Abstract

A presença de câncer de células estaminais-like (CSCs) é um dos os mecanismos responsáveis ​​pela chemoresistance que tem sido um grande obstáculo para o tratamento adenocarcinoma de pulmão (LAD). Recentemente, foram identificados microARN -200b (MIR) como um regulador chave da quimiorresistência em células LAD docetaxel resistente humanos. No entanto, se o miR-200b tem efeitos sobre a regulação CSCs permanece em grande parte pouco clara e deve ser ainda elucidado. Aqui, mostramos que o miR-200B foi significativamente regulada negativamente em CD133

+ /CD326

+ células que exibiram propriedades de CSCs derivadas de células LAD docetaxel-resistente. Além disso, restauração de miR-200b pode inibir a manutenção e chemoresistance de CSCs reversa. Além disso, supressor de zeste-12 (Suz-12) foi identificada como um alvo directo e funcional de miR-200b, e silenciamento de Suz-12 phenocopied os efeitos de miR-200b sobre CSCs. Além disso, a sobre-expressão da desacetilase de histona (HDAC) 1 foi identificado como um mecanismo crucial responsável pela repressão miR-200b em CSCs através de uma proteína de especificidade (Sp) mecanismo 1-dependente, e restauração de miR-200b pela repressão HDAC1 suprimiu significativamente a formação de CSCs e chemoresistance de CSCs revertida através da regulação de sinalização Suz-12-E-caderina. Além disso, a regulação negativa de HDAC1 ou regulação positiva de miR-200b reduziu o

in vivo

tumorigenicidade de CSCs. Finalmente, Suz-12 foi correlacionada inversamente com o miR-200b, positivamente correlacionada com HDAC1 e supra-regulados em tecidos LAD docetaxel resistente em comparação com os tecidos sensíveis ao docetaxel. Tomados em conjunto, o HDAC1 /miR-200b /sinalização de Suz-12-E-caderina pode explicar a manutenção da CSCs e formação de fenótipo resistente à quimioterapia em células LAD docetaxel resistente

Citation:. Chen DQ, Huang JY, Feng B, Pan BZ, De W, Wang R, et al. (2014) histona deacetilase 1 /Sp1 /microRNA-200b Contas de sinalização para Manutenção de Células-Tronco-como câncer no pulmão humano Adenocarcinoma. PLoS ONE 9 (10): e109578. doi: 10.1371 /journal.pone.0109578

editor: Jin Q. Cheng, H.Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, Estados Unidos da América

Recebido: 17 de junho de 2014; Aceito: 01 de setembro de 2014; Publicação: 03 de outubro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Chen et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pela National Science Foundation Natural da China (https://www.nsfc.gov.cn/) (LBC Não . 81272474, BF No. 81.301.914). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de pulmão para a maior mortalidade relacionada ao câncer em homens e mulheres em todo o mundo [1]. A quimioterapia é um componente importante das terapias de primeira linha de adenocarcinoma de pulmão (LAD) que constitui a forma mais comum histológico de cancro do pulmão. No entanto, chemoresistance representa um obstáculo predominante para o tratamento quimioterápico de LAD, o que leva a um pior prognóstico dos pacientes. Assim, explorando os possíveis mecanismos moleculares envolvidos na chemoresistance tornou-se uma questão-chave no tratamento clínico da LAD humano.

