Sumário

Withaferin A (WA), um importante componente bioactivo da erva indiana

somnifera

, induz a morte celular (apoptose /necrose) em vários tipos de células de tumor, mas o mecanismo molecular subjacente a esta citotoxicidade permanece indefinida. Relatamos aqui que 2 mM WA morte celular induzida por seletivamente nas células PC-3 andrógeno-insensitive e DU-145 de adenocarcinoma da próstata, enquanto que a sua toxicidade foi menos severa em células de adenocarcinoma de próstata LNCaP andrógeno-sensíveis e fibroblastos humanos normais (TIG-1 e KD ). WA também matou as células PC-3 em forma esferóide-formação. A análise do DNA microarray revelou que WA aumentou significativamente os níveis de ARNm de c-fos e 11 proteínas de choque térmico (HSPs) em PC-3 e DU-145, mas não em células LNCaP e TIG-1. análise de Western revelou um aumento da expressão de c-fos e redução da expressão da proteína c-FLIP anti-apoptótica (G). Expressão de HSPs como HSPA6 e Hsp70 foi visivelmente elevado; No entanto, por causa depleção mediada por siARN de HSF-1, um factor de transcrição de HSP-indução, reduziu a viabilidade das células PC-3, é provável que estes genes de choque térmico foram envolvida na protecção contra a morte celular. Além disso a geração, WA induzida de espécies de oxigénio reactivas (ROS) em PC-3 e DU-145, mas não em fibroblastos normais. A imunocitoquímica e microscopia imuno-de electrões revelou que WA interrompido o citoesqueleto vimentina, possivelmente, induzir a produção de ROS, a expressão de c-fos e (G) de supressão de c-FLIP. Estas observações sugerem que vários eventos seguidos de rompimento do citoesqueleto vimentina têm um papel central na morte celular WA mediada

Citation:. Nishikawa Y, Okuzaki D, Fukushima K, Mukai S, Ohno S, Ozaki Y, et ai. (2015) Withaferin A induz a morte celular seletivamente em células cancerosas da próstata andrógeno-independentes, mas não em células normais fibroblastos. PLoS ONE 10 (7): e0134137. doi: 10.1371 /journal.pone.0134137

editor: Hiroyasu Nakano, da Escola de Medicina da Universidade de Toho, JAPÃO

Recebido: 13 de fevereiro de 2015; Aceito: 06 de julho de 2015; Publicação: 31 de julho de 2015

Direitos de autor: © 2015 Nishikawa et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado em parte pelas bolsas-in-aid de Investigação Científica S (No. 15.101.006), Scientific Research B (No. 20370081 e 23370086) e Investigação exploratória (No. 21.651.085) para HN e Investigação científica C (No. 22.570.185) para Nova Iorque a partir do Ministério da Educação, Cultura, Desporto, Ciência e Tecnologia do Japão (https://www.mext.go.jp/Inglês /)

competir interesses:.. os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Withaferin a (WA), um dos principais constituintes bioativos do medicamento Ayurvedic planta

somnifera

, induz a morte celular em muitas células tumorais [1-3]. Especificamente, WA dependente da dose, induz a morte celular por apoptose mediada pela resposta de proteína desdobrada (UPR), que é desencadeada por acumulação de proteínas deformadas no retículo endoplasmático (ER), e também faz com que a apoptose mediada por espécies de oxigénio reactivas (ROS) em células humanas do cancro renal (Caki) [4], [5]. WA exerce efeitos anti-proliferativos potentes por inibição da actividade de chaperonas Hsp90, desse modo, induzir a degradação de proteínas Hsp90 cliente em linhas celulares de cancro pancreático Panc-1, MiaPaCa2, e BxPC3; este efeito é invertido pelo inibidor de proteassoma MG132 [6]. WA suprime a expressão do papilomavírus humano oncogenes E6 /E7, restaura a atividade da via p53, e induz a apoptose em células cervicais CaSki câncer [7]. WA provoca paragem do ciclo celular na fase G2 /M em linhas celulares de cancro da próstata [8], e induz a apoptose em células de melanoma humano por meio da geração de ROS e regulação negativa de Bcl-2 [9].

