carga para citosol e lisados ​​totais. COX-4 nível foi determinado como um controlo de carga para as mitocôndrias. nível de histona H1 foi determinada como um controlo de carga para a fracção nuclear. C, fração citosólica, M, fração mitocondrial, N, fração nuclear. Os números entre os blots são as proporções de a intensidade das bandas após normalizada com o controlo. (B), (D), (F) Translocação da Bax (B), citocromo

C

(D), e FIA ​​(M). As células foram cultivadas em lâminas microscópicas e tratou-se com embelin durante 24 h. Após o tratamento, as células foram fixadas, permeabilizadas, e subsequentemente corados com o anticorpo específico. As células foram então coradas com o anticorpo secundário Texas-Red-rotulados. A fluorescência foi determinada utilizando microscopia confocal. G, A expressão de VDAC1 e oligomerização de VDAC1. células tratadas com Embelin foram recolhidas e, em seguida, incubadas com sulfo-EGS (250 uM) durante 25 min a 30 ° C. Depois de as proteínas foram resolvidas por SDS-PAGE (8%), VDAC1 proteínas foram medidas utilizando análise de Western blot. A kDa banda 33 representa monômeros VDAC1 enquanto uma banda a 65 kDa representa o dímero VDAC1. fracção mitocondrial foi isolado e resolvidas por SDS-PAGE (12%) e análise Western blot foi conduzida. COX-4 nível foi determinada como um controle de carregamento para as mitocôndrias.

Inibição por embelin de Akt ativação e β-catenina via

Anteriormente Chen et al. relataram uma nova via que consiste de Akt e da COX-2 para resistência adquirida apoptose em células cancerosas [17]. Porque descobrimos que embelin suprime foram determinados fosforilação de Akt e expressão de COX-2. As células foram tratadas com 30? M embelin durante 6, 12, ou 24 horas e os níveis de fosfo-Akt (Ser 473), Akt total, e COX-2 foram medidos por análise de Western blot. Como mostrado na Fig 4A, a fosforilação de Akt em Ser 473 e a expressão de COX-2 foram significativamente diminuído por embelin, embora os níveis de Akt total não se alterou significativamente. Ao fim de 24 horas após o tratamento embelin, os níveis de fosfo-Akt e COX-2 diminuiu em 99% e 52%, respectivamente, a partir do nível de células de controlo. Concomitantemente, avaliou-se a inibição da activação de Akt em células PC3, a fosforilação de Akt e a viabilidade celular foi diminuída pelo inibidor da Akt IV (0,3 uM) (Figura 4B). Quando as células foram transfectadas com o plasmídeo pece-Myr-Akt para a expressão da Akt constitutivamente activos, diminuição da fosforilação de Akt em Ser 473 (Fig 4C) embelin-mediada. Além disso, verificou-se que a diminuição mediada por embelin na viabilidade das células foi evitada pela expressão Akt com ácido mirístico. Embelin também inibiu a actividade da COX-2 do promotor, tal como determinado pelo ensaio de repórter de luciferase, indicando que embelin pode inibir a expressão de Mcl-1 através do bloqueamento da Akt-COX-Mcl-1 via.

(A) células foram tratadas com embelin 30 mM para os períodos de tempo indicados, e lisados ​​de células inteiras foram preparados, e as proteínas extraídas foram separadas por SDS-PAGE (10%) e análise de mancha de Western utilizando fosfo-Akt, Akt total e anticorpos de COX-2 foi realizado. Os números entre os blots são as proporções de a intensidade das bandas após normalizada com o controlo. (B) As células foram transfectadas com o plasmídeo Myr-Akt e depois tratou-se com 30 uM de embelin durante 24 h. A viabilidade celular foi medida por CCK. Os valores representam a média ± S.D. de três determinações independentes. *, Significativamente diferente da das células de controlo não tratados (

P

0,01) e, ** significativamente diferentes do embelin células tratadas com apenas (

P

0,001). Os lisados ​​celulares totais foram preparados e os níveis de Akt total e fosfo-Akt foram determinados por análise de Western blot. (C) inibidor de AKT IV tratada lisados ​​celulares foram preparados e proteínas extraídas foram separadas por SDS-PAGE (10%) e análise de mancha de Western utilizando fósforo-Akt, Akt total e anticorpos de GAPDH foi realizada. As células foram tratadas com 0,312 uM de inibidor de AKT IV durante 24 h. A viabilidade celular foi medida por CCK. formação de formazano foi quantificada por espectrofotometria a 450 nm. Calculou-se a percentagem de células sobreviventes em cada grupo relativamente ao controlo. (D) As células foram transfectadas com o vector de COX-2 e o vector de luciferase de Renilla luciferase durante 48 h. As células foram submetidas ao ensaio de luciferase dupla. A actividade da luciferase do pirilampo relativa, normalizada pela actividade da luciferase de Renilla, é mostrada. Os valores representam a média ± S.D. de três determinações independentes *, significativamente diferente do controlo não tratado (