Cancro células-tronco-like (CSCs) ou células-tronco que iniciam tumorais são uma sub-população de células tumorais e desempenham papéis fundamentais na iniciação do câncer, progressão, recorrência e chemoresistance [2] – [5]. CSCs, derivado de ambas as CSCs e não-CSCs, dar origem a tumores através de auto-renovação e são capazes de se diferenciar em vários tipos de células [6] – [9]. Muitas terapias contra o câncer, incluindo quimioterapia que matam o grosso das células cancerosas, pode vir a falhar como eles não eliminam CSCs que, em seguida, causar uma recaída de tumores [10]. Recentemente, tem sido bem estabelecida que os CSCs estão ligados para epitelial-mesenquimal transição (EMT), metástase, resistência a drogas, a progressão e recidiva do cancro do pulmão [11] – [15]. Como resultado, a exploração das terapias específicas destinadas a CSCs tem sido uma questão crucial no tratamento quimioterápico do câncer de pulmão. MicroRNAs (miARNs) a expressão do gene silêncio por ligação à região 3 ‘não traduzida dos genes alvo e têm sido relatados para regular CSCs auto-renovação, a tumorigenicidade, metástase, e quimiorresistência em muitos cancros humanos [2], [7], [ ,,,0],16]. Por exemplo, miR-34a repressão provoca CSCs do cólon para realizar a divisão celular assimétrica e promove células filhas permanecer CSCs do cólon através da regulação de sinalização Notch. Regulada positivamente de miR-143 em diferenciação CSCs promove células cancerosas da próstata metástase por modulação da expressão FNDC3B. MiR-21 regula EMT fenótipo e expressão do fator-1α hipoxia-inducible na terceira esfera formando células semelhantes a células-tronco do câncer de mama. MiR-200b, um elemento importante do miR-200 famílias, está localizado no agrupamento /C /gene 429 miR-200b, actua como um supressor de tumor numa variedade de tumores sólidos humanos e tem a capacidade de inibir o crescimento CSCs e invertendo o EMT fenótipo de CSCs [17], [18]. Recentemente, nós identificamos miR-200b como um regulador chave da chemoresistance e restauração de miR-200b inverte significativamente chemoresistance de docetaxel (DTX) células LAD resistentes ao induzindo parada do ciclo celular e valorização apoptose [19]. No entanto, se o miR-200b regula CSCs derivadas de células LAD docetaxel resistente é ainda mal compreendida e precisa ser mais bem investigado.

Neste estudo, mostramos primeiro funções que miR-200b como um supressor tumoral ambos

in vitro Comprar e no

vivo

em CSCs que se originam a partir de células LAD docetaxel resistente humanos. Além disso, identificamos HDAC1 como um regulador específico envolvido no silenciamento de miR-200b através de um mecanismo dependente do SP1 e restauração de miR-200b mediada pela repressão HDAC1 suprime significativamente manutenção de CSCs e inverte chemoresistance de CSCs regulando Suz-12-E sinalização -cadherin. Para o melhor do nosso conhecimento, não houve relatos de rede reguladora HDAC1 /miR-200b /Suz-12 /E-caderina na regulação CSCs manutenção e chemoresistance em células LAD humanos e os trabalhos em curso irá proporcionar uma nova estratégia para reverter chemoresistance de LAD humana

Materiais e Métodos

ética declaração

Este estudo foi aprovado pelo comitê de ética em pesquisa da Jinling Hospital da Universidade de Nanjing (número de autorização: 12-027). e foi realizado em conformidade com a Declaração de Helsinki. Todos os animais foram alojados em condições específicas livres de patógenos. Todos os procedimentos experimentais foram realizados de acordo com o Hospital Jinling do Guia Universidade de Nanjing para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório.

MicroBeads triagem

Resumidamente, 3,0 × 10

7 células individuais foram passados ​​através de malha de nylon de 30 ^ m e centrifugado a 300 x g durante 10 minutos. O sobrenadante foi depois aspirado. Em seguida, foram adicionados 300 ul de tampão e 100 ul de reagente de FcR e misturou-se. 100 Microbeads CD326 ul foram adicionados, bem misturados e incubados durante 30 minutos no refrigerador (2-8 ° C). As células foram então lavadas pela adição de 2 mL de tampão e centrifugado a 300 x g durante 10 minutos. O sobrenadante foi depois aspirado. As células foram ressuspensas com 500 ul de tampão. Em seguida, a suspensão de células foi aplicada na coluna de separação colocado no campo magnético. O efluente contendo células não marcadas foi recolhido. Em seguida, a coluna foi lavada e retirada do separador e colocado em um tubo de recolha adequado. Em seguida, a quantidade apropriada de tampão foi pipetada para a coluna e o fluxo através contendo células CD326 foi recolhido. No passado, o número apropriado de CD326

+ células foi então classificada com CD133 Microbeads para o enriquecimento de CD133

+ /CD326

+ células, como descrito acima. O CD133

+ /CD326

+ CSCs foram então cultivadas em meio CSCs-cultura livre de soro: Meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), meio /F12 contendo 0,4% de BSA, 2% B27, 4 mg /ml de insulina e 40 ng /ml de EGF.

células e condições de cultura

o LAD humano linhas celulares (SPC-A1 e H1299) foram adquiridos a partir do Tumor Cell Bank da Academia chinesa de Ciências Médicas (Shanghai, China). As células LAD docetaxel resistente foram preparadas como descrito no nosso trabalho anterior e preservados em 50.0μg /L docetaxel [19]. As células foram cultivadas tal como descrito no nosso trabalho anterior [20]. O CD133

+ /CD326

+ células foram classificadas a partir das células LAD docetaxel resistente por CD133 e CD326 MicroBeads (Miltenyi Biotec) de acordo com as instruções do fabricante.