WA se liga directamente para vimentina covalentemente por modificação de um resíduo de cisteína (Cys328), fazendo com que os filamentos vimentina para agregar e colocalize com F-actina e perturbando assim a vimentina citoesqueleto [10], [11]. vimentina agregação induzida por WA é acompanhada por alterações na forma da célula, diminuição da motilidade, e fosforilação vimentina elevado em Ser38 [12]. Estas observações sugerem que WA poderia ser usada para direccionar células tumorais metastáticas [12], [13]. Embora WA inibe a transição epitelial-mesenquimal (EMT) por suprimir a função vimentina [14], o efeito sobre a vimentina por si só não pode ser responsável por todos os eventos subcelulares WA-mediadas que conduzem à morte celular. Com efeito, WA também se liga β-tubulina, induzindo grave perturbação da morfologia do fuso normal de [15], e também perturba a organização celular de várias outras redes de filamento intermédia (IF), incluindo periferina, proteína de neurofilamento-tripleto, e queratina [12]. Portanto, para compreender totalmente o mecanismo molecular da morte celular induzida por WA, temos de identificar alvos moleculares adicionais de WA.

O factor de transcrição oncogénico c-Fos regula a expressão de genes, em associação com Jun ou outra base leucina proteínas de zíper, como um componente da proteína do activador 1 (AP-1) complexo de dímero. Embora c-Fos exerce funções anti-apoptóticos, relatórios recentes sugerem que também pode promover a apoptose [16], [17]. Activado c-Fos /AP-1 primos células PC-3 e o cancro da próstata LNCaP (PCA) a sofrer apoptose por directamente região de ligação do promotor do gene c-FLIP anti-apoptótica (G), reprimindo assim a sua transcrição [18]. A apoptose também requer a activação do factor de necrose tumoral (TNF) relacionados com o ligando (TRAIL) indutor de apoptose /Apo-2L; este apoptose induzida por TRAIL é praticamente indetectável em células normais [18]

A patogênese de tumores na próstata é inicialmente andrógeno-dependentes.; No entanto, muitos doentes progridem para CaP metastático resistente à castração (independente de androgénios) (mCRPC) [19]. células CaP andrógeno-independente (por exemplo, PC-3 e DU-145) exibem-tronco-como características, enquanto responsivos aos andrógenos células PCA (por exemplo, LNCaP) não [20-22]. Anexina A1, uma proteína de ligação ao fosfolípido e regulador de glucocorticóides induzem [23]. NANOGP8, um retrogene que codifica uma proteína NANOG1 semelhante, também desempenha um papel na regulação de CaP células estaminais do tipo [24]. células lado a população de linhas celulares de CaP e tecidos humanos xenotransplante de sofrer EMT mais completa e são mais agressivos do que as células em massa populacional homólogos [25]. Assim, o EMT parece estar estreitamente associada com o desenvolvimento de mCRPC. Até à data, nenhuma droga foram desenvolvidos que de forma eficaz e potencialmente matar mCRPCs mas não as células normais.

Neste estudo, procurou-se investigar se WA pode matar mCRPCs mas não as células normais, e em caso afirmativo, para identificar o alvo molecular essencial de WA. Descobrimos que WA (2 uM) induziu selectivamente a morte celular em PC-3 e DU-145 independente de células CaP de androgénio, mas não em células CaP responsivos aos andrógenos LNCaP ou TIG-1 fibroblastos normais. DNA microarray e análises western revelou novos alvos moleculares de WA que pode definem as respostas distintas destas linhas celulares para WA. Porque WA matou células PC-3 em culturas de esferóides de formação, propomos que WA pode servir como uma molécula de partida para o desenvolvimento de drogas que induzem a morte celular de cancro de células estaminais (CCC).

Resultados

TIG-1 e LNCaP são menos sensíveis do que a WA PC-3 e DU-145

O primeiro encontrado que WA eficazmente morte celular induzida em PC-3 e DU-145, mas LNCaP foram menos sensíveis WA ao tratamento (Figura 1). Para determinar se os fibroblastos humanos normais (TIG-1) também apresentam resistência alterada para WA, comparou-se a viabilidade da TIG-1 expostas a 2 uM ou 4 uM WA as viabilidades de LNCap, PC-3 e DU-145. Viabilidade de PC-3 e DU-145 diminuiu significativamente 8 h após 4 mM tratamento WA (setas cor de rosa na Fig 1A). Em contraste, a viabilidade da TIG-1 manteve-se elevado, a um nível semelhante ao das células LNCaP, até 8 h após 4 uM tratamento WA, quando mais de metade de PC-3 e DU-145 tinha morrido (setas verdes na Fig 1A ). A viabilidade das células de DU-145 foi maior do que a de PC-3 em 4, 8, e 24 h.