P

0,05)..

relatório anterior que sugere β-catenina desempenha um papel crucial em vários sinais de crescimento em células cancerosas humanas da próstata [23]. Para determinar o efeito sobre a expressão de embelin β-catenina, as células PC3 foram tratadas com embelin (30 uM) durante até 24 h e transferência de Western foi realizada. Figura 5A embelin mostrou que é capaz de diminuir o nível de β-catenina de um modo dependente do tempo. Ao fim de 24 horas após o tratamento embelin, o nível de β-catenina foi diminuída em 40% em relação ao nível em células de controlo. Nós determinada atividade TOP flash de luciferase para medir o nível de translocação nuclear β-catenina e ativação da transcrição TCF. Embelin (30 uM) inibiu significativamente a actividade TOPflash para 19% do controlo a 24 h de tratamento (Fig 5B). análise microscópica confocal confirmou também que o tratamento com embelin diminuiu claramente o nível de β-catenina em células PC3 (figura 5C). Transcrição dos genes alvo de β-catenina, tais como ciclina D1, c-myc, ou MMP-7 também foi significativamente suprimida por embelin (Figura 5D). Curiosamente, a transcrição de ARNm de MMP-7 foi quase completamente bloqueada após 12 horas de tratamento com embelin. A análise de transferência de Western mostrou que também diminuiu fortemente embelin ciclina D1, c-Myc, e MMP-7 níveis de proteína (Figura 5D).

lisados ​​de células completas (a) Foram preparadas e proteínas extraídas foram separadas por SDS-PAGE (10%) e análise de mancha de Western utilizando β-catenina, fosfo-β-catenina, ou anticorpos GSK-3 foi conduzido. Os números entre os blots são as proporções de a intensidade das bandas após normalizada com o controlo. (B) ensaio da luciferase. TOPFlash ou células FOPFlash-transfectadas foram tratadas com embelin. A actividade de luciferase foi medida e a actividade da luciferase do pirilampo relativa, normalizada pela actividade da luciferase de Renilla, é mostrada. (C) As células foram semeadas em tampa de deslizamento durante 24 h e tratou-se com 30 uM embelin até 24 h. Em seguida, as células foram coradas com anticorpo β-catenina e a fluorescência foi determinada usando microscopia confocal. (D) Expressão de ciclina D1, c-Myc e MMP-7 foi determinada através da utilização de PCR quantitativa e análise de Western blot. Os valores representam a média ± S.D. de três determinações independentes *,

#,

§, significativamente diferente do controlo não tratado (

P

0,05).. Os números entre as manchas são as relações entre a intensidade das bandas após normalizada com o controle.

Relatório anterior sugeriu que a GSK-3β modula os níveis de β-catenina por fosforilação de β-catenina em Ser 33/37 e Tre 41 [24]. Examinamos se embelin é capaz de aumentar a estabilidade e a actividade GSK-3β. Como mostrado na Fig 6A, verificou-se que embelin impediu fortemente a fosforilação de GSK-3β em Sor 9 por activação de Akt. Embelin induziram fortemente a fosforilação de β-catenina em Ser 33/37 /Thr 41 e pode promover a degradação β-catenina. Colocámos a hipótese de que o aumento mediado por embelin na fosforilação de β-catenina pode ser causada por activação de GSK-3β porque o nível β-catenina diminuiu por tratamento embelin foi quase totalmente recuperado por tratamento com LiCl (20 mM), um inibidor de GSK-3β . LiCl também diminuiu a indução mediada por embelin de fosforilação β-catenina. Como o tratamento com LiCl não recuperou diminuição mediada por embelin na fosforilação por GSK-3β, LiCl pode inibir a actividade de GSK-3β mas não alterar a fosforilação por GSK-3β. Curiosamente, o nível de Mcl-1 foi aumentada de 1,4 vezes por tratamento com LiCl e diminuição do nível de embelin Mcl-1Por foi significativamente recuperado por LiCl (Fig 6A). Estes resultados sugerem que Mcl-1 expressão é modulada pela actividade de GSK-3β. Maurer et ai. relataram que a inibição de GSK-3β através da activação de Akt induzida Mcl-1 expressão [25]. Os nossos dados também confirmou que a activação de GSK-3β por inibição de Akt mediada por embelin suprime Mcl-1. Além disso, a actividade induzida por LiCl TOPFlash 2,5 vezes superior de controlo e embelin inibiu a activação da transcrição TCF causada pelo aumento induzido por LiCl em β-catenina (Fig 6B). análise microscópica confocal mostraram que o tratamento com embelin quase completamente inibida expressão β-catenina (Fig 6C). O tratamento com LiCl recuperado diminuição mediada por embelin na expressão β-catenina. Chen et al.