As amostras dos pacientes

o presente trabalho foi aprovado pelo Comitê de Ética do nosso hospital e consentimento informado por escrito foi obtido de todos os pacientes. tecidos LAD foram recolhidas a partir de pacientes com LAD em estágio avançado em nosso hospital entre setembro de 2006 a dezembro de 2008. Os pacientes preencheram todos os seguintes critérios: diagnóstico histológico de LAD primária com pelo menos uma lesão mensurável; estágio clínico IIIB-IV; quimioterapia de primeira linha, quer com docetaxel 75 mg /m

2 e cisplatina 100 mg /m

2 ou docetaxel 75 mg /m

2 e a área de carboplatina sob a curva de 6 mg /ml /min, administrada em três semanas para um máximo de 5 ciclos. As amostras de tecido foram então divididos em (resposta completa ou parcial) “sensíveis” e “insensíveis” (doença estável ou progressiva) grupos baseando-se nas respostas dos pacientes avaliadas por análise de imagem médica e a detecção de marcadores tumorais no soro após 4 ou 5 ciclos de docetaxel- quimioterapia baseada.

plasmídeos e transfecções de células

estudos recentes têm relatado que o miR-200b tem dois promotores funcionais, localizado ~ 4 kb e ~ 2 kb a montante do 5′-stemloop, respectivamente [ ,,,0],21]. Chr1 Em seguida, as duas regiões do núcleo, localizadas: 1087797-1088137 (341 pb) e Chr1: 1089316-1090354 (1039 pb), respectivamente (navegador UCSC Genome, Março 2006) foram amplificados por PCR e clonado no vector pGL3-basic (Promega ) com os locais KpnI e HindIII, nomeados (pGL3) promotor-1 e promotor-2. Além disso, múltiplos locais de ligação SP1 foram observados em ambas as regiões do núcleo. E, os sítios Sp1 de ligação localizados Chr1: 1.087.926-1.087.932, Chr1: 1088073-1088079 e Chr1: 1.089.779-1.089.785, respectivamente. Em seguida, os vectores repórter mutantes de ligação SP1-dirigidos ao sítio foram construídas por mutação por PCR. repórter luciferase contendo tipo selvagem 3′-UTR de Suz-12 (pLUC /Suz-12 /3′-UTR-WT) em que os nucleótidos da Suz-12-3′-UTR complementares a miR-200b foram inseridos no pLUC vector, e que também gerado um mutante repórter (pLUC /Suz-12 /3′-UTR-mut), em que os primeiros seis nucleótidos nos locais complementares região de semente de miR-200b foram mutados. Todas as sequências iniciadoras foram listados na Tabela S1. plasmídeo de expressão de miR-200b (pcDNA /miR-200b), a simulação de controle pcDNA-negativo (pcDNA /miR-NC), miR-200b inibidor (Anti-miR-200b) e controle de miRNA inespecífica (Anti-miR-NC) foram usado como descrito a nossa anterior [18]. vetores HDAC1-shRNA (ou Control-shRNA), o SP1-shRNA (ou Control-shRNA) foram obtidos a partir GenePharma. Suz-12 plasmídeo de expressão (pcDNA /Suz-12) foi construído por subclonagem de Suz-12 no vector pcDNA 3.0 (Invitrogen) por PCR com os iniciadores listados na Tabela S2. Todos os vectores foram confirmados por sequenciação de ADN. As células foram transfectadas com Lipofectamine 2000 (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante.

citometria de fluxo e CD133

+ /CD326

+ células

citometria de fluxo e CD133

+ /CD326

+ células foi realizada com anticorpos CD326-FITC CD133-PE e (Miltenyi Biotec), de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, aproximadamente 1,0 x 10

6 células foram centrifugadas a 300 x g durante 10 minutos. O sobrenadante foi em seguida descartado. As células foram ressuspensas com 80 ul de tampão. 20 ul de reagente bloqueador de FcR em seguida, foi adicionado na memória intermédia. 10 ul do anticorpo CD133 /CD326 foi adicionado, misturou-se bem e incubou-se durante 10 minutos no escuro no refrigerador (2-8 ° C). Em seguida, as células foram lavadas por adição de 1-2 ml de tampão e centrifuga-se a 300 x g durante 10 minutos. O sobrenadante foi depois aspirado. Por fim, as células foram ressuspensas em 400 ul de tampão para análise por citometria de fluxo.