(A, B) A viabilidade celular foi medida a 4, 8, e 24 h após a 2 uM ( a) ou 4 uM (b) tratamento WA. NT, não-tratada. Setas verdes e azuis indicam bares de células sobreviventes, enquanto flechas-de-rosa e vermelho indicam barras para células que morreram sob as mesmas condições. Setas amarelas indicam que as amostras utilizadas para análise de DNA microarray. As barras representam a média ± SEM para três experiências independentes. roxo setas indicam reduções significativas na viabilidade de células (*,

P Art 0,05; **,

P Art 0,01).

Após o tratamento com 2 WA? M, a viabilidade de PC-3 foi reduzida a 4, 8, e 24 h, enquanto DU-145 tornou-se inviável apenas às 24 h (setas vermelhas na Fig 1B). Em contraste, TIG-1 e LNCaP permaneceram viáveis ​​às 24 h (setas azuis na Figura 1B). A incubação destas células para períodos mais longos demonstrado que a TIG-1 permaneceu viável mesmo a 96 horas, ao passo que LNCaP tornou-se inviável a 72 h (S1A e S1C FIG), sugerindo que a 2 uM tratamento WA não induz a morte de TIG-1, mas o morte de LNCaP foi apenas retardado. Outra linha de fibroblasto humano normal (KD) também apresentaram resistência a 2 tratamento? M WA (S1B Fig). Tomados em conjunto, estes resultados sugerem que as células TIG-1 e LNCaP são mais resistentes a WA do que as células PC-3 e DU-145.

-regulação de c-fos após o tratamento WA correlaciona-se com a viabilidade das células

Para identificar genes que foram para cima ou para baixo-regulado nestas linhas celulares, após o tratamento WA, examinámos as transcriptomes de TIG-1, LNCaP, PC-3 e DU-145 usando Agilent SurePrint G3 Microarrays Humanos. Foram examinados os níveis de mRNA de PC-3 e TIG-1 em 4 h e 24 h, respectivamente, após 2 uM tratamento WA, e para LNCaP e DU-145 em 4 h e 8 h, respectivamente, após 4 tratamento uM WA (amarelo setas na Fig 1A e 1B). Fold alterações na expressão de genes foram determinadas por comparação de intensidades de sinal de hibridização entre as amostras tratadas com WA e aqueles tratados com dimetil sulfóxido (dissolvente). S1 Tabela mostra uma lista de genes diferencialmente expressos, dispostos em ordem de mudança vezes em PC-3 descendente; todos os genes listados também foram supra-regulados por mais de quatro vezes na DU-145. Scatterplots indicam que os níveis de mRNA de genes analisados ​​eram suficientemente elevada ( 10). Para permitir comparações fisiologicamente significativas (Fig S2)

Como a sobre-expressão de c-fos induz a apoptose em células de carcinoma colorectal humano [ ,,,0],17], que incidiu sobre os genes c-Fos e FosB, que eram visivelmente-regulada no PC-3 e DU-145, mas foram fracamente regulada para cima no TIG-1 e ainda menos em LNCaP (S1 Tabela;-de-rosa e as setas azul-turquesa em S2 Fig). Em PC-3, estas proteínas foram significativamente sobre-regulada em 4 h após o tratamento 4 uM WA, seguido de um aumento gradual em seguida (Fig 2A). Em DU-145, c-Fos foi visivelmente up-regulada a 4 h, mas sua expressão diminuiu gradualmente depois; Um padrão similar foi observado em TIG-1, embora o sobre-regulação era menos evidente do que no DU-145 (Fig 2A). Em LNCaP, o nível de c-fos foi muito baixo, e era detectável apenas às 24 h. Notavelmente, a ordem de classificação da viabilidade das células (ver Figura 1A) era idêntico ao fim do-Fos c nível de expressão em 8 h após 4 uM tratamento WA (LNCaP TIG-1 DU-145 PC-3 ). Além disso, após o tratamento de 2 uM WA, um padrão semelhante de c-Fos-regulação foi observada em ambos os PC-3 e DU-145; No entanto, muito pouco a expressão de c-Fos foi observada em TIG-1 e células LNCaP (figura 2B); Assim, induzida por WA expressão de c-fos foram correlacionadas com a viabilidade celular. Por outro lado, FosB e FosB2 não foram significativamente regulada para cima, e seus níveis de expressão não se correlacionaram com a viabilidade celular (Fig 2A).