Mammosphere ensaio de formação de

Mammosphere ensaio de formação foi realizado para avaliar a capacidade de auto-renovação CSC. ensaio de formação de Mammosphere foi realizada por plaqueamento de suspensões de célula única (1000 células /poço) em placas aderentes ultra-baixas de 6 poços. Em seguida, as células foram cultivadas em meio CSCs-cultura isento de soro e suplementado com o meio a cada 3 dias. Após 7 dias de incubação, as placas foram analisadas para a medição de números mammosphere.

ensaio de transferência de Western

os anticorpos primários contra a E-caderina, Sox-2 e Oct-4 (Abcam, Hong Kong ), Bmi-1, HDAC1, Suz-12 (Cell Signaling Technologies) e GAPDH (Santa Cruz Biotechnology) foram utilizados neste estudo. GAPDH foi usada como um controlo interno. lisado de proteína total foi separada por 10% de dodecil sulfato de sódio a electroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE). As proteínas foram então transferidas para fluoreto de polivinilideno (PVDF) membranas (Millipore). Em seguida, foi realizado imunotransferência e visualizadas com um kit de quimioluminescência (Thermo Scientific).

em tempo real quantitativa de reacção de transcrição reversa em cadeia da polimerase (qRT-PCR)

O ARN total foi extraído com TRIzol reagente (Takara). A transcrição reversa foi realizada com kit de reagentes PrimeScript RT (Takara) baseando-se as instruções do fabricante. qRT-PCR foi realizada com SYBR PrimeScript RT-PCR Kit (Takara) de acordo com as instruções do fabricante. Os níveis de miR-200b ou ARNm foram calculados com o 2

– Ct △△ método utilizando U6 ARNr ou ARNm de GAPDH como os genes de referência. Os níveis de expressão foram medidos em relação à mudança de dobragem das células de controlo que foi definido como 1.0. Todas as experiências foram realizadas em triplicado. Todos os pares de iniciadores foram listados na Tabela S3.

sensibilidade ao fármaco e a viabilidade celular ensaio

sensibilidade ao fármaco e ensaio de viabilidade celular foi medida com o ensaio Kit-8 de contagem celular (CCK-8) ( Dojindo) de acordo com as instruções do fabricante. Para o ensaio de sensibilidade a drogas, 3 × 10

3 células foram semeadas em placas de 96 poços de 24 horas após a transfecção. Após a fixação, o docetaxel preparada de fresco foi então adicionada a concentração final diferente. 48 horas mais tarde, 10 ul de CCQ-8 foi adicionada e incubada durante 4 horas a 37 ° C. A absorvência foi então medida a 450 nm. Para o ensaio de viabilidade celular, 2,0 × 10

3 células foram semeadas em placas de 96 cavidades 24 horas após a transfecção com os vectores indicados. 12, 24 ou 48 horas mais tarde, 10 ul de CCQ-8 foi adicionada e incubada durante 4 horas a 37 ° C. A absorvência foi então medida a 450 nm. Todos experiência foram realizadas em triplicado e repetidos pelo menos três vezes.

repórter luciferase ensaio

Aproximadamente 2,0 x 10

3 /poço CSCs foram semeadas em placas de 96 poços e, em seguida, co-transfectado com os plasmídeos repórter da luciferase específicas, o miR-NC ou o miR-200b. Renila-TK plasmídeo (Promega) foi co-transfectado em todas as amostras. 48 horas após a transfecção, as actividades da luciferase foram medidas com kits de Dual-Luciferase Reporter Assay (Promega). As actividades da luciferase foram normalizados por actividades de luciferase de Renilla. Os dados foram em relação à mudança de dobragem dos grupos de controlo correspondentes que foi definida como 1,0. Todas as experiências foram realizadas em triplicado.

Co-imunoprecipitação de ensaio

O ensaio de co-imunoprecipitação foi realizada utilizando kits de Co-imunoprecipitação (Thermo científica Pierce) baseando com as instruções do fabricante. Resumidamente, 75μg de anticorpos purificados por afinidade (SP1, HDAC1, Cell Signaling Technologies) foram acoplados para as colunas de centrifugação. O lisado celular foi, em seguida, preparada e pré-limpo com as resinas de controlo de agarose. Subsequentemente, o lisado celular foi co-imunoprecipitada e eluída. Finalmente, as amostras foram medidos por ensaio de transferência de Western.

imunoprecipitação da cromatina (ChIP) ensaio

ensaio chip foi realizada com imunoprecipitação Kits de Ensaio (Millipore) de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, as células foram reticulado com 1% de formaldeído, durante 10 min a 37 ° C. As células foram então ressuspensas em 200 ul de tampão de lise e incubados durante 10 minutos em gelo. O lisado foi cortado em comprimentos entre 200 e 1000 pares de bases por sonicação. O sobrenadante foi pré-limpo com um ADN de esperma de salmão /Proteína A agarose-50% de pasta. O sobrenadante recuperado foi incubada com Suz-12 anticorpo imunoprecipitação (Abcam), Histona H3 trimetil-lisina 27 (H3-trimetil-K27) anticorpo imunoprecipitação (Millipore), Acetil-Histona H3 (Lys9) (Millipore), ou um isotipo de controlo IgG durante a noite a 4 ° C com rotação. Em seguida, o complexo anticorpo /ADN foi recolhido utilizando ADN de esperma de salmão /proteína A agarose de lodo durante uma hora a 4 ° C com rotação. O complexo foi eluída por tampão de eluição. Então, as ligações reticuladas foram invertidos com aquecimento 5 M de NaCl a 65 ° C durante 4 horas. As amostras de DNA foram então purificados e medido por qRT-PCR. Os iniciadores foram listadas na Tabela S4.

Xenoenxerto transplante

BALB /c atímicos camundongos nus (Masculino, SPF, 4-6 semanas) foram fornecidos pelo departamento do centro de experiência com animais do nosso hospital . E o estudo in vivo foi eticamente aprovada e realizada de acordo com as orientações institucionais. Para realizar a tumorigenicidade em ratinhos nus, a partir de células CCC /DTX SPC-A1 estavelmente transfectadas com o miR-200b, miR-CN, SH-2 de controlo ou vectores SH-HDAC1 # foram injectados por via subcutânea no flanco direito de ratinhos nus. Os tumores foram colhidos, enquanto eles eram palpáveis. Para investigar o efeito de miR-200b expressão ou HDAC1 repressão em

in vivo

regulação das células LAD, 3,0 × 10

6 H1299 /células DTX estavelmente transfectadas com sh-controle, sh-HDAC1, miR- NC ou vectores de miR-200b, foram transplantadas subcutaneamente para o lado direito do flanco posterior de ratinhos nus. Os volumes dos tumores foram medidos como descrito anterior [19]. Embora a dimensão média do tumor atingiu cerca de 50 mm

3, numa concentração de 1,0 mg /kg de docetaxel (DTX), uma dose em dias alternados, com três doses no total, foi administrado através de injecção intraperitoneal [19]. Após 5 semanas, todos os ratos foram sacrificados e tecidos tumorais foram utilizados para os estudos posteriores.

A análise estatística

Toda a análise estatística foi realizada SPSS versão do programa 17.0 (SPSS Inc., Chicago, IL , EUA). Os dados são apresentados como média ± erro padrão da média, e as barras de erro são representativos de pelo menos três experiências independentes. Os valores médios dos dois grupos foram comparados pelo

t

teste de Student. As diferenças entre vários grupos foram analisados ​​por one-way análise de variância. Todos

P

valores 0,05 foram considerados estatisticamente significativos propriedades

Resultados

CD133

+ /CD326

+ células exposição de CSCs

para melhor compreender os mecanismos subjacentes responsáveis ​​por chemoresistance da DAE, CD133

+ /CD326

+ células foram classificadas a partir das células LAD docetaxel resistente por CD133 e CD326 MicroBeads. A pureza do CD133

+ /CD326

+ células classificadas de SPC-A1 /DTX e H1299 /DTX foi 93,13% ± 4,06% e 92,74% ± 3,12%, respectivamente, eo CD133

+ /CD326

+ células podem se diferenciar para as células LAD docetaxel resistente, enquanto sob condição de diferenciação (Figura 1A

1, a

2 e a

3). Em seguida, determinou-se o CD133

+ /CD326

+ células propriedades de CSCs exibido. Em primeiro lugar, analisamos a capacidade de formação mammosphere do CD133

+ /CD326

+ células, e os dados mostraram que o número de mammosphere em CD133

+ /CD326

+ células foi significativamente mais do que isso nas células LAD docetaxel resistentes correspondentes (Figura 1B). Além disso, o CD133