(A, B) Análise de Western blot para detectar c-Fos (FosB) em TIG-1, LNCaP, DU-145, PC-3 e as células em 4, 8, e 24 h após o tratamento com 4 uM (a) ou 2 fiM (B) WA. NT, não-tratada. (C) análise de transferência de Western para detectar c-Fos, PARP, FLIP e GAPDH em células PC-3 a 12 h após 4 tratamento uM WA na presença (+) ou ausência (-) de três siRNAs diferentes (X-Z) de OriGene. (D) Viabilidade de células PC-3 após o tratamento siFos. Os dados estão representados como médias ± SEM de três experiências independentes; setas rosa indicam uma redução estatisticamente significativa no número de células após o tratamento siFos (**,

P Art 0,01). (E) População da apoptose, necrótica, e células vivas distintamente corados com anexina V-EnzoGold, 7-AAD-Vermelho, e GFP. Os dados estão representados como médias ± SEM de três experiências independentes; vermelho, azul, e as setas verdes indicam mudanças estatisticamente significativas (**

P Art 0,01). (F) análise de Western blot de c-Fos, PARP, FLIP, e GAPDH na DU-145, às 12 h após 4 tratamento? M WA na presença (+) ou ausência (-) de siRNAs; siFos ou siGL2 (siControl). (L) Viabilidade de células DU-145, após sobre-expressão exógena de pcDNA3-FLIP ou vector sozinho na presença de DMSO (solvente) ou 4 uM WA.

knockdown mediada por siARN da c-Fos ( siFos) resgata a morte celular no PC-3 [18]. Assim, foi investigado o tipo de morte celular (i.e., apoptose ou necrose) é resgatado por siFos. Para estas experiências, utilizou-se siFos_Z (Fig 2C). Primeiro, confirmou no PC-3 que a viabilidade diminuiu significativamente em 48 h e 72 h após o tratamento WA (Fig 2D). A análise FACS (S3 fig) revelou que a taxa de necrose foi menor em células tratadas com siFos do que nas células tratadas com siGL2 (controlo negativo) 8 h após o tratamento apenas com DMSO ou WA (2 uM ou 4 mM), sugerindo que a sobreexpressão de c-fos induzida por WA desempenha um papel na indução de morte celular necrótica (setas vermelhas na Fig 2E-i). Em contraste, sob as mesmas condições, a viabilidade diminuída (setas azuis na Figura 2E-II) e a percentagem de células em apoptose aumentada (setas verdes na Figura 2E-III e 2E-IV). Assim, a sobreexpressão de c-Fos correlaciona-se com a morte celular induzida por WA em PC-3. Ele permanece elusiva se c-Fos está envolvido na determinação da viabilidade celular ou simplesmente converte o modo de morte celular de apoptose de necrose sem afectar a indução de morte celular. Nós não poderíamos examinar isso em DU-145 porque ambos siGL2 e siFos causou a morte celular em um nível similar.

c-Fos exerce sua função pró-apoptótica em células PC-3 e LNCaP, em parte, ao reprimir a expressão de c- FLIP (L), que nós referimos como a seguir “FLIP” [18]. O nível FLIP foi reduzida após o tratamento WA em todas as células testadas (Fig 2B); a redução de FLIP foi especialmente notável no DU-145, particularmente às 24 h após 2 uM WA tratamento (Figura 2B, faixa 16), relativamente às reduções em TIG-1, LNCaP e PC-3 (Figura 2B, pistas 4 , 8, e 12). Esta observação sugere que a morte celular WA mediada ocorre em parte devido à redução da expressão da FLIP. A análise por Western blot indicou que o nível de aleta não foi reduzida pelo tratamento siFos_Z em PC-3 (Figura 2C, faixa 6), enquanto que o tratamento ou siFos_X siFos_Y reduziu ligeiramente o nível FLIP (Figura 2C, pistas 4 e 5). Em DU-145, o nível FLIP foi igualmente reduzido por tratamento com siControl ou siFos_Z (figura 2F, pistas 3 e 4). Estes resultados sugerem que a modulação do nível de c-Fos está de alguma forma relacionado, mas não afeta diretamente o nível FLIP reduzida. No entanto, a expressão exógena de FLIP em DU-145 resgatou a morte celular induzida por WA (Fig 2G). Tomados em conjunto, estes resultados sugerem que WA causada dois eventos independentes, a saber, um aumento no nível de c-fos e uma redução no nível de aleta, para induzir a morte celular.

A expressão de genes de HSP é sobre-regulada após o tratamento WA

em seguida, percebemos que 11 proteínas de choque térmico (HSP) genes (

HSPA6

,

DNAJA4

,

HMOX1

,

HSPA1B

,

HSPA1L

,

HSPA1A

,

DNAJB1

,

DNAJB4

,

HSPH1

, e

SERPINH1

) estavam entre os 45 genes mais up-regulamentados no PC-3 (S1 Tabela). HSPs são as chaperonas moleculares que estão sujeitos a indução rápida e forte pelo stress. Em PC-3 e DU-145, HSPA6 foi bruscamente sobre-regulada 4 h após o tratamento WA, enquanto que em TIG-1 e LNCaP, o nível de proteína HSPA6 foi muito baixa (Figura 3A). Por outro lado, os níveis de DNAJA4 (Hsp40 a seguir) e HSPA1B (a seguir HSP70) expressão exibiu aumentos graduais semelhantes nessas células (Fig 3A).

(A) análise de Western blot para detectar HSPA6, Hsp40, HSPA70, EGR -1, PAR-4 e GAPDH (controle de carga) em TIG-1, LNCaP, DU-145 e PC-3 células a 0, 4, 8 e 24 h após 4 tratamento? M WA. A seta indica a banda para bona fide EGR-1. (B) Influência de expressão siHSPA6 sobre o crescimento de células PC-3. (I) esquemático para esta experiência. (Ii) análise de transferência de Western para confirmar o knockdown de proteína HSPA6 por siHSPA6, relativamente às células tratadas com siGL2 (controlo negativo). (Iii) Influência de siHSPA6 siGL2 e sobre o crescimento de células PC-3, com ou sem tratamento WA. Seta destaca a redução do crescimento de células PC-3. (C) Influência da siHSF-1 expressão sobre o crescimento de células PC-3. (i) Schematics para esta experiência. (Ii) análise de transferência de Western para confirmar o knockdown de HSP por siHSF-1, relativamente às células tratadas com siGL2 (controlo negativo), e para determinar se HSF-1 knockdown afectado os níveis de proteínas de HSP por detecção de HSPA6, Hsp40, HSPA70, e GAPDH em células PC-3. (Iii) Influência de siHSF-1 e siGL2 sobre o crescimento de células PC-3, com ou sem tratamento WA. Seta destaca a redução do crescimento de células PC-3. Os dados estão representados como médias ± SEM de três experiências independentes; setas cor de rosa, verde e azul indicam reduções significativas na viabilidade de células (*,

P Art 0,05; **,

P Art 0,01).

Para reduzir o nível de proteína HSPA6 em células tratadas com WA, foi realizada knockdown mediada por siRNA em PC-3 (Fig 3B-i). Nós confirmamos knockdown sucesso por transferência Western (Fig 3B-ii). No entanto, observou-se pouca alteração na viabilidade das células em células tratadas com siHSPA6 em relação a células tratadas com um ARN de controlo negativo (siGL2) (setas vermelhas na Fig 3B-III), sugerindo que a sobreexpressão de HSPA6 não é a causa de morte celular após WA tratamento.

a seguir, realizada knockdown mediado por siRNA de proteína de choque térmico fator 1 (HSF1), o principal fator de transcrição envolvido no aumento da regulação dos genes HSF [26], utilizando um delineamento experimental semelhante (Fig 3C-i). análise de Western confirmou que HSF1 knockdown utilizando siHSF1 expressão diminuída de ambos HSF1 e HSPA6 (Fig 3C-II). Em contraste, os níveis de Hsp40 e HSP70 foram alteradas (Figura 3C-II), provavelmente devido aos níveis elevados de linha de base de Hsp40 endógena e HSP70 (ver Figura 3A). No entanto, o tratamento de células PC-3 com siHSF1 aumento da morte celular (verde e azul setas na Fig 3C-III), embora o aumento não foi notável. Estes resultados sugerem que as proteínas desconhecidos regulados positivamente por HSF1 proteger as células PC-3 contra a morte celular.

Quatro da resposta de crescimento precoce (EGR) genes foram classificados entre os 40 principais genes induzidos por WA (S1 Tabela) . Os níveis de EGR-1 e EGR-3 mantiveram-se constantes após o tratamento WA (S3 Fig); portanto, ignorado estas proteínas em análises subsequentes. Contrariamente a um relatório anterior [27], a apoptose próstata resposta-4 (PAR-4) não foi regulada após o tratamento WA, quer ao ARNm (pontas de seta verde em S1 fig) ou o nível de proteína (Fig S3). Por isso, estes genes podem não estar envolvidos na determinação de viabilidade celular (ver Figura 1).