+ /CD326

+ células expressaram níveis mais elevados de expressão de marcadores de células estaminais (tais como Sox-2, Oct-4, Suz-12, e IMC-1) do que o LAD docetaxel resistentes correspondentes células (Figura 1C, 1D

1 e D

2). Em segundo lugar, analisamos a capacidade tumorigénica do CD133

+ /CD326

+ células, e em seguida, sobre 1,000~100,000 CD133

+ /CD326

+ células ou as células LAD docetaxel resistente correspondentes foram subcutaneamente inoculadas em pequenos ratos nús. 1000 CD133

+ /CD326

+ células foram suficientes para formar tumores em todos os ratinhos nus, no entanto, até 1,0 × 10

5 células LAD docetaxel resistente foi incapaz de formar com sucesso tumores em cada nu ratinhos, o que indica que a CD133

+ /CD326

+ células possuíam maior capacidade de tumorigenicidade do que as células LAD docetaxel resistente parentais (Figura 1E). Portanto, as células CD133

+ /CD326

+ subpopulação exibido propriedades de CSCs.

(A

1, A

2, A

3) Percentagem de CD133

+ /CD326

+ CSCs como analisadas por citometria de fluxo na hora indicada depois de cultivar CD133

+ /CD326

+ CSCs (adquirida pela triagem SPC-A1 /DTX e as células H1299 /DTX, respectivamente) sob condições de diferenciação. (B) formar Mammosphere capacidade de as células indicadas (1000 células) após 7 dias sob condições de CSC-cultivo. detecção (C) qRT-PCR de ARNm de níveis relativos dos marcadores relacionados-CSC nas células indicados. Os dados foram calculados com o 2

– Ct △△ método utilizando GAPDH ARN como o gene de referência. O nível de expressão foi medido em relação à mudança de dobragem dos grupos de células parentais que foram definidos como 1,0. (D

1, D

2) Os níveis de proteína dos marcadores relacionados com a CSC nas células indicadas. GAPDH foi usada como um controlo interno. (E) a incidência de tumores em ratinhos nu que foram injectados por via subcutânea com as células indicadas. Os dados foram apresentados como a média ± DP de pelo menos três experiências independentes. *

p Art 0,05, **

p

. 0,01

miR-200b inibe a formação de CSCs e inverte chemoresistance de CSCs

Anteriormente, mostrámos que a regulação positiva de miR-200b pode inverter quimiorresistência de células LAD docetaxel-resistentes por inibição do crescimento celular, induzir a paragem do ciclo celular e intensificar a apoptose. Em seguida, foi realizado ensaio de qRT-PCR para detectar a expressão de miR-200b em CSCs e as células LAD docetaxel resistentes correspondentes, e mostraram que o nível relativo de miR-200b em CSCs foi menor do que nas células LAD docetaxel resistente (Figura 2A). Para investigar se tem efeito miR-200b em CSCs nas células LAD docetaxel-resistentes, pcDNA /miR-200b (ou pcDNA /miR-NC) ou anti-miR-200b (ou anti-miR-NC) foi estavelmente ou transientemente transfectado em SPC-A1 /DTX ou H1299 /células DTX. Tal como mostrado na Figura 2B, o nível relativo de expressão de miR-200B foi significativamente regulada positivamente em células LAD docetaxel resistentes estavelmente transfectadas com pcDNA /miR-200b, enquanto o seu nível de expressão relativa foi significativamente regulada negativamente nessas células transitoriamente transfectadas com anti-miR- 200b. A citometria de fluxo ensaio mostrou que a regulação positiva de miR-200b diminuiu significativamente a percentagem de CD133

+ /CD326

+ crescimento CSCs nas células LAD docetaxel-resistentes e a regulação negativa do miR-200B teve o efeito oposto (Figura 2C). O fenómeno semelhante foi observado no ensaio de capacidade de formação, bem mammosphere (Figura 2D). Enquanto isso, a restauração de miR-200b pode levar à diminuição da CI

50 valor do DTX em CSCs de SPC-A1 /DTX ou células H1299 /DTX (Figura 2E). Estes resultados indicaram que o miR-200b pode desempenhar um papel fundamental no crescimento e CSCs quimiorresistência de LAD humano.