WA induz a resposta ao stress iniciado no RE e mitocôndrias em células de cancro da próstata

WA induz a apoptose mediada por ER estresse em células de carcinoma renal humanos [4] e

células epiteliais Xenopus laevis

A6 renais [28]. análise do gene Ontologia dos dados de microarranjos de DNA (S5 FIG) que utilizam o sistema NextBio confirmou que os conjuntos de genes enriquecidos topo do ranking contido ER genes UPR relacionados ao estresse (ID, GO: 0.006.986; S4 Fig). Para determinar se o stress ER foi induzida em diferentes graus no TIG-1 e PC-3 após o tratamento WA, foi realizada análise de Western a 2, 4, e 8 horas após a 4 uM tratamento WA. Em PC-3, observaram-se indução da expressão de CHOP e a activação de caspase 3 e a clivagem de PARP, o que sugere que a resposta ER tensão através da activação de CHOP é importante (Figura 4). No entanto, knockdown siRNA-mediada de CHOP CHOP sugerem que não desempenha um papel na activação da caspase 3 (Fig S6). Em contraste, fosforilação de Ser51 a eIF2α foi ineficiente, possivelmente devido à activação de fraco PERK; consequentemente, os eventos a jusante como a ativação de caspase 3 e clivagem PARP foram praticamente indetectável no TIG-1 (painéis mais à esquerda na Figura 4). Esta fraca resposta ao stress ER pode explicar porque TIG-1 é resistente ao tratamento WA (ver Figura 1B). Em LNCaP, caspase 3 activação e clivagem de PARP não foram observadas em 8 h; Assim, nesta linha de células de resposta ao estresse ER foi activado a um nível intermédio entre aqueles em TIG-1 e PC-3; a resistência de LNCaP para WA pode ser devido a este atraso em eventos a jusante. No entanto, embora o nível de CHOP foi induzida após tratamento WA em DU-145, pouca activação de caspase 3 e PARP foi observada clivagem (painéis mais à direita na figura 4). Assim, a morte celular por apoptose de DU-145 pode ser devido principalmente ao aumento da expressão de c-fos e a expressão reduzida FLIP, em vez do que a resposta ER tensão (ver Figura 3).

(A) análise de transferência de Western para detectar IRE -1α, Perk, PS51-eIF2α, CHOP, caspase 3, PARP, bip, e GAPDH (controle de carga) em TIG-1, LNCaP, DU-145 e PC-3 células a 4, 8 e 24 h após 4 tratamento uM WA. NT: não-tratada. (B) Representação esquemática das proteínas analisadas na via apoptótica induzida pelo stress ER. (C) imagens de fluorescência típicos de TIG-1 (i), LNCaP (II), PC-3 (iii), e DU-145 (IV) que foram tratados com 4 uM WA durante 24 h e, subsequentemente, tratado com reagentes de detecção ROS usando a imagem-lo ao vivo verde ROS Kit de Detecção. imagens integradas são mostradas de sinais citoplasmáticos ROS (verde) e sinais de ADN nucleares corados com Hoechst33342 (azul). Barra verde, de 100 um. Preto bar, 10 mm.

Ashwagandha

extrato de folha contendo WA faz com que células de câncer de mama para gerar ROS, que é uma resposta ao estresse iniciado na mitocôndria [29]. Nós examinamos se o tratamento com WA também induz a geração de ROS em células de câncer de próstata e fibroblastos normais por um método de sonda fluorescente. Em primeiro lugar, confirmou a detecção de ROS sinaliza quando as células foram tratadas com

terc-butil hidroperóxido

(TBHP), um indutor da geração de ROS. Todas as células testadas mostrou sinais citoplasmáticos (verde) derivadas de produção de ROS (Fig S7A). Após o tratamento com 4 uM WA durante 24 h, apenas um baixo nível de ROS citoplasmática foi detectada em TIG-1 (Figura 4B-i), e KD (S7B figura), que é semelhante à constatação de um relatório anterior que TIG-3 gerar pequenos ROS após o tratamento WA [29]. Por outro lado, os sinais de ROS fortes foram detectados em LNCaP, PC-3, e DU-145 (Fig 4C-II, -fenóis e-IV). Estes resultados sugerem que TIG-1 e KD, ao contrário de LNCaP, PC-3 e DU-145, que não geram ROS após o tratamento WA, o que pode explicar por que TIG-1 e KD são resistentes a WA.

WA induz a autofagia mediada por BAG3 no PC-3 células

WA induz a autofagia em células de câncer de mama, mas o mecanismo detalhado permanece indefinida [30]. Nossos dados de microarranjos de DNA (Tabela S1) indicou que o nível de ARNm de athanogene Bcl-2-3 associada (BAG3), um membro da família de co-chaperonas SACO implicada na autofagia [31], é sobre-regulada após o tratamento WA. Assim, foi investigado se WA autofagia em PC-3 induzida por expressando EGFP-tagged cadeia leve da proteína associada a microtúbulos 3 (LC3), um marcador de autofagia que rotula especificamente membranas autophagosomal [32]. Na verdade, EGFP-LC3 puncta apareceu depois de 2 mM ou 4 mM WA tratamento (Fig 5A) com uma frequência semelhante à que, em células privadas de soro (Fig 5B).

A) Observação de EGFP e EGFP-LC3 sinais por microscopia de imunofluorescência. Bar, a 10 uM. (B) Os gráficos de barras mostrando a percentagem de células contendo ponteada EGFP-LC3; setas mostram que os valores aumentaram gradualmente, sob as condições indicadas. Os dados estão representados como a média ± SEM de três experiências independentes; setas verdes indicam aumentos estatisticamente significativos (**

P Art 0,01). (C) análise de transferência de Western para detectar LC-3 e GAPDH (controlo de carga) em PC-3, sob as condições indicadas. (D) Os gráficos de barras que mostram a viabilidade celular (%), sob as condições indicadas. (E) Análise de transferência de Western para detectar BAG3, LC-3, e GAPDH (controlo de carga) em células PC-3 na presença das condições indicadas de siBAG3 ou siGL2 (controlo negativo). os gráficos (F) de barras que mostra a viabilidade celular (%) nas condições indicadas. (D, F) Os dados estão representados como médias ± SEM de três experiências independentes; setas vermelhas indicam reduções estatisticamente significantes na viabilidade celular (**

P Art 0,01). (A-F) As amostras foram coletadas em 4 h após o tratamento WA. perfis (G) a expressão das proteínas relacionadas com a autofagia BAG3 LC3 e em células PC-3 a 4, 8 e 24 h após o tratamento com 4 uM WA. NT:. Não tratado

Para determinar se a autofagia WA mediada afeta a viabilidade das células, foram adicionados inibidores farmacológicos da classe III fosfatidilinositol 3-quinases, 3-metiladenina (3-MA) ​​ou vortmanina, que suprime autofagia canónico, para as células PC-3, na presença (+) ou ausência (-) de 4 uM de tratamento WA. análise de Western indicou que WA expressão induzida LC3, independentemente da presença de 3-MA ou wortmanina (Figura 5C). Além disso, nem drogas suprimida a redução da viabilidade celular (Fig 5D).

Porque BAG3 ativa autofagia não-canônico provocada por inibidores de proteassoma, tais como MG132 [33], nós investigamos se knockdown mediado por siRNA de BAG3 afetaria PC- 3 a viabilidade celular. siBAG3 suprimida com sucesso expressão BAG3 comparação com siGL2, um controle negativo (painel superior da Figura 5E). Como esperado, a expressão LC3 foi reprimida pela siBAG3 após um ou outro tratamento com DMSO, 2 mM MG132, MG132 20 mM ou 4 mM WA (painel do meio da figura 5E). Além disso, a viabilidade celular foi reduzida por tratamento siBAG3 seguinte WA (Figura 5F), provavelmente devido à inibição da actividade anti-apoptótica de BAG3. Tomados em conjunto, estes resultados sugerem que BAG3 induzida por WA medeia autofagia não-canônico, que protege as células de PC-3 contra a morte celular.

análise de Western blot mostrou que a intensidade da banda de ~ 70 kDa de BAG3 (seta na Fig 5G) foi reduzida em TIG-1 às 24 horas após o tratamento WA (Figura 5G, pista 4), enquanto que o seu nível já era elevada (pistas 9 e 13) e inalterados após tratamento WA em PC-3 (pistas 10-12) e DU-145 (pistas 14-16). Além disso, a ~ 62 kDa banda de BAG3 (a forma processada putativa de BAG3) foi visivelmente aumentada em PC-3 e DU-145 (ponta de seta na Figura 5G); ele permanece indefinida se 62 kDa BAG3 é mais ativo do que 70 kDa BAG3 ou está inativo. Estes resultados indicam que o nível de proteína BAG3 é maior em PC-3 e DU-145 do que em TIG-1 e LNCaP. No entanto, o nível LC3 foi baixa em PC-3 e DU-145 (Fig painéis médio em 5G), sugerindo que um mecanismo de regulação ligando actividade BAG3 e produção LC3-II foi alterada nestas células. Com efeito, um relatório recente mostrou que o DU-145 não pode produzir LC3-II, devido a uma deficiência genética da via autofagia [34]. Por outro lado, a expressão LC3 foi alta em TIG-1 e LNCaP (painéis de média na Fig 5G). Mantém-se a ser analisado se estes resultados sugerem que estas células são de alguma forma protegidas da morte celular induzida por WA semelhante para a protecção de células Caco-2 a partir de morte celular induzida por oxaliplatina [35].