(A) de detecção de qRT-PCR de miR-200b em CSCs. Os dados foram normalizados para U6 rRNA e determinado em relação aos grupos celulares parentais correspondentes. (B) Detecção de qRT-PCR de ARNm de nível relativo de miR-200b em células LAD docetaxel-resistentes após transfecção com os vectores indicados. Os dados foram normalizados para U6 rRNA e determinado em relação aos grupos de controlo correspondentes. (C) Percentagem de CD133

+ /CD326

+ CSCs como analisado por citometria de fluxo após a transfecção com os vectores indicados. (D) Mammosphere formando capacidade de as células indicadas (1000 células) após a transfecção dos vectores indicados. (E) A viabilidade celular foi medida pela Cell Counting Kit-8 ensaio (CCK-8). Os dados foram apresentados como a média ± DP de pelo menos três experiências independentes. *

p Art 0,05, **

p

. 0,01

Suz-12 é regulada nos CSCs e identificado como um alvo funcional do miR- 200b

Suz-12 é um componente do complexo repressor Polycomb 2 (PRC2) e é essencial para o silenciamento de genes mediado por PRC2 gerando trimethylation na lisina 27 resíduo de histona H3 (H3K27Me3). Em CSCs gerados a partir de células epiteliais da mama transformadas (MCF-10A), Suz-12 foi confirmado como um gene alvo de miR-200b. No entanto, se o miR-200b pode ter como alvo Suz-12 nos CSCs derivadas das células LAD docetaxel-resistente não é clara. qRT-PCR e ensaios de transferência Western indicou que Suz-12 foi regulado para cima CSCs em comparação com as correspondentes células LAD docetaxel resistente tanto a nível da transcrição e tradução (Figura 3A e B). Em seguida, analisamos os efeitos de miR-200b na expressão de Suz-12 em CSCs. A sobre-regulação de miR-200b levou à diminuição da expressão de Suz-12 em CSCs de SPC-A1 /DTX e células H1299 /DTX, enquanto o silenciamento de miR-200b levou ao aumento da expressão de Suz-12 nessas CSCs (Figura 3C e D). Para obter mais uma prova directa de que Suz-12 foi alvo de miR-200b, nós investigamos o local de ligação de miR-200b na sequência 3′-UTR de Suz-12 ARNm. Construiu-se um repórter de luciferase (pLUC /Suz-12 /3′-UTR-WT) em que os nucleótidos da Suz-12-3′-UTR complementares a miR-200b foram inseridos no vector de pLUC, e também gerado um repórter mutante (pLUC /Suz-12 /3′-UTR-mut), em que os primeiros seis nucleótidos nos locais complementares região de semente de miR-200b foram mutados. A actividade da luciferase na pLUC /Suz-12 /3′-UTR-WT-transfectadas células co-transfectadas com pcDNA /miR-200B foi significativamente reduzida do que nas células pLUC /Suz-12 /3′-UTR-MUT-transfectadas co-transfectadas com pcDNA /miR-200b (Figura 3E). Estes resultados sugeriram que Suz-12 pode ser um alvo directo de miR-200b nos CSCs derivadas das células LAD docetaxel-resistente.

(A) de detecção de qRT-PCR da expressão de ARNm relativa Suz-12 no células indicados. Os dados foram normalizados para GAPDH ARN e determinado em relação aos grupos de células parentais correspondentes. (B) Os níveis de proteína de Suz-12, tal como medidos por transferência de Western em que as células indicados. GAPDH foi usada como um controlo interno. (C) qRT-PCR detecção de Suz-12 de expressão de mRNA em CSCs após a transfecção dos vectores indicados. (D) de detecção de Western blot da expressão da proteína de Suz-12 em CSCs após a transfecção com os vectores indicados. GAPDH foi usada como um controlo interno. (E) A actividade de luciferase do CSCs (SPC-A1 /DTX) co-transfectadas com pcDNA /miR-200b (ou pcDNA /miR-NC) ou pLUC /Suz-12 /3′-UTR-WT (ou pLUC /Suz -12 /3′-UTR-mut). Os dados foram ± DP médio de pelo menos três experiências independentes. *

p Art 0,05, **

p

. 0,01

Para determinar ainda se Suz-12 foi envolvido na regulação da CSCs, Suz- 12-shRNAs (Suz-12-shRNA # 1, # 2 ou # 3) foram concebidos e transfectado para células LAD docetaxel-resistente e o efeito inibidor de Suz-12-shRNA3 foi maior (Figura 4A). Silenciamento de Suz-12 pode reduzir significativamente a capacidade de formação mammosphere de SPC-A1 /DTX e as células H1299 /DTX (Figura 4B). Além disso, a percentagem de CD133