TIG-1 e PC-3 apresentam padrões distintos de localização subcelular vimentina após o tratamento WA

associados WA com vimentina e provoca uma rápida reorganização dos filamentos de vimentina intermediários (VIF) em agregados perinuclear em fibroblastos humanos BJ-5ta [12]. Embora os níveis de mRNA de vimentina foram elevadas e inalterados após tratamento WA em TIG-1, LNCaP, PC-3, DU-145 e (setas pretas na Fig S1), análise de Western indicou que os níveis de proteína vimentina foram elevados após tratamento WA em PC- 3 (Fig 6A). Por outro lado, o nível de vimentina já era elevada antes do tratamento WA, e manteve-se elevada, em DU-145 (Fig 6A). Em TIG-1, o nível de vimentina foi reduzido, com produtos de clivagem de vimentina [10] evidentes às 24 h (setas Fig 6A), ao passo que nenhuma banda vimentina foi detectada em células LNCaP (figura 6A). Estas observações são consistentes com o facto de que PC-3, mas não de LNCaP, foram submetidos a EMT para adquirir expressão de vimentina.

(A) análise de transferência de Western para detectar vimentina e actina em TIG-1, LNCaP, PC- 3, DU-145 e às 4, 8, e 24 h após o tratamento com 2 uM ou 4 uM WA. NT: não-tratada. (B) as imagens típicas de TIG-1 (i) e PC-3 (ii) coradas com anticorpo anti-vimentina, faloidina (para F-actina), e Hoechst 33342 (para o DNA) em 2, 4, e 6 (H ) após o tratamento WA. NT: não-tratada. setas rosa e amarelo indicado vimentina colocalized e agregados F-actina. imagens integradas são mostradas na linha inferior. Bar, a 10 uM. (C) Percentagem de todas as células que contêm observados pontos de vimentina agregadas ou não agregadas são mostrados para TIG-1 (i) e PC-3 (ii). As células que albergam mais de 10 agregados vimentina foram marcados como “agregados”, enquanto que as células com vimentina não agregados foram classificados como “não-agregadas”. Os dados estão representados como médias ± SEM de três experiências independentes; asteriscos indicam alterações estatisticamente significantes na viabilidade celular (**

P Art 0,01; ***,

P Art 0,001). (D) Jasplakinoloide (JSP) não influenciou a viabilidade das células PC-3. (I) esquemática do desenho experimental. (Ii) Os gráficos de barras que mostram a viabilidade celular (%) na presença (+) ou ausência (-) de 4 uM WA ou jasp 8 h após a adição de WA. NT: não-tratada. Os gráficos de barras representam as médias ± SEM de três experiências independentes. Rosa, azul, e as setas verdes indicam reduções estatisticamente significantes na viabilidade celular (*,

P Art 0,05; **,

P Art 0,01).

imunocoloração em 2, 4, e 8 horas após o tratamento 4 uM WA causou agregação vimentina em torno da membrana plasmática em TIG-1 (setas rosa, Fig 6B-i). Em contraste, PC-3 exibiu uma distribuição homogénea de vimentina, sem tais agregados (Fig 6B-6B-I e II); isto sugere que expressa vimentina após o EMT em PC-3 serve uma função diferente do que em células mesenquimais. Notavelmente, o volume citoplasmático de PC-3 foi menor do que a de TIG-1. A percentagem de células que abrigam estes agregados aumentou visivelmente nos TIG-1 (Fig 6C-i) em relação ao PC-3 (Fig 6C-II).

A microscopia revelou sinais de Imuno-vimentina de electrões em FI no citoplasma em na ausência de tratamento WA (Fig S8A), confirmando a origem mesenquimal de TIG-1. Notavelmente, muitos sinais de vimentina deslocado para a região periférica do citoplasma perto da membrana do plasma, com um padrão que reflectia a presença dos agregados vimentina acima mencionados (ver Fig 6B-i), após 4 h de 4 uM tratamento WA (S8B figura) . Em contraste, apenas sinais esparsos vimentina foram observadas em PC-3 na ausência de tratamento WA (Fig S8C);