+ /CD326

+ crescimento CSCs em Suz-12-shRNA3-transfectadas SPC-A1 /DTX ou células /DTX H1299 foi significativamente reduzida do que nas células de controlo-shRNA-transfectadas ( A Figura 4C). Em seguida, analisamos ainda mais os efeitos de expressão Suz-12 sobre a tumorigenicidade e quimio-sensibilidade dos CSCs. Em primeiro lugar, foi detectada a expressão da proteína de Suz-12 em CSCs de Suz-12-shRNA3 ou controle-shRNA-transfectadas SPC-A1 /DTX e células /DTX H1299, e mostraram que o nível de expressão da proteína de Suz-12 em Suz- 12-shRNA3-transfectadas células foi significativamente menor do que nas células de controlo-shRNA-transfectadas (Figura 4D). Análise funcional indicou que silenciamento de Suz-12 poderia significativamente inibir a

in vitro

crescimento e

in vivo

tumorigenicidade de CSCs (Figura 4E e F). Além disso, o silenciamento de Suz-12 poderia diminuir significativamente o IC

50 valor do DTX na CSCs (Figura 4G). Assim, silenciamento de Suz-12 pode simular os efeitos de miR-200b no crescimento CSCs e chemoresistance, sugerindo que Suz-12 estava envolvido na regulação da CSCs induzidas por miR-200b.

(A) A proteína nível de Suz-12 em células LAD docetaxel-resistentes após transfecção com os vectores de RNA SH-indicadas (SH-ARN-Suz12 # 1, SH-ARN-Suz12 # 2, 3 e SH-ARN-Suz12 #). (B) Mammosphere capacidade de formação de células LAD docetaxel-resistente (1000 células) após a transfecção dos vectores indicados. (C) A citometria de fluxo análise da percentagem de CD133

+ /CD326

+ CSCs como analisadas por em células LAD docetaxel resistente após transfecção dos vetores indicados. (D) O nível de proteína de Suz-12 em CSCs após transfecção com o sh-RNA-control ou sh-RNA-Suz12 # 3 vetores. (E) CCK-8 análise da viabilidade celular das CSCs transfectados com os vectores indicados no momento indicado. (F) Efeito de Suz-12 inibição em

in vivo

tumorigenicidade das CSCs de células /DTX SPC-A1. (G) Efeito da inibição Suz-12 na chemoresistance de CSCs. A viabilidade celular foi medida por ensaio de CCK-8. GAPDH foi usada como um controlo interno. Os dados foram apresentados como a média ± DP de pelo menos três experiências independentes. *

p Art 0,05, **

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. 0,01

Para confirmar ainda que Suz-12 era um alvo funcional de miR-200b em a regulamentação dos CSCs, pcDNA /Suz-12 ou pcDNA /controle foi transfectado em CSCs (SPC-A1 /DTX) estavelmente transfectadas com pcDNA /miR-200b ou pcDNA /miR-NC. 48 h após a transfecção, o ensaio de bots de Western foi realizada para detectar a expressão de proteína Suz-12, e que mostrou que pcDNA /Suz-12 poderia reverter a diminuição da expressão de Suz-12 em CSCs das células /DTX SPC-A1 induzidas por miR -200b regulação positiva (Figura 5A). Enquanto isso, a superexpressão de Suz-12 não só poderia reverter a percentagem diminuiu de CD133

+ /CD326

+ crescimento CSCs e mammosphere capacidade de formação, mas também inverter a capacidade de crescimento diminuiu e IC

50 valor de docetaxel em os CSCs das células /DTX SPC-A1 induzidas por miR-200b regulação positiva (Figura 5B-E). Assim, superexpressão de Suz-12 poderia reverter os efeitos da regulação positiva miR-200b sobre a regulamentação das CSCs, sugerindo que Suz-12 era um alvo funcional de miR-200b na regulação dos CSCs das células LAD docetaxel-resistente.

(A) O nível de proteína de Suz-12 em CSCs de células /DTX SPC-A1 transfectados com os vectores indicados. GAPDH foi usada como um controlo interno. (B) A citometria de fluxo análise da percentagem de CD133

+ /CD326

+ CSCs em células /DTX SPC-A1 após a transfecção dos vetores indicados. (C) Mammosphere capacidade de formação de células /DTX SPC-A1 (1000 células) após a transfecção dos vectores indicados. **

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p Art 0,